配子和胚胎的冷凍及復(fù)蘇規(guī)范

關(guān)于配子和胚胎的冷凍及復(fù)蘇規(guī)范冷凍是保存組織和細胞重要方法

（低溫醫(yī)學(xué)）體外培養(yǎng)1年干冰－79℃數(shù)月液氮－196℃永久保存分子運動，生理生化反應(yīng)停止，任何損傷也無法修復(fù)自發(fā)突變率1％第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天一、冷凍對細胞的損傷

(37℃－196℃)

冷凍危險區(qū)（-15℃—-50℃）冰晶形成溶液效應(yīng)滲性休克保護劑毒性寒冷第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天冰晶形成特點有結(jié)構(gòu)六角形晶體只與水分子結(jié)合，排除其它溶質(zhì)先形成冰核，同質(zhì)成核－35℃－40℃，異質(zhì)成核－10℃－15℃（過冷）一旦冰核形成，冰晶迅速增大密度變小，體積增大第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.冰晶形成及對細胞的損傷體積增大產(chǎn)生壓力，冰晶穿孔胞漿滲漏細胞內(nèi)物質(zhì)分布改變結(jié)晶只與水分子結(jié)合，排斥其它任何溶質(zhì)，隨著冰晶的增大，像犁一樣將細胞的其它成分擠在狹小的空間，細胞內(nèi)間隙縮小，細胞內(nèi)成分相互接觸，發(fā)生不正常反應(yīng)溶質(zhì)濃度上升，結(jié)晶析出，PH變化，蛋白質(zhì)可溶性降低，有害物質(zhì)濃度升高復(fù)蘇后局部低滲，結(jié)晶的溶質(zhì)不會再溶解復(fù)蘇氣泡形成，冷凍速率快，氣泡多而小，含碳酸鹽嚴重第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2.細胞外溶液效應(yīng)細胞懸浮在溶液中慢速冷凍細胞外液結(jié)冰導(dǎo)致細胞外滲透壓上升是細胞脫水的關(guān)鍵脫水太慢，溶液濃度過高對細胞內(nèi)蛋白有毒性，（脂蛋白變性，細胞達到最小體積以下）第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天0.16M－5MOoo第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.滲性休克復(fù)蘇時細胞外冰融化造成低滲，細胞內(nèi)滲透壓高，細胞外水進入細胞內(nèi)過快，細胞腫脹第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4.滲性保護劑的毒性溶液濃度，暴露時間和溫度越高毒性越大不同種類滲性保護劑毒性的差別種類已二醇甘油二甲亞砜丙二醇已酰胺胚胎發(fā)育能力％988868160第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天5.寒冷對細胞的損傷37℃—0℃寒冷損傷,20℃～0℃細胞膜雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，含水30％～50％,其余為脂蛋白，對寒冷敏感，低溫脂類變硬，脂蛋白分解，變性脂質(zhì)的含量和成分影響細胞對冷凍的耐受性脂質(zhì)含量豐富的牛、豬卵母細胞易受寒冷的損傷，卵磷脂/膽固醇比值大，柔韌性好，耐受冷凍第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二、預(yù)防冷凍損傷的方法冷凍保護劑——滲性，非滲性，大分子控制冷凍和復(fù)蘇的速率－細胞種類，溫度快速去除冷凍保護劑第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（一）冷凍保護劑的種類和作用1.滲性2.非滲性3.大分子第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.滲性保護劑的作用無限降低冰點（1000g水＋1mol溶質(zhì)冰點降低1.86℃，濃度足夠高冰點～共熔點玻璃化而不結(jié)冰）與水形成氫鍵，維持結(jié)合水替換細胞內(nèi)液態(tài)水，細胞失水后體積和溶質(zhì)濃度變化小第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天滲性保護劑的滲透性種類已二醇丙二醇二甲亞楓甘油分子量g/mol62.0776.178.1392.09已二醇分子量小，滲透性好，進出細胞快，毒性低用于玻璃化冷凍第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2.非滲性保護劑的作用不能進入細胞內(nèi)（蔗糖，葡萄糖，果糖，海藻糖）冷凍時有助于細胞脫水復(fù)蘇時防止水分過快進入細胞，預(yù)防滲性休克，促進滲性保護劑外流降低細胞膜損傷第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.大分子物質(zhì)促進玻璃化形成增加細胞膜的穩(wěn)定性減少滲性保護劑毒性，F(xiàn)icoll，PVP，聚丙烯甘油，蛋白質(zhì)第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天（二）影響冷凍速率的因素細胞本身的特性：膜滲透性，表面積/體積比不同溫度冷凍后膜滲透性改變第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.細胞本身的特性不同的細胞膜滲透性，表面積/體積不同，降溫速率不同鼠卵母細胞和胚胎耐受冷凍，豬牛差人囊胚比早期胚胎滲性差，脫水慢鼠胚0.5℃，卵母細胞0.3~1℃,精子10℃，倉鼠細胞100℃，紅細胞>1000℃/min）第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天A鼠胚B紅細胞第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2.溫度對脫水的影響溫度越高，脫水越快，溫度每降10℃，脫水速度減半第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天溫度對脫水的影響

降低10度脫水速率減半第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天降溫快，無冰卵母細胞少，存活少A存活卵母細胞B無冰卵母細胞第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天降溫速率過快細胞膜的滲透性下降，細胞脫水越少，體積變化越少，水分未充分脫出，細胞內(nèi)外大量冰晶形成第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天降溫速率太慢細胞脫水越多，最小體積的理論，永久的損害細胞暴露在高滲環(huán)境時間長（溶液效應(yīng)）脂蛋白變性，細胞溶解第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.冷凍后細胞膜滲透性的改變冷凍改變細胞的滲透性，原來不能通過細胞膜的物質(zhì)冷凍后可透過。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4.解凍的速度太快：胚胎吸收水分過快，過多－滲性休克取出冷凍管在空氣中停留40s太慢：形成細胞內(nèi)結(jié)晶快慢之間界限很窄，細胞內(nèi)重新結(jié)晶開始于－85℃～－70℃，冷凍管在空氣中搖動一定時間當其溫度接近－80，換成快速升溫，置30℃水浴中第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天三、冷凍的方法（凍干技術(shù)）程序，平衡，慢速快速，玻璃化,第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天慢速冷凍前細胞與冷凍保護劑的平衡第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天冰晶與玻璃態(tài)的區(qū)別玻璃化非結(jié)晶，無結(jié)構(gòu)，玻璃樣固態(tài)瞬間終止一切活動，不存在離子和溶質(zhì)在細胞內(nèi)的再分布，理論上對細胞的損傷小是保存生物樣品材料理想的方法第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天四、冷凍的步驟適應(yīng)癥胚胎的選擇慢速冷凍快速冷凍第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天胚胎冷凍的適應(yīng)癥保存移植后剩余的胚胎有OHSS危險患者的胚胎接受贈卵由于突發(fā)疾病或其它原因暫時不能移植保存生育功能第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天胚胎的選擇符合移植或冷凍標準的胚胎囊胚形成率48～51％，不符合者囊胚形成率41.7％(FertilSteril2000,74:495,humreprod1998,13:2869)第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天胚胎的選擇(碎片）組別繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)囊胚形成數(shù)囊胚形成率％≤5％2807225.7>5≤20%1092724.8>20≤50%851315.3>50%53611.3合計52711822.4P<0.01第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天胚胎的選擇（細胞數(shù)）細胞數(shù)培養(yǎng)胚胎數(shù)囊胚數(shù)囊胚形成率％<410232.94~63349428.1>6381539.5合計47411223.6P<0.01第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天胚胎的選擇（發(fā)育速度）發(fā)育速度胚胎數(shù)囊胚數(shù)囊胚形成率％停滯2142813.1遲緩2608432.3合計47411223.6不符合冷凍標準胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚冷凍復(fù)蘇31例，移植17例，3例妊娠第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天冷凍胚胎的選擇卵裂期：≥4細胞，碎片≤20％原核期:透明帶完整，原核清晰可見，胞質(zhì)健康受精后20～22h囊胚期：內(nèi)細胞團清晰，滋養(yǎng)細胞呈鐮刀狀連續(xù)平鋪于透明帶內(nèi)，透明帶變薄第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天卵裂期和原核期程序化冷凍

冷凍前準備－與冷凍保護劑平衡37℃A0.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml5minB1MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml5minC1.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml10minD1.5MPPD＋人血清白蛋白12mg/ml+0.1M蔗糖min裝管第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天程序冷凍2℃/min降溫至－6℃停留5min植冰再停留10min0.3℃/min降溫至－35℃10℃/min降溫至－150℃立即投入液氮第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天慢速冷凍防止過冷－植冰慢速冷凍的關(guān)鍵是細胞溶液外結(jié)冰，細胞內(nèi)脫水，一般細胞外先結(jié)冰，因為細胞內(nèi)滲透壓高冰點以下仍未結(jié)冰，純水過冷－35℃，溫度越低，結(jié)冰的可能性越大過冷達到細胞內(nèi)冰點使細胞內(nèi)結(jié)冰過冷使細胞外結(jié)冰時間不一致，保證在特定的溫度細胞外開始結(jié)冰第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天復(fù)溫空氣中30～40s去液氮30℃～35℃水浴至冰融化40s3ml0.5M蔗糖＋12mg/ml人白蛋白10min3ml0.2M蔗糖＋12mg/ml人白蛋白10min100ul12mg/ml人白蛋白液滴1min洗7次最后液滴30min培養(yǎng)液中移植第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天玻璃化冷凍室溫10％DMSO＋10％EG＋20％SSS4min20％DMSO＋20％EG＋20％SSS＋0.4M蔗糖20s冷凍環(huán)液體體積<1ul,胚胎與玻璃化冷凍液接觸時間30s內(nèi)第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期天玻璃化復(fù)蘇復(fù)蘇液37℃冷凍環(huán)置37溶液上方，一旦融化立即放入復(fù)蘇液內(nèi)1M蔗糖＋0.25％SSS5min0.25M2～3min0.125M1～2min20％SSS磷酸緩沖液洗1min－培養(yǎng)液中洗數(shù)次第42頁,共49頁，2024年2月25日，星期天慢速冷凍與玻璃化冷凍比較冷凍方法濃度速率平衡細胞外結(jié)冰細胞玻璃化主要危險慢速1.50.3～1＋＋＋冰晶形成溶液效應(yīng)快速4～8M>2000－－＋毒性滲性休克第43頁,共49頁，2024年2月25日，星期天璃化冷凍的優(yōu)點省事，省時數(shù)分鐘：2～3h經(jīng)濟，不用程序冷凍儀，節(jié)省液氮高胚胎存活率冷凍卵母細胞和囊胚，脂質(zhì)豐富的牛豬卵母細胞和胚胎第44頁,共49頁，2024年2月25日，星期天玻璃化冷凍的缺點病毒污染液氮胚胎多費時冷凍環(huán)貴技術(shù)要求較高第45頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3種方法冷凍的結(jié)果

（同濟醫(yī)院生殖中心2007，1～10）冷凍方法復(fù)蘇移植妊娠妊娠率％程序31029211