酶工程第八節(jié)抗體酶

關(guān)于酶工程第八節(jié)抗體酶

問題的提出：

抗體是目前已知的最大多樣性體系，機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以產(chǎn)生108-1010個不同的抗體分子，抗體分子的多樣性及其高度精確識別性使其能結(jié)合幾乎任何天然的或合成的分子。

能否利用抗體的這一特性將抗體開發(fā)成象酶那樣的催化劑呢？1986年<Science>同時發(fā)表了兩篇來自由Lemer和Schultz分別領(lǐng)導(dǎo)的兩個研究組發(fā)現(xiàn)具有酶催化性質(zhì)的抗體研究報告。第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

第八節(jié)抗體酶

Abzyme一概述二機(jī)制三制備四應(yīng)用

第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

1946年,諾貝爾獎二次得主美國化學(xué)家LinusPauling提出酶催化反應(yīng)的過渡態(tài)理論：酶催化化學(xué)反應(yīng)的機(jī)制在于：酶能與高能、短壽命的過渡態(tài)（激發(fā)態(tài)）相結(jié)合，在這個處于反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間的過渡態(tài)構(gòu)型中，某些鍵斷裂而另一些鍵形成，從而大大降低了化學(xué)反應(yīng)的活化能。

一、抗體酶的發(fā)現(xiàn)與研究思路

酶的催化機(jī)理是降低活化能第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

能與過渡態(tài)結(jié)合的抗體也具有酶的性質(zhì)

根據(jù)Pauling理論，WilliamJencks于1969年預(yù)言：若能找到對應(yīng)某反應(yīng)過渡態(tài)的抗體，將其加入該反應(yīng)體系中，就可觀測到這個抗體對該反應(yīng)的催化效應(yīng)。也即：抗體若能與某化學(xué)反應(yīng)的過渡態(tài)結(jié)合，則這樣的抗體必也能像酶一樣，使其活化能降低，從而幫助大量反應(yīng)物分子跨越能障，達(dá)到加速反應(yīng)的目的。這就意味著，抗體一旦能與過渡態(tài)相結(jié)合，它就具有酶的性質(zhì)，即在溫和條件下高效專屬地催化學(xué)反應(yīng)。

LinusCarlPauling第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

尋找過渡態(tài)類似物作為半抗原產(chǎn)生的抗體可能具有酶活性

由于ES?過渡態(tài)中間物的半衰期很短，實踐中很難獲得反應(yīng)的過渡態(tài)，若設(shè)計和制備穩(wěn)定的過渡態(tài)類似物（能夠模擬一個酶催化反應(yīng)過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定物質(zhì)，它能與相應(yīng)的酶緊密結(jié)合而成為該酶的競爭性抑制劑），以此替代反應(yīng)的過渡態(tài)作為半抗原，誘導(dǎo)與其互補(bǔ)構(gòu)像的抗體，這樣產(chǎn)生的抗體就能識別反應(yīng)過程的真正過渡態(tài)，該抗體即有酶催化反應(yīng)的基本特征，可能成為一種具有酶活性的抗體。第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

如愿以償

在1986年，加利福尼亞實驗室的Lerner和Schultz同時報道了成功制備具有催化能力的單克隆抗體---催化抗體，證實了抗體和酶一樣，能專一催化化學(xué)反應(yīng)的事實。此后，抗體酶才從理論變?yōu)榱爽F(xiàn)實。

目前，抗體酶的研究方向是如何提高酶的效率以及免疫學(xué)中的應(yīng)用。

PeterSchultz第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天Aquestion:

抗體酶是酶還是抗體？第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

二、抗體酶的結(jié)構(gòu)與機(jī)制

什么是酶(enzyme)？酶——活細(xì)胞產(chǎn)生，起生物化學(xué)反應(yīng)催化劑作用的蛋白質(zhì)。

什么是抗體（antibody，Ab）？抗體——是B細(xì)胞識別抗原后增殖分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中,能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能。

其本質(zhì)是一類免疫球蛋白。

第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體結(jié)構(gòu)

抗體分子是由兩條輕鏈(lightchain,L鏈)和兩條重鏈(heavychain,H鏈)通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鍵結(jié)構(gòu)。第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)蛋白酶水解后分為抗原結(jié)合片段(antigenbindingfragment,Fab)

和可結(jié)晶片段(crystallizabefragement,Fc)；位于H和L鏈的N-端的可變區(qū)是抗原的結(jié)合位點,由約110個氨基酸構(gòu)成(variableregion,V)。其中H鏈含4個超變區(qū)段，L鏈含3個超變區(qū)段，加上兩條鏈的組合，就可產(chǎn)生108以上種抗體分子。第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體酶模型第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體酶——Abzyme

是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結(jié)的產(chǎn)物，本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋（Ig），在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。因此，催化抗體又稱抗體酶。通過一系列化學(xué)和生物技術(shù)方法制備出具有催化活性的抗體，除了具有相應(yīng)的免疫學(xué)性質(zhì)，還類似于酶，具有各種催化特性。所以，其實抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質(zhì)的兼得。所以又被稱為催化抗體。（Catalyticantibody）第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體酶的作用機(jī)制

酶和抗體的本質(zhì)差別在于：酶是能和反應(yīng)過渡態(tài)

(激發(fā)態(tài)分子)選擇結(jié)合的催化物質(zhì)。而抗體是和基態(tài)分子選擇結(jié)合的催化物質(zhì),它們識別底物的機(jī)理是相同的。如果以激發(fā)態(tài)的分子為半抗原激發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體,那么這種抗體就可能像酶一樣催化經(jīng)過此過渡態(tài)的化學(xué)反應(yīng)。由于在實踐中很難獲得反應(yīng)的過渡態(tài)，激發(fā)態(tài)的過渡態(tài)分子不可能作為抗原來產(chǎn)生抗體，所以對某一特定的酶催化的化學(xué)反應(yīng),可以合成一種穩(wěn)定態(tài)分子,它在帶電性能,幾何形狀與反應(yīng)過渡態(tài)分子結(jié)構(gòu)類似。這種穩(wěn)定態(tài)分子即為過渡態(tài)類似物。

設(shè)計和制備穩(wěn)定的過渡態(tài)類似物，以此代替反應(yīng)的過渡態(tài)作為半抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，這樣產(chǎn)生的抗體就能識別反應(yīng)過程的真正過渡態(tài)，該抗體具有酶催化反應(yīng)的基本特征，可能成為一種具有酶活性的抗體。這就是我們所稱的抗體酶。第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體酶與天然酶相比其優(yōu)勢何在？（1）抗體酶可以達(dá)到專一催化某一底物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)。（2）抗體酶能催化那些理論上認(rèn)為非常不利的反應(yīng)。（3）抗體酶能催化那些天然酶不能催化的反應(yīng)。

(4)不僅提供了人工生物催化劑，而且提供了研究生物催化過程的新途徑。

抗體的種類非常多，免疫系統(tǒng)可以擁有上億種抗原特異性不同的抗體分子。應(yīng)用抗體的種類繁多以及抗體酶的可誘導(dǎo)、可改造的特點，有望能制備出具有治療和輔助治療某些疾病和催化某類具有特殊意義反應(yīng)的抗體酶。

第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

Aquestion:

如何讓抗體具有酶活性？第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

抗體酶制備的基本原理

按照現(xiàn)代酶學(xué)理論，酶首先要和底物結(jié)合，使底物向過渡態(tài)轉(zhuǎn)化，然后再在催化基團(tuán)的作用下促進(jìn)底物進(jìn)行反應(yīng)。免疫反應(yīng)和酶反應(yīng)十分相似，抗體也能專一地、高親和力地與抗原物質(zhì)結(jié)合，然后再促使抗原發(fā)生各種變化。如果能適當(dāng)?shù)馗淖兛贵w中與抗原結(jié)合部位的微環(huán)境，并在適當(dāng)部位引入相應(yīng)的催化基團(tuán)，那就有可能使抗體轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写呋阅艿目贵w酶。三、抗體酶的制備第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天制備方法誘導(dǎo)法基因工程法拷貝法導(dǎo)入法修飾法第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

誘導(dǎo)法

采用過渡態(tài)的底物類似物誘導(dǎo)

(transitionstateanalogue)

作為酶的抑制劑的過渡態(tài)類似物是穩(wěn)定的，因此利用抗體能與抗原特異結(jié)合的原理，可用過渡態(tài)的類似物作為半抗原來誘發(fā)抗體，這樣產(chǎn)生的抗體便能特異的識別反應(yīng)過程中真正的過渡態(tài)分子！

首先設(shè)計和制備過渡態(tài)的底物類似物，以它作為半

抗原（hapten），再和載體蛋白質(zhì)一起免疫動物，然后

分出脾細(xì)胞，進(jìn)而和骨髓瘤細(xì)胞融合，選出對半抗原有

高親和力的克隆，使之在培養(yǎng)介質(zhì)中生長擴(kuò)增，最后選

擇、純化產(chǎn)生的具有催化活性的單克隆抗體。此法的關(guān)

鍵是要設(shè)計和獲得適當(dāng)?shù)倪^渡態(tài)底物類似物作為半抗原。第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天“制備”抗原：設(shè)計過渡態(tài)類似物合成半抗原半抗原－載體雜交瘤細(xì)胞制備：免疫小鼠與骨髓瘤細(xì)胞結(jié)合限制性稀釋篩選與半抗原具有高親和力的克隆制備單克隆抗體：將細(xì)胞培養(yǎng)于腹水液或培養(yǎng)介質(zhì)中生產(chǎn)單抗純化單抗篩選抗體酶：篩選具有催化性能的單抗第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

簡言之——

誘導(dǎo)法是選擇適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)模型物與載體蛋白連接后給動物免疫，通過雜交瘤技術(shù)篩選和分離單克隆抗體（所得抗體催化效果的好壞很大程度上取決于化學(xué)模型物的設(shè)計）。第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

基因工程法

對于已經(jīng)獲得的單抗，分析其氨基酸序列和相應(yīng)基因的堿基序列，將抗原結(jié)合部位的基因換上編碼有催化作用的氨基酸的基因，這就是基因工程法制備抗體酶的主要內(nèi)容?；蚬こ痰募夹g(shù)使得建立抗體基本的組合文庫，并根據(jù)需要構(gòu)建適當(dāng)序列的基因片斷已成為可能。利用抗體庫技術(shù)，在將來也許有可能繞開免疫，產(chǎn)生完全由基因工程構(gòu)建的全新抗體酶。第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

拷貝法

用已知酶作為抗原免疫動物，通過單克隆技術(shù)，制得抗該種酶的抗體。再以此種抗體免疫動物，再次采用單克隆技術(shù)，經(jīng)篩選與純化，就可獲得具有原來酶活性的抗體酶(因為抗原與該抗產(chǎn)生的抗體具有互補(bǔ)性，經(jīng)過上述兩次拷貝，就把酶的活性部位的信息翻錄到抗體酶上，使該抗體酶能高選擇性地催化原酶所催化的反應(yīng))。這種方法對自然界來源稀少的緊缺酶，不失為一種有價值的有潛力的方法。

第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

導(dǎo)入法在現(xiàn)有的抗體基礎(chǔ)上，借助化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程的辦法將催化基團(tuán)引入到已有底物結(jié)合能力的抗體的抗原結(jié)合部位上?？梢圆捎眠x擇性化學(xué)修飾的方法將人工合成的或天然存在的催化基團(tuán)引入到抗原結(jié)合部位；也可采用寡核苷酸定點誘變技術(shù)將特定的氨基酸殘基引入抗原結(jié)合部位，使其獲得催化功能。第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天化學(xué)修飾法

抗體酶和酶一樣也可以用化學(xué)修飾的方法加以改造。對抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法，在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

游離巰基就是適合的基團(tuán)之一,它具有高親核性,易于氧化,及能通過二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點。Schultz等在IgAMOP315抗體結(jié)合部位選擇性的引入了親核性的巰基。其方法如下:用含有易裂解鍵(如二硫鍵或硫鍵)的親和力標(biāo)記試劑,在NaCNBH3存在下,對抗體進(jìn)行親和力標(biāo)記,將標(biāo)記的抗體通過親和力色譜而純化,然后標(biāo)記物被裂解形成活潑的二硫化物。大量的催化基團(tuán)能夠通過二硫化物的交換反應(yīng)而引入。通過此方法,在IgAMOP315抗體的結(jié)合部位引入了巰基(-SH),其催化香豆酯水解的速度比照樣相提高了6×104倍。第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

四、抗體酶的應(yīng)用前景

在抗體酶被發(fā)現(xiàn)的13年以后，他們才開始進(jìn)入商業(yè)領(lǐng)域。目前已有一些公司，比如：美國的Med-Immune和Prolifaron公司以及以色列的AdvancedBiotechLtd.致力于抗體酶的商業(yè)應(yīng)用，并且取得了一些業(yè)績。

第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

（一）、人工設(shè)計一些抗體酶來實現(xiàn)對某些手性藥物的立體專一性合成和非酶催化系統(tǒng)的反應(yīng)的催化。包括催化酯水解、糖苷鍵水解、Diels-Alder反應(yīng)和Oxy-Cope重排反應(yīng)等。在催化萘普生乙酯水解的抗體酶研究中，發(fā)現(xiàn)所獲得的多克隆和單克隆抗體都能立體專一性地水解R構(gòu)型的萘普生乙酯，從而開辟了一條抗體酶用于手性合成的道路，此技術(shù)已獲授權(quán)發(fā)明專利。

第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

（二）、有很多世界知名的實驗室提出了許多不同的方案，期望將抗體酶技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥制造方面。其中之一就是利用抗體酶的水解產(chǎn)物來激活一些藥物前體,通過瞄準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞活性，藥物前體就能直接作用于腫瘤細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒素的化合物。第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

（三）、一個在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用是利用抗體酶來特異性的水解可卡因。目前美國的哥倫比亞大學(xué)正致力于這方面的研究，希望可以找到解決過量吸食毒品的方案。用可卡因磷酸單酯過渡態(tài)類似物為抗原制備的抗體酶能催化可卡因中苯甲?；鶊F(tuán)的水解，其水解產(chǎn)物芽子堿甲酯和苯甲酸不具有可卡因的刺激作用，這為治療可卡因依賴性的患者提供了可能。第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

以色列的AdvancedBiotechLtd.正在試圖利用抗體酶技術(shù)生產(chǎn)一種藥物來對付革蘭氏陰性膿血癥。

所有這些對抗體酶的研究都是為了得到一種具有特定序列的蛋白酶，從而為抗癌療法以及新型疫苗的獲得開辟一條新的道路。第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1、在診斷肝炎方面的應(yīng)用

利用抗體酶技術(shù)可以方便的診斷出丙型,丁型,戊型肝炎.比如對于戊型肝炎,目前已經(jīng)研制出一種IgM抗體酶免檢測試劑盒。此試劑盒采用間接ELISA法，檢測戊型肝炎病毒IgG抗體，包被抗原為合成肽(ORF2和ORF3)，酶標(biāo)抗體為辣根酶標(biāo)記的抗－μ單抗，試劑全部工作液化，可直接使用，包被板采用可掰板，可單人份檢測，反應(yīng)過程為50分鐘.

第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、在診斷胃腸道惡性腫瘤的應(yīng)用

根據(jù)中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志(CHINESEJOURNALOFLABORATORYMEDICINE)的介紹，對于結(jié)直腸癌的輔助診斷和監(jiān)測，常用的血清腫瘤生物學(xué)標(biāo)志為癌胚抗原（CEA）、癌相關(guān)糖抗原（CA）19-9、CA72-4及CA242等。根據(jù)抗腫瘤單克隆抗體證實，血清腫瘤標(biāo)志均為非特異的腫瘤相關(guān)抗原［1］，其檢測腫瘤的敏感性及特異性均有限。嘗試將以上與結(jié)直腸癌有關(guān)的血清腫瘤標(biāo)志進(jìn)行手術(shù)前后測定及單項、雙項、3項、4項聯(lián)合測定并進(jìn)行比較，目的在于對各腫瘤標(biāo)志在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用價值進(jìn)行評價，并選擇較佳的血清腫瘤標(biāo)志組合，以提高檢測結(jié)直腸癌的敏感性。第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

用基因工程人源化的抗體酶代替從細(xì)菌中得到對人體有毒副作用的天然酶，把該抗體酶與癌細(xì)胞表面抗原特異抗體結(jié)合，利用特異抗體，把抗體酶帶到癌細(xì)胞的周圍，分解藥物前體，專一殺死癌細(xì)胞，大大減少了化療的毒副作用。

第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、在診斷艾滋病方面的應(yīng)用

艾滋?。ˋIDS）是感染艾滋病病毒（HIV）后免疫功能逐漸喪失的結(jié)果。研究證明，除血液標(biāo)本外，HIV感染者的尿液、唾液、淚液、精液中均可檢測到抗HIV抗體。艾滋病的診斷一直以來以血清學(xué)檢查陽性為基礎(chǔ)。最近，一種新的艾滋病診斷試劑———尿液HIV－1抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑已經(jīng)進(jìn)入市場。

第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

尿液HIV－1抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑與血清學(xué)診斷試劑比較，有其獨(dú)特的優(yōu)勢：它不僅和血液HIV抗體酶聯(lián)免疫診斷檢測方法一樣，具有較好的可信度，而且尿液中一般不存在HIV病毒，無針頭采集尿液標(biāo)本，不會引起皮膚損傷，消除了收集血液標(biāo)本過程中引起的病毒傳播的可能；其次尿液收集簡便易行，便于大規(guī)模篩查。由于采樣過程不需要針刺，建立在無損傷收集標(biāo)本的基礎(chǔ)上，消除了與職業(yè)暴露相關(guān)的危險因素，可以保護(hù)醫(yī)護(hù)人員和被檢測者避免查體時因針刺意外感染肝炎或艾滋病病毒的危險。因此，該檢測試劑可用于除血源篩查以外人群的艾滋病HIV－1抗體篩查。第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4、在診斷妊娠反應(yīng)方面的應(yīng)用

單克隆抗體酶標(biāo)絨毛膜促性腺激素檢測法這是目前最先進(jìn)的妊娠試驗，靈敏度極高,陽性率幾乎百分之百。用本法可在受精后10天左右即在停經(jīng)之前就能確定診斷，而且操作簡單，人人都能學(xué)會，也可以在家庭使用。第38頁,共43頁，2024年2月25日，星期天

小結(jié)

取得了很大進(jìn)展

抗體酶研究已取得很大進(jìn)展，建立了制備抗體酶的技術(shù)（包