12種中草藥水煎劑抗剛地弓形蟲感染的初步研究

12種中草藥水煎劑抗剛地弓形蟲感染的初步研究剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的人獸共患性寄生蟲,對人類健康、公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)生產(chǎn)均危害嚴重。目前,尚無理想疫苗和治療性藥物。中草藥在我國使用年份久遠,種類豐富,所含成分極其復雜,可作為研發(fā)抗弓形蟲感染特效藥的重要突破口。因此,本文依照弓形蟲疾病常見臨床癥狀,有針對性地選擇蒼術(shù)等12種中草藥作為實驗對象,經(jīng)分別制備水煎劑,旨在探究其抗剛地弓形蟲感染效果,建立中草藥抗弓形蟲感染通用研究方法的同時,也為日后研制弓形蟲特效治療藥物和深入解析中草藥單體抑制弓形蟲胞內(nèi)增殖分子機制奠定基礎。首先,本文以我國傳統(tǒng)中藥炮制方法為基礎,分別制備了12種中草藥水煎劑,經(jīng)檢測吸光度和干重發(fā)現(xiàn),所得水煎劑均含有不同程度的色素,并且干重與吸光度間無明顯相關(guān)關(guān)系,相同干重的中草藥水煎劑吸光度差別很大。其次,本文選擇剛地弓形蟲ACT1序列為靶基因,合成5對特異性較強的引物,經(jīng)PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳分析,優(yōu)化了PCR反應條件,建立了適用性更強、應用范圍更廣的Real-timePCR弓形蟲定量分析系統(tǒng),并且所得水煎劑對已建系統(tǒng)無干擾。細胞毒性檢測結(jié)果顯示,水煎劑種類不同,細胞毒性差異較大,當經(jīng)64倍稀釋后均毒性不明顯,表明探究所得水煎劑抗弓形蟲感染效果前需要(I)明確所選中草藥有抑制剛地弓形蟲體外增殖作用和(II)統(tǒng)一水煎劑作用濃度。鑒于本文所得水煎劑體外抗弓形蟲感染效果評價主要是在24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)完成的,因此我們以9種常見回歸模型對24孔板內(nèi)弓形蟲速殖子數(shù)進行曲線擬合,經(jīng)求解極值,獲得單孔弓形蟲感染量為1542.21個。預實驗結(jié)果顯示,檳榔、白薇、青蒿、蒲公英和柴胡等5種水煎劑經(jīng)64倍稀釋后體外抗弓形蟲感染效果顯著(P<0.05),表明所選中草藥有抑制弓形蟲速殖子增殖能力。將水煎劑最終作用濃度統(tǒng)一定為64.0mg/mL后發(fā)現(xiàn),檳榔、白薇、青蒿、佩蘭和柴胡等5種水煎劑細胞毒性明顯,其余7種水煎劑及其組合對體外弓形蟲增殖較空白對照均極顯著抑制(P<0.001),且蒲公英可單向增強蒼術(shù)抗感染效果,蒼術(shù)與金銀花存在藥物協(xié)同作用關(guān)系。探究水煎劑不同組合比對弓形蟲感染影響時發(fā)現(xiàn),蒼術(shù)-蒲公英以1:2組合時體外抗感染效果較等比例組合降低(P<0.05),即過量蒲公英對蒼術(shù)-蒲公英聯(lián)合抗感染藥效有減弱作用。此外,蒼術(shù)-金銀花以2:1組合時體外抗感染作用較等比例組合時明顯降低(P<0.05),即過量蒼術(shù)可顯著減弱金銀花體外抗弓形蟲感染能力。半數(shù)有效濃度檢測結(jié)果顯示,紫草、川烏和蒲公英抗弓形蟲RH株、PRU株、VEG株和C7非典型株感染均作用明顯,其中C7蟲株最敏感。運用水煎劑對弓形蟲感染進行預防時發(fā)現(xiàn),所選水煎劑對實驗鼠體重及脾內(nèi)CD19~+B淋巴細胞含量均無統(tǒng)計學影響(P>0.05),佩蘭和白芍可分別增多小鼠脾內(nèi)CD3e~+CD4~+T和CD3e~+CD8a~+T淋巴細胞,蒼術(shù)、獨活和金銀花對CD3e~+CD4~+T和CD3e~+CD8a~+T淋巴細胞均作用顯著(P<0.05)。此外,佩蘭、白芍和金銀花對實驗鼠脾淋巴細胞增殖有促進作用,其中以白芍作用最明顯(P<0.01)。攻蟲感染實驗結(jié)果顯示,12種水煎劑均不適合以灌胃形式預防弓形蟲RH株急性感染,蒼術(shù)、檳榔、佩蘭、蒲公英和紫草、柴胡可分別用來預防PRU株腦包囊引發(fā)的急性和慢性感染過程。運用水煎劑對弓形蟲感染進行治療時發(fā)現(xiàn),檳榔和蒲公英可分別減輕弓形蟲RH株和PRU株感染鼠體重,所得水煎劑對弓形蟲RH株和PRU株急性感染均療效不明顯(P>0.05)。值得注意的是,檳榔、紫草和白芍適合用來治療由弓形蟲PRU株引發(fā)的慢性感染過程,而蒼術(shù)和青蒿有助于PRU株腦包囊感染鼠急性病程向慢性感染轉(zhuǎn)變。本研究所選12種中草藥對剛地弓形蟲體內(nèi)外抗感染效果均不相同,即使同種水煎劑在弓形蟲急性和慢性感染過