酶蛋白的化學(xué)修飾

關(guān)于酶蛋白的化學(xué)修飾12概述酶分子修飾：通過各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些的特性和功能的技術(shù)過程。作用：提高酶的活力；增強酶的穩(wěn)定性；降低或消除酶的抗原性；研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響。方法：酶分子的主鏈修飾、側(cè)鏈基團修飾、組成單位置換修飾、金屬離子置換修飾、物理修飾等。第2頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3第一節(jié)酶的化學(xué)修飾從廣義上來說，凡通過化學(xué)基團的引入或除去使酶的共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，都稱為酶的化學(xué)修飾影響酶蛋白化學(xué)修飾反應(yīng)進程的因素主要有兩個：1.酶蛋白功能基的反應(yīng)性；2.修飾劑的反應(yīng)性。影響酶蛋白功能基反應(yīng)性的因素1.微區(qū)的極性2.氫鍵效應(yīng)3.靜電效應(yīng)4.位阻效應(yīng)蛋白質(zhì)功能基的超反應(yīng)性：蛋白質(zhì)的某個側(cè)鏈基團與個別試劑能發(fā)生非常迅速的反應(yīng)第3頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4影響超反應(yīng)性的因素改變蛋白質(zhì)功能基的pK值蛋白質(zhì)功能基具有較大的親核性通過靜電相互作用吸引試劑，并使其有適當(dāng)取向試劑與靠近修飾部位的蛋白質(zhì)區(qū)域之間的立體化學(xué)適應(yīng)性試劑的結(jié)合等第4頁,共77頁，2024年2月25日，星期天5二、修飾劑反應(yīng)性的決定因素選擇吸附修飾劑根據(jù)各自的特點選擇性地吸附在低或高極性區(qū)靜電相互作用帶電的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質(zhì)表面帶相反電荷的部位位阻因素蛋白質(zhì)表面的位阻因素或者底物、輔因子、抑制劑所產(chǎn)生的位阻因素都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應(yīng)催化因素修飾部位的其他功能基如果起一般的酸堿催化作用，也能影響修飾反應(yīng)局部環(huán)境的極性有些有機反應(yīng)的速度與溶劑的極性有關(guān)第5頁,共77頁，2024年2月25日，星期天6酶化學(xué)修飾的局限性某種修飾劑對某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對的，很少有對某一氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)墙^對專一的化學(xué)修飾劑化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，這種構(gòu)象的變化將妨礙對修飾結(jié)果的解釋酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進行，但是X-射線衍射結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，其他氨基酸側(cè)鏈在維持酶的空間構(gòu)象方面也有重要作用，而且從種屬差異的比較分析，它們在進化中是比較保守的。目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究這些氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用酶化學(xué)修飾的結(jié)果對于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸被修飾后，酶活力完全喪失，說明該殘基是酶活性“必需”的，為什么是必需的，還得用X-射線和其他方法來確定，因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性第6頁,共77頁，2024年2月25日，星期天7第二節(jié)酶分子的主鏈修飾利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。作用：提高酶的催化活性降低或消除酶的抗原性確認(rèn)酶活性中心在主鏈上的位置了解主鏈的不同位置對酶的催化功能的貢獻第7頁,共77頁，2024年2月25日，星期天8一、主鏈的切斷修飾酶分子的主鏈包括肽鏈和核苷酸鏈，主鏈被切斷后，可能出現(xiàn)下列三種情況：酶活性中心被破壞，喪失催化功能，用于探測酶活性中心的位置仍維持酶活性中心的空間構(gòu)象，保持催化功能，但抗原性等特性發(fā)生改變，可以提高某些酶（尤其是藥用酶）的使用價值。

例如：肽鏈有限水解修飾：采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑阜肿拥碾逆溤谔囟ǖ奈稽c斷裂，其分子質(zhì)量減少，可以在基本保持酶活力的同時使酶的抗原性降低或消失。有利于酶活性中心的形成，可使酶分子顯示其催化功能或使酶活力提高。

例如：生物合成的不顯示催化活性的酶原，經(jīng)過適當(dāng)?shù)男揎棧梢赞D(zhuǎn)化為具有催化活性的酶主鏈的切斷修飾通常使用某些專一性較高的酶作為修飾劑，也可采用其它方法使酶的主鏈部分水解。第8頁,共77頁，2024年2月25日，星期天9二、主鏈的連接修飾將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個酶分子具有兩種或者多種催化活性的修飾方法在一個酶分子上具有兩種或者多種催化活性的酶稱為多酶融合體多酶融合體往往是基因融合的產(chǎn)物，通過基因融合技術(shù)將兩種或兩種以上的酶的基因融合在一起形成融合基因，再經(jīng)過克隆和表達，有可能獲得各種多酶融合體第9頁,共77頁，2024年2月25日，星期天10第三節(jié)酶的側(cè)鏈基團修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)方法）使酶的側(cè)鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法作用：酶學(xué)方面：研究酶分子的結(jié)構(gòu)和功能，如：了解酶分子的構(gòu)象，研究各種基團在酶分子中的作用及其對酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響，研究酶的活性中心中的必需基團，測定某一種基團在酶分子中的數(shù)量酶工程方面：提高酶的活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性，引起酶催化特性和催化功能的改變，提高酶的使用價值，還可能獲得自然界原來不存在的新酶種第10頁,共77頁，2024年2月25日，星期天11側(cè)鏈基團修飾方法酶有蛋白類酶和核酸類酶兩大類，它們的側(cè)鏈基團不同，修飾方法也有所區(qū)別。酶蛋白的側(cè)鏈基團是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團，酶RNA的側(cè)鏈基團是指組成RNA的核苷酸殘基上的功能團。酶的側(cè)鏈基團修飾方法很多，主要有：氨基修飾、羧基修飾、巰基修飾、胍基修飾、酚基修飾、咪唑基修飾、吲哚基修飾、分子內(nèi)交聯(lián)修飾、大分子結(jié)合修飾等。第11頁,共77頁，2024年2月25日，星期天12一、氨基修飾采用某些化合物使酶分子側(cè)鏈上的的氨基發(fā)生改變、從而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法凡能夠作用于酶分子側(cè)鏈上的氨基，產(chǎn)生脫氨基作用或與氨基共價結(jié)合將氨基屏蔽起來的化合物，稱為氨基修飾劑。如：亞硝酸、2，4-二硝基氟苯（DNFB）、丹磺酰氯（DNS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、苯異硫氰酸酯（PITC）、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯、O-甲基異脲、順丁烯二酸酐等。第12頁,共77頁，2024年2月25日，星期天13第13頁,共77頁，2024年2月25日，星期天14二、羧基修飾采用各種羧基修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈的羧基進行酯化、?；确磻?yīng)，使蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變的方法可與蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的羧基發(fā)生反應(yīng)的化合稱為羧基修飾劑。如：碳化二亞胺、重氮基乙酸鹽、乙醇-鹽酸試劑、異噁唑鹽等第14頁,共77頁，2024年2月25日，星期天15第15頁,共77頁，2024年2月25日，星期天16三、巰基修飾采用巰基修飾劑與酶蛋白中半胱氨酸殘基側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變、從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能的修飾方法。巰基在許多酶中是活性中心的催化基團，親核性很強，是酶分子中最容易反應(yīng)的基團之一，對穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)和發(fā)揮催化功能有重要作用。通過巰基修飾，可顯著提高酶的穩(wěn)定性。常用的巰基修飾劑有：酰化劑、烷基化劑（如碘乙酸等）、馬來酰亞胺、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉。第16頁,共77頁，2024年2月25日，星期天17第17頁,共77頁，2024年2月25日，星期天18第18頁,共77頁，2024年2月25日，星期天19四、胍基修飾采用二羰基化合物與精氨酸殘基側(cè)鏈上的胍基反應(yīng)生成穩(wěn)定的雜環(huán)，從而改變酶分子的空間構(gòu)象的修飾方法。用作胍基修飾劑的二羰基化合物主要有：丁二酮1，2-環(huán)己二酮丙二酮苯乙二醛4－羥基－3－硝基苯乙二醛對硝基苯乙二醛第19頁,共77頁，2024年2月25日，星期天20第20頁,共77頁，2024年2月25日，星期天21五、酚基修飾通過修飾劑使酪氨酸殘基上的酚基發(fā)生改變，從而改變酶分子的空間構(gòu)象的修飾方法?？梢愿淖兠傅哪承﹦恿W(xué)特性、提高酶的催化活性、增強酶的穩(wěn)定性。包括酚羥基的修飾和苯環(huán)上的取代修飾，主要有碘化法、硝化法、琥珀?；ǖ龋渲兴南趸淄椋═NM）可以高度專一地對酚羥基進行修飾。第21頁,共77頁，2024年2月25日，星期天22第22頁,共77頁，2024年2月25日，星期天23六、咪唑基修飾通過修飾劑與組氨酸殘基上的咪唑基反應(yīng)，使酶分子中的組氨酸殘基發(fā)生改變，從而改變酶分子的空間構(gòu)象的修飾方法常用的咪唑基修飾劑有：碘乙酸：在近中性pH下對組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應(yīng)和定量。焦碳酸二乙酯等碘乙酸和焦碳酸二乙酯都能修飾咪唑環(huán)上的兩個氮原子，碘乙酸修飾時，有可能將N1取代和N3取代的衍生物分開，觀察修飾不同氮原子對酶活性的影響第23頁,共77頁，2024年2月25日，星期天24第24頁,共77頁，2024年2月25日，星期天25七、吲哚基修飾通過改變色氨酸殘基上的吲哚基，從而改變酶分子的空間構(gòu)象和特性的修飾方法。色氨酸殘基疏水性較強，通常位于酶分子的內(nèi)部，而且比較不活潑，反應(yīng)性較差。N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）可以對吲哚基進行修飾，但也可以與酪氨酸反應(yīng)產(chǎn)生干擾。2-羥基-5-硝基芐溴（HNBB）和4-硝基苯硫氯可以比較專一地對吲哚基進行修飾，但也可以與巰基反應(yīng)，因此用于吲哚基修飾時，要對巰基進行保護。第25頁,共77頁，2024年2月25日，星期天26第26頁,共77頁，2024年2月25日，星期天27八、分子內(nèi)交聯(lián)修飾含有雙功能基團的化合物（即雙功能試劑），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團之間形成共價交聯(lián)，使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定，從而提高酶的穩(wěn)定性根據(jù)雙功能試劑的功能基團的特點，可以分為兩端具有相同的功能基團的同型雙功能基團化合物兩端所含的功能基團不相同的異型雙功能基團化合物，可以與酶分子上不同的側(cè)鏈基團反應(yīng)，如一端與氨基作用，一端與巰基或羧基作用等交聯(lián)劑種類繁多，不同的交聯(lián)劑具有不同的分子長度，其交聯(lián)基團、交聯(lián)速度和交聯(lián)效果與各不相同，需通過實驗選擇適宜的交聯(lián)劑進行分子內(nèi)交聯(lián)修飾第27頁,共77頁，2024年2月25日，星期天28第28頁,共77頁，2024年2月25日，星期天29九、大分子結(jié)合修飾采用水溶性大分子與酶蛋白的側(cè)鏈基才共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性和功能的方法，是目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法。采用的修飾劑是水溶性大分子，如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等，在使用前一般需要經(jīng)過活化。作用：提高酶活力、增強酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性。第29頁,共77頁，2024年2月25日，星期天30十、親和修飾又名專一位點修飾，是指修飾劑只專一地與酶分子某一個位點上的某一個基團發(fā)生反應(yīng)，而與此位點以外的同一種或不同種基團都不發(fā)生作用的修飾方法。為對某一個特定位點的基團進行選擇性的修飾，根據(jù)酶的底物結(jié)構(gòu)特點和酶的催化機制，研究開發(fā)了親和試劑。親和試劑又稱為親和標(biāo)記試劑，具有與酶作用底物相類似的結(jié)構(gòu)，可以專一性地與酶的活性部位結(jié)合，而引起酶活性的不可逆抑制，故又稱為專一性不可逆抑制劑。結(jié)合型（Ks型）不可逆抑制劑催化型（Kcat型）不可逆抑制劑第30頁,共77頁，2024年2月25日，星期天31第31頁,共77頁，2024年2月25日，星期天32第32頁,共77頁，2024年2月25日，星期天33第33頁,共77頁，2024年2月25日，星期天34第四節(jié)酶的組成單位置換修飾酶分子的基本組成單位包括氨基酸和核苷酸，是酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。酶分子組成單位的改變將引起酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能。酶蛋白的基本組成單位是氨基酸，將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸的修飾方法，稱為氨基酸置換修飾。酶RNA的基本組成單位是核苷酸，將酶分子核苷酸鏈上的某一個核苷酸換成另一個核苷酸的修飾方法，稱為核苷酸置換修飾。第34頁,共77頁，2024年2月25日，星期天35一、組成單位置換修飾的作用

提高酶活力增強酶的穩(wěn)定性使酶的專一性發(fā)生改變二、定點突變技術(shù)定點突變（sitedirectedmutagenesis）是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來，常用于蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾。第35頁,共77頁，2024年2月25日，星期天36定點突變技術(shù)用于酶分子修飾的過程新的酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計突變基因堿基序列的確定突變基因的獲得根據(jù)設(shè)計，用DNA合成儀合成有1-2個堿基被置換了的寡核苷酸，再以此為引物通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或M13質(zhì)粒等定位突變技術(shù)獲得所需的大量突變基因。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR（polymerasechainreaction）技術(shù)，是一種DNA擴增技術(shù)，其基本過程包括：雙鏈DNA的熱變性（解鏈），引物與單鏈DNA的退火結(jié)合，引物的延伸等3個步驟。新酶的獲得第36頁,共77頁，2024年2月25日，星期天37金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的功能和特性發(fā)生改變的修飾方法作用：了解各種金屬離子在酶催化過程中的作用，有利于闡述酶的催化作用機制，并可能提高酶活力，增強酶的穩(wěn)定性，甚至改變酶的某些動力學(xué)性質(zhì)。第37頁,共77頁，2024年2月25日，星期天381.提高酶活力例如，α-淀粉酶分子中大多數(shù)含有鈣離子，有些則含有鎂離子或鋅離子等其他離子，所以一般的α-淀粉酶是雜離子型的。如果將其他雜離子都換成鈣離子，則可以提高酶活力并顯著增強酶的穩(wěn)定性。結(jié)晶的鈣型α-淀粉酶的活力比一般結(jié)晶的雜離子型α-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且穩(wěn)定性大大增加。再如，將鋅型蛋白酶的鋅離子除去，添加一定量的鈣離子，置換成鈣型蛋白酶，其活力可以提高20-30%。2.增強酶的穩(wěn)定性例如，鐵型超氧化物歧化酶(Fe-SOD)分子中的鐵離子被錳離子置換，成為錳型超氧化物歧化酶(Mn-SOD)后，其對過氧化氫的穩(wěn)定性顯著增強，對疊氮鈉(NaN3)的敏感性顯著降低。3.改變酶的動力學(xué)特性例如，酰基化氨基酸水解酶的活性中心含有鋅離子，用鈷離子置換后，其催化N-氯-乙酰丙氨酸水解的最適pH值從8.5降低為7.0，同時該酶對N-氯-乙酰蛋氨酸的米氏常數(shù)Km增大，親和力降低。第38頁,共77頁，2024年2月25日，星期天39金屬離子修飾的過程：在經(jīng)過分離純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。用一定量的另一種金屬離子加到酶液中酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。第39頁,共77頁，2024年2月25日，星期天40第五節(jié)酶分子的物理修飾通過各種物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法稱為酶分子的物理修飾。第40頁,共77頁，2024年2月25日，星期天41物理修飾的作用了解在不同物理條件下，特別是在高溫、高壓、高鹽、低溫、真空、失重、極端pH值、有毒環(huán)境等極端條件下，由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起的酶的特性和功能的變化情況。極端條件下酶催化特性的研究對于探索太空、深海、地殼深處以及其他極端環(huán)境中，生物的生存可能性及其潛力有重要的意義。有可能獲得在通常條件下無法得到的各種酶的催化產(chǎn)物。酶分子的物理修飾同樣可能提高酶的催化活性、增強酶的穩(wěn)定性，或者改變酶的催化動力學(xué)特性。第41頁,共77頁，2024年2月25日，星期天42酶分子物理修飾的特點1.不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變。例如，羧肽酶γ經(jīng)過高壓處理，底物特異性發(fā)生改變，其水解能力降低，而有利于催化多肽合成反應(yīng)；用高壓方法處理纖維素酶，該酶的最適溫度有所降低，在30－40℃的條件下，高壓修飾的纖維素酶比天然酶的活力提高10%。第42頁,共77頁，2024年2月25日，星期天43酶分子物理修飾的特點2.在某些變性劑的作用下，首先使酶分子原有的空間構(gòu)象破壞，然后在不同的物理條件下，使酶分子重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象。例如，先用鹽酸胍使胰蛋白酶的原有空間構(gòu)象破壞，通過透析除去變性劑后，再在不同的溫度條件下，使酶重新構(gòu)建新的空間構(gòu)象。結(jié)果表明，20℃的條件下重新構(gòu)建的胰蛋白酶與天然胰蛋白酶的穩(wěn)定性基本相同，而在50℃的條件下，重新構(gòu)建的胰蛋白酶的穩(wěn)定性比天然酶提高5倍第43頁,共77頁，2024年2月25日，星期天44

第六節(jié)酶分子修飾的應(yīng)用在酶學(xué)研究方面的應(yīng)用1.酶的活性中心研究2.酶的空間結(jié)構(gòu)研究（1）采用具有熒光特性的修飾劑對酶分子的側(cè)鏈基團進行修飾，借助熒光光譜研究，可以分子各基團在酶分子中的空間分布情況，了解在溶液中酶分子的空間構(gòu)象。（2）采用巰基修飾劑進行修飾，可以了解酶分子中半胱氨酸的數(shù)目及其分布情況，確定肽鏈的數(shù)目和二硫鍵的數(shù)目。第44頁,共77頁，2024年2月25日，星期天453.酶的作用機制研究通過酶分子修飾作用，可以了解各種殘基及其側(cè)鏈基團在催化過程中的作用。研究酶的作用機制常用的修飾方法：（1）親和標(biāo)記法（2）差別標(biāo)記法（3）氨基酸置換法（4）核苷酸置換修飾第45頁,共77頁，2024年2月25日，星期天46（1）親和標(biāo)記法通過親和標(biāo)記試劑對酶分子進行修飾的方法稱為親和標(biāo)記法。與酶分子的某一特定部位（通常是酶的活性部位）有特異的親和力，可以與這個特殊部位結(jié)合而進行酶分子修飾的試劑稱為親和標(biāo)記試劑。第46頁,共77頁，2024年2月25日，星期天47（2）差別標(biāo)記法在酶的作用底物或競爭性抑制劑存在的條件下，對酶分子進行修飾，由于底物或競爭性抑制劑對酶分子活性中心上的結(jié)合基團有保護作用，使之不被修飾；然后除去底物或競爭性抑制劑，再用帶有放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記的修飾劑進行修飾，則原來受到底物或競爭性抑制劑保護的基團帶上放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記，經(jīng)過檢測，可以知道活性中心上的結(jié)合基團。第47頁,共77頁，2024年2月25日，星期天48（3）氨基酸置換法通過定點突變技術(shù)或化學(xué)方法，將酶蛋白分子中的某個氨基酸殘基置換為另一種氨基酸殘基，觀察其對酶催化反應(yīng)的影響和變化，從而分析、了解該氨基酸殘基在酶催化過程中的作用。第48頁,共77頁，2024年2月25日，星期天49（4）核苷酸置換修飾通過定點突變技術(shù)，將酶RNA分子中的某個核苷酸殘基置換為另一個核苷酸殘基，觀察其對酶催化反應(yīng)的影響和變化，從而分析、了解該核苷酸殘基在酶催化過程中的作用。第49頁,共77頁，2024年2月25日，星期天50二、在醫(yī)藥方面的應(yīng)用1.降低或者消除酶抗原性例如：（1）具有抗癌作用的精氨酸酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾，其抗原性被消除；（2）對白血病有顯著療效的L-天冬酰胺酶經(jīng)聚乙二醇結(jié)合修飾后，使抗原性顯著降低甚至消除。第50頁,共77頁，2024年2月25日，星期天512.增強醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性（1）溶菌酶經(jīng)過氨基酸置換修飾，分子中第3位的異亮氨酸置換成半胱氨酸后，可以與第97位的半胱氨酸形成二硫鍵，修飾后的T4-溶菌酶活力保持不變，但對熱的穩(wěn)定性卻大大提高。用O-甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中的賴氨酸殘基上的ε-氨基與它結(jié)合，將氨基屏蔽起來，修飾后酶的穩(wěn)定性顯著增強。（2）有抗氧化、抗輻射、抗衰老功能的超氧化物歧化酶，經(jīng)過大分子結(jié)合修飾，形成聚乙二醇-超氧化物歧化酶，其穩(wěn)定性顯著提高，在血漿中的半衰期可以延長350倍。（3）對青霉素酰化酶采用葡聚糖二乙醛進行分子內(nèi)交聯(lián)修飾后，在55℃條件下的半衰期延長9倍，而其最大反應(yīng)速度不改變。（4）用亞硝酸修飾L-天冬酰胺酶，使其氨基變成羥基，酶的穩(wěn)定性大大提高，在體內(nèi)的半衰期延長2倍。第51頁,共77頁，2024年2月25日，星期天52三、在工業(yè)方面的應(yīng)用1.提高工業(yè)用酶的活力(1)胰蛋白酶經(jīng)大分子結(jié)合修飾后，活力提高5.1倍(2)淀粉酶通過金屬離子置換修飾，置換為鈣型后，活力提高3倍以上(3)鋅型蛋白酶中的鋅置換成鈣型蛋白酶后，活力提高20%-30%第52頁,共77頁，2024年2月25日，星期天53三、在工業(yè)方面的應(yīng)用2.增強工業(yè)用酶的穩(wěn)定性(1)木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶等經(jīng)大分子結(jié)合修飾，穩(wěn)定性均顯著提高(2)胰蛋白酶在不同溫度下重新構(gòu)建后，穩(wěn)定性提高5倍3.改變酶的動力學(xué)特性如葡萄糖異構(gòu)酶經(jīng)琥珀?；揎椇?，最適pH值下降.5，并增強穩(wěn)定性，有利于果葡糖漿和果糖的生產(chǎn)。第53頁,共77頁，2024年2月25日，星期天54四、在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用抗體酶(abzyme)又稱為催化性抗體(catalyticantibody)，是一類具有催化功能的抗體。抗體酶可以通過誘導(dǎo)法或修飾法產(chǎn)生。誘導(dǎo)法是在免疫系統(tǒng)中采用半抗原或酶抗原進行誘導(dǎo)而產(chǎn)生。修飾法是將抗體進行分子修飾，在抗體和抗原的結(jié)合部位引進催化基團，而成為具有催化活性的抗體酶。第54頁,共77頁，2024年2月25日，星期天55四、在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用修飾法產(chǎn)生抗體酶的方法氨基酸置換修飾：采用定點突變技術(shù)，將抗體與抗原結(jié)合部位的某個氨基酸殘基置換成另一個氨基酸殘基，從而使抗體分子具有催化活性。側(cè)鏈基團修飾：將抗體和抗原結(jié)合部位上的某個基團進行修飾，從而使抗體具有催化活性。第55頁,共77頁，2024年2月25日，星期天56五、在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用

核酸類酶(ribozyme)的結(jié)構(gòu)由催化結(jié)構(gòu)域和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域兩部分組成，除了保守核苷酸以外，其它的核苷酸都可以進行修飾。采用核苷酸置換修飾，將保守核苷酸以外的某個或某些核苷酸置換，就可以獲得各種不同的人造核酸類酶。對某些核苷酸殘基進行修飾，連接上氨基酸等有機化合物，就可能擴展核酸類酶的結(jié)構(gòu)多樣性，從而擴展其催化功能，提高酶的催化活力。第56頁,共77頁，2024年2月25日，星期天57五、在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用具有催化能力的單鏈DNA分子稱為脫氧核酸類酶(deoxyribozyme)單鏈DNA分子與RNA分子的主要區(qū)別有兩點：RNA分子中含有尿嘧啶，而DNA分子中含有胸腺嘧啶；RNA分子中含有2’-OH，而DNA分子中沒有。如果采用核苷酸置換修飾，通過定位突變技術(shù)將RNA分子中的尿苷酸置換為胸苷酸，再采用側(cè)鏈基團修飾，脫去RNA分子中的2’-OH，則核酸類酶可能成為脫氧核酸類酶如果通過側(cè)鏈基團修飾，將一部分2’-OH去除，就可以獲得含有一部分脫氧核苷酸的核酸類酶，有可能使其穩(wěn)定性得到提高。第57頁,共77頁，2024年2月25日，星期天58六、在有機介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用

由于酶粉一般不溶于有機溶劑，難以均勻分布，致使酶在有機介質(zhì)中的催化效率降低。若對酶分子進行側(cè)鏈基團修飾，使酶分子表面的基團增強疏水性，就可能使酶溶于有機溶劑，均勻在溶劑中，以提高酶的催化效率和穩(wěn)定性。例如：采用單甲氧基聚乙二醇對脂肪酶、過氧化氫酶、過氧化物酶等酶分子表面的氨基進行共價結(jié)合修飾，可使酶均一地溶于苯和氯仿等有機溶劑，并具有較高的催化活性和穩(wěn)定性。第58頁,共77頁，2024年2月25日，星期天59第59頁,共77頁，2024年2月25日，星期天60脂肪酶改性對其在有機相中催化特性的影響

很多化合物都有立體異構(gòu)體，由于同種藥物(包括農(nóng)藥、獸藥)的左旋與右旋異構(gòu)體的生理活性多有不同，其藥效甚至相反，因此，人們對光學(xué)純藥物的研制越來越重視。其中，有機相體系酶催化技術(shù)對光學(xué)活性化臺物的制備越顯重要。至今約有20種酶（包括脂肪酶、蛋白酶、羧酯酶、乙醇脫氫酶)在此領(lǐng)域中得到應(yīng)用。其中脂肪酶價格便宜，能催化多種反應(yīng)，并具備固有的界面催化能力．第60頁,共77頁，2024年2月25日，星期天61盡管在有機相體系中酶催化不對稱合成有著眾多的優(yōu)點，但它也有一個致命的缺點．即在有機溶劑中不易分散，因而催化效率較低．本文將就通過酶的修飾、酶的印跡、酶的純化方式與預(yù)處理過程、酶的固定化，以提高酶的催化效率與立體選擇性方面，對脂肪酶改性及其在有機相中的催化特性之影響作一綜述．第61頁,共77頁，2024年2月25日，星期天621.脂肪酶的修飾為克服酶在有機溶劑中的聚集作用．學(xué)者們想到了將酶作恰當(dāng)修飾．使之能很好地分散于疏水溶劑中．目前已有的方法包括脂包被、表面活性劑包被與修飾、聚合物修飾、脫氧膽酸鹽等非共價修飾四種．第一種方法是用脂包被修飾酶Okahata等合成了一種脂類分子，結(jié)構(gòu)式如下：第62頁,共77頁，2024年2月25日，星期天63該分子有一個親水的頭部和一個疏水的尾部，它既可與酶分子結(jié)合，又可與有機溶劑結(jié)臺根據(jù)酶的不同分子量，大約150－250分子的脂與一分子的脂肪酶形成復(fù)合體．該復(fù)合體催化各種醇與酸的酯化反應(yīng)時的對映體選擇性不同，如催化1一苯乙醇與十二烷酸的酯化反應(yīng)的E（enantioselectivity)值為250，而催化2-壬醇與丁酸的酯化反應(yīng)的E值僅為24．第63頁,共77頁，2024年2月25日，星期天64脂包被的脂肪酶已受到人們的日益重視．Okahata等系統(tǒng)地研究了不同來源的脂肪酶，不同類型的脂(非離子型、陽離子型，陰離子型、兼性離子型)，以及系統(tǒng)中含水量和底物對脂肪酶催化特性的影響，得出了如下結(jié)論．①非離子型頭部的脂包被的酶催化反應(yīng)速率高，酶脂復(fù)合物產(chǎn)量也高②在一定范圍內(nèi)，脂－酶復(fù)合物中脂／酶比值越高．該復(fù)合物產(chǎn)量越高．酶活性越低．Goto得到了量化結(jié)果，即該比值達40時，反應(yīng)速率最高．第64頁,共77頁，2024年2月25日，星期天65③脂－酶復(fù)合物在非鹵化的非極性溶劑中(如二異丙基醚．苯)酶活較高；在鹵化的非極性溶劑中(如氯仿，二氯甲烷)復(fù)合物能溶解，但無活性：在極性溶劑中(如乙醇)，復(fù)合物不能溶解．也沒有酶活．Goto等比較了10種溶劑，若以異辛烷溶劑中酶的相對活性為l，則另外9種溶劑中酶的相對活性分別為：環(huán)已烷0．8：正十二烷0．7；正辛烷0．4；正已烷0．35；苯0.18；甲苯0．02：乙醇、乙腈與氯仿為0．④有機溶劑中加了分子篩后，10h之內(nèi)，產(chǎn)物即達100%．不加分子篩，產(chǎn)物的量只能達到70%，2Oh之后再加進分子篩，再過10h后產(chǎn)物又達100%．第65頁,共77頁，2024年2月25日，星期天66表面活性劑包被與修飾是脂肪酶修飾的第二種方法，Goto等得到了與Okahata很相似的結(jié)果(表1)第66頁,共77頁，2024年2月25日，星期天67由表1可知，非離子型表面活性劑與酶結(jié)合后，效果比另外三種類型均好得多．而同為非離子型，疏水結(jié)構(gòu)部分含兩個油酸殘基的比含一個殘基的要優(yōu)越一些。當(dāng)碳原子數(shù)相同時，分子結(jié)構(gòu)中含分支或雙鍵的表面活性劑要比無支鏈、不含雙鍵的優(yōu)越．陰離子型表面活性劑，由于與脂肪酶之間存在巨大斥力而無法形成脂－酶復(fù)合物．第67頁,共77頁，2024年2月25日，星期天68Goto等確立了表面活性劑包被酶的制備方法，并發(fā)現(xiàn)不同來源的脂肪酶經(jīng)表面活性劑包被后，其酶活不同．同一種酶經(jīng)表面活性劑包被與反向膠束處理與分散的酶粉相比．其轉(zhuǎn)化率也不同．Goto等以脂肪酶催化苯甲醇與月桂酸的酯化反應(yīng)為模型，研究了表面活性劑包被的脂肪酶催化反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)機理符合乒乓雙雙機理．動力學(xué)測定發(fā)現(xiàn)，表面活性劑包被的脂肪酶比未包被的酶粉，反應(yīng)速率提高了100倍之多．Goto等認(rèn)為，在均相有機介質(zhì)中對表面活性劑包被的脂肪酶進行動力學(xué)研究也可用以預(yù)測并解釋酶的專一性。這彌補了脂肪酶因難以制成晶體而較難利用X－射線結(jié)晶法研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的缺陷．第68頁,共77頁，2024年2月25日，星期天69Tsuzuki等發(fā)現(xiàn),用人工合成的去污劑修飾的脂肪酶可用于催化糖脂的合成．修飾酶有效地解決了酶在有機溶劑中不穩(wěn)定的問題．該文第一次報道修飾過的脂肪酶能在有機溶劑中將糖高效率地轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的糖脂．他們所用的去污劑是雙十二烷基葡糖基谷氨酸．第69頁,共77頁，2024年2月25日，星期天70第四種方法是非共價修飾．Wu等發(fā)現(xiàn)用脫氧膽酸鈉與醚－醇有機溶劑（1：1．V／V)處理后．CCL構(gòu)象打開，并重新折迭而形成更穩(wěn)定的構(gòu)象．稱之為A型CCL．用SP-ScphadexG-50層析純化的酶被稱為B型CCL．A型CCL與B型CCL在化學(xué)結(jié)構(gòu)上完全相同．物理性質(zhì)(圓盤電泳、SDS電泳、CD譜、UV譜)也相同，唯一不同的是其對映體選擇性．他們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CCL水解芳基丙酸酯與苯氧基丙酸酯時．粗酶及B型酶的E值僅為10，而A型酶的E值>100．進一步研究發(fā)現(xiàn)，A型酶之所以對映體選擇性顯著升高，是由于酶蛋白分子非共價修飾造成的．第70頁,共77頁，2024年2月25日，星期天712.酶分子的生物印跡Russell等提出了生物印跡的修飾方法．此法的基本過程為：將酶溶于含有其配體(通常為其底物或底