米非司酮對子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌抗腫瘤作用相關(guān)機制的研究

米非司酮對子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌抗腫瘤作用相關(guān)機制的研究研究目的本課題通過研究米非司酮對子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌的抗腫瘤作用及其相關(guān)分子機制,為開拓新的治療策略提供理論依據(jù)。子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤,近年來發(fā)病均呈年輕化趨勢。目前子宮內(nèi)膜癌的治療難點在于期望保留生育功能或者高齡無法耐受手術(shù)及化療耐藥患者的臨床治療。早期子宮頸癌患者及時接受手術(shù)等治療,能獲得較好的預后,然而中晚期子宮頸癌患者失去手術(shù)機會,放療不敏感及化療耐藥仍是治療失敗和預后不良的主要原因。研究子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制,可以改善這兩種惡性腫瘤的預防,診斷和治療現(xiàn)狀。米非司酮是一種孕激素和糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑,目前用于終止妊娠的有效性和安全性己得到肯定,對米非司酮終止妊娠的作用機制已研究到分子和基因水平。有研究證實,米非司酮在細胞新陳代謝中通過對細胞因子的調(diào)控干擾眾多信號通路,如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路、粘附信號通路、細胞凋亡通路等。近二十年來,有眾多研究發(fā)現(xiàn),妊娠成功的要素即絨毛滋養(yǎng)細胞的增殖、遷移和侵襲與腫瘤細胞的特性有驚人的相似。米非司酮的研究早已從終止妊娠延伸到了腫瘤學領(lǐng)域,已有研究發(fā)現(xiàn)米非司酮對腫瘤細胞的增殖和遷移等具有普遍的抑制作用。然而米非司酮抗癌作用的諸多機制至今仍未完全明確。黏著斑激酶(FAK),PI3K/AKT信號通路存在于多種類型的細胞中,并且在細胞的多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡,能夠反映細胞的生理功能狀態(tài),對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、遷徙及轉(zhuǎn)移起到不可忽視的作用。多項研究證實了外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的核心作用。本課題探討米非司酮治療子宮內(nèi)膜癌及子宮頸癌的作用機制,為米非司酮在婦科腫瘤的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。研究分兩部分:1.研究米非司酮通過調(diào)控子宮內(nèi)膜癌HHUA細胞FAK因子和PI3K/AKT信號通路影響子宮內(nèi)膜癌HHUA細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等功能,并探討米非司酮的調(diào)控與其作用濃度的關(guān)系;2.研究米非司酮通過上調(diào)干擾素刺激因子15(ISG15)的表達調(diào)控外泌體分泌影響子宮頸癌HeLa細胞侵襲轉(zhuǎn)移等功能。研究方法1.第一部分:(1)體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌HHUA細胞系,實驗分為給藥組及對照組。對照組為未經(jīng)藥物處理的HHUA細胞。給藥組為分別用濃度25,50,75和100μmol/L米非司酮作用的HHUA細胞。驗證米非司酮處理后的細胞增殖狀態(tài)與PI3K/AKT信號通路的關(guān)聯(lián),米非司酮作用于pcDNA3.1-PI3K及pcDNA3.1-AKT超表達載體共轉(zhuǎn)染的HHUA細胞被定義為米非司酮聯(lián)合PI3K/AKT組。(2)實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測HHUA細胞中的FAK,Caspase-3,PI3K,及AKT等因子mRNA表達水平。(3)蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測FAK,p-FAK,PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,Caspase-3因子蛋白表達水平。(4)MTT法檢測不同濃度米非司酮以及米非司酮聯(lián)合PI3K/AKT對HHUA細胞增殖能力的影響。(5)Transwell法檢測不同濃度米非司酮對HHUA細胞遷移和侵襲能力的影響。(6)流式細胞術(shù)檢測不同濃度米非司酮對HHUA細胞凋亡水平的影響。(7)體內(nèi)裸鼠實驗(米非司酮對HHUA細胞裸鼠移植瘤生長影響的研究)。2.第二部分:(1)體外培養(yǎng)子宮頸癌HeLa細胞系。(2)CCK-8細胞增殖能力實驗檢測米非司酮組和對照組HeLa細胞活力,篩選米非司酮作用的最佳時間和最佳濃度。(3)劃痕試驗檢測各組(米非司酮組、外泌體抑制劑GW4869組、米非司酮聯(lián)合GW4869組、對照組)HeLa細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。(4)流式細胞術(shù)檢測各組(米非司酮組、外泌體抑制劑GW4869組、米非司酮聯(lián)合GW4869組、對照組)HeLa細胞凋亡水平。(5)外泌體的提取。(6)靶向基因芯片技術(shù)篩選出與米非司酮抑制子宮頸癌細胞遷移能力相關(guān)的基因。(7)蛋白質(zhì)印跡方法檢測米非司酮作用的HeLa細胞外泌體相關(guān)蛋白CD63、CD9及干擾素刺激基因15蛋白表達水平。研究結(jié)果1.第一部分(1)米非司酮抑制HHUA細胞的增殖,顯著抑制HHUA細胞遷移和侵襲本課題采用MTT法檢測米非司酮對HHUA細胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示,隨著米非司酮濃度的增加,HHUA細胞的增殖抑制率逐漸上升。當米非司酮作用濃度達到100|μmol/L時,HHUA細胞的增殖抑制率達到最大值,結(jié)果呈現(xiàn)濃度依賴性。同時本課題通過米非司酮對體內(nèi)裸鼠HHUA細胞移植瘤生長影響的實驗進一步檢測米非司酮對體內(nèi)HHUA細胞增殖的影響,結(jié)果顯示米非司酮能抑制腫瘤的生長。本課題通過細胞遷移侵襲實驗(Transwell)檢測米非司酮對HHUA細胞遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示當作用濃度為50-100μmol/L時,米非司酮以濃度依賴的方式顯著抑制HHUA細胞的遷移和侵襲(P<0.01)。(2)米非司酮促進HHUA細胞凋亡本課題采用流式細胞術(shù)檢測米非司酮對HHUA細胞凋亡的影響,結(jié)果顯示米非司酮以濃度依賴的方式促進HHUA細胞凋亡。與對照組(Oμmol/L米非司酮處理)HHUA細胞凋亡百分比相比,25-100μmol/L米非司酮作用后凋亡細胞百分比顯著增加(尸<0.01)。同時,本課題分別采用RT-PCR法和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HHUA細胞中凋亡相關(guān)基因Caspase-3的mRNA和蛋白表達,結(jié)果顯示,濃度為50-100μmol/L的米非司酮作用的HHUA細胞中Caspase-3mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.01)。以上結(jié)果表明,米非司酮隨著作用濃度的增加,對HHUA細胞凋亡的促進作用也相應(yīng)增加。(3)米非司酮抑制HHUA細胞中FAK因子調(diào)控PI3K/AKT信號通路的活性本課題通過RT-PCR法及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測不同濃度米非司酮作用的HHUA細胞中FAK因子的mRNA及蛋白含量以及磷酸化黏著斑激酶(p-FAK)的蛋白含量。結(jié)果顯示當用50-100μmol/L米非司酮處理HHUA細胞時,FAK因子的mRNA和蛋白表達量及p-FAK的蛋白表達量顯著低于對照組(0μmol/L米非司酮處理)的HHUA細胞(P<0.01),米非司酮在此范圍作用濃度下以濃度依賴的方式抑制FAK因子和p-FAK因子的表達。以上結(jié)果表明較高作用濃度的米非司酮可以抑制HHUA細胞中FAK因子的表達及其磷酸化水平。本課題通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測米非司酮組及米非司酮聯(lián)合PI3K/AKT組(米非司酮作用pcDNA3.1-PI3K及pcDNA3.1-AKT過表達載體侵染)HHUA細胞中PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT的蛋白表達,MTT法及流式細胞術(shù)檢測兩組細胞凋亡及增殖的差異,結(jié)果顯示米非司酮聯(lián)合PI3K/AKT組的HHUA細胞中PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT的表達均顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(尸<0.01),而該組HHUA細胞增殖抑制率和細胞凋亡率顯著降低(P<0.01),上述結(jié)果進一步表明米非司酮通過抑制FAK因子調(diào)控PI3K/AKT信號通路活動促進HHUA細胞的凋亡抑制增殖。2.第二部分(1)米非司酮抑制HeLa細胞的生長和遷移,促進細胞凋亡本課題通過CCK-8法檢測米非司酮對子宮頸癌HeLa細胞活力的影響,結(jié)果顯示與對照組(無米非司酮處理)的HeLa細胞相比,作用濃度分別為1、10、50、100、200μg/mL米非司酮處理的HeLa細胞的活力逐漸下降,同時作用濃度達到50μg/mL時,HeLa細胞活力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。用50μg/mL米非司酮分別處理HeLa細胞12、24、36、60小時,HeLa細胞活力逐漸下降,當作用時間達到36小時后,HeLa細胞活力顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(尸<0.01)。說明,米非司酮以濃度及時間依賴的方式抑制HeLa細胞生長。本課題通過流式細胞術(shù),劃痕實驗檢測米非司酮對HeLa細胞遷移及凋亡能力的影響,同時通過蛋白質(zhì)免疫印記法檢測各組細胞的Caspase-3蛋白水平,結(jié)果顯示與對照組相比米非司酮組(500μg/mL米非司酮作用36小時)的HeLa細胞凋亡水平顯著增加(尸<0.01),Caspase-3表達水平顯著升高(尸<0.01),遷移能力降低,說明米非司酮能顯著抑制HeLa細胞的遷徙,促進細胞凋亡。(2)米非司酮抑制子宮頸癌HeLa細胞外泌體分泌成功分離HeLa細胞外泌體后,本課題通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測對照組及米非司酮組HeLa細胞外泌體中外泌體標志蛋白CD63和CD9的表達,結(jié)果顯示米非司酮組的HeLa細胞外泌體中CD63和CD9的表達顯著降低(尸<0.01),表明米非司酮抑制HeLa細胞外泌體的分泌。(3)抑制外泌體分泌可以增強米非司酮對子宮頸癌細胞遷移的抑制作用GW4869是一種外泌體抑制劑,本課題通過CCK-8實驗,流式細胞術(shù),細胞劃痕實驗檢測對照組(無米非司酮作用),米非司酮組(50μg/mL米非司酮作用),GW4869組(GW486910μM作用),米非司酮聯(lián)合GW4869組HeLa細胞的活力,凋亡,遷移能力。結(jié)果顯示,米非司酮聯(lián)合GW4869組的HeLa細胞活力明顯減弱(P<0.01),細胞凋亡顯著增強(P<0.01),遷移能力明顯減弱。說明抑制外泌體分泌可以增強米非司酮對子宮頸癌細胞遷移的抑制作用。(4)米非司酮通過上調(diào)干擾素刺激基因15抑制外泌體分泌為了研究米非司酮抑制子宮頸癌HeLa細胞外泌體分泌的分子機制,本課題首先采用靶向基因芯片法篩選出干擾素刺激因子15(ISG15)在米非司酮作用后的HeLa細胞中呈高富集狀態(tài),用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測HeLa細胞在0,1,10,50,100,200μg/mL米非司酮作用后的HeLa細胞中ISG15的蛋白水平,結(jié)果顯示ISG15的蛋白表達水平隨著米非司酮濃度的升高而升高(P<0.01)。然后本課題采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測對照組(無藥物處理)和IFN組(IFN1000U/ml培養(yǎng)16小時)的HeLa細胞中外泌體標志蛋白CD63,CD9的表達,結(jié)果顯示HeLa細胞在IFN作用下,CD63、CD9的表達顯著降低(P<0.01)。說明米非司酮通過上調(diào)ISG15抑制外泌體分泌。研究結(jié)論1.米非司酮可有效促進子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡,抑制細胞增殖,遷移和侵襲。而米非司酮對HHUA細胞增殖,遷移,凋亡的影響呈現(xiàn)濃度依賴的現(xiàn)象,其分子機制可能是通過抑制FAK因子調(diào)控P