酶免疫組化實驗

關于酶免疫組化實驗實驗目的1、掌握免疫組化技術的基本原理。2、掌握檢測T細胞表面分子CD3的實驗原理及檢測方法。3、掌握SABC免疫放大技術原理。第2頁,共22頁，2024年2月25日，星期天免疫組織化學技術（immunohistochemistrytechnique,IHCT）是指在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，借助可見的標記物，對抗原抗體進行定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。

抗原抗體反應的特異性組織化學的可見性第3頁,共22頁，2024年2月25日，星期天分類酶免疫組化技術熒光免疫組化技術親和免疫細胞組化技術免疫金（銀）細胞染色組化技術免疫標記電鏡技術雜交免疫細胞組化技術第4頁,共22頁，2024年2月25日，星期天酶免疫組化技術酶免疫組化技術是直接以細胞或組織切片為抗原相，以酶聯(lián)免疫技術檢測抗原或抗體的存在與否或定位的一類酶免疫技術。本實驗以酶免疫組化技術檢測CD3為例。以親和素-生物素-過氧化物酶（ABC或SABC）技術檢測T淋巴細胞亞群為例驗證酶免疫組織化學技術檢測組織抗原的方法。第5頁,共22頁，2024年2月25日，星期天酶免疫組化染色中常用的酶及顯示底物最常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP）常用的供氫體：

二氨基聯(lián)苯胺（DAB）—反應產(chǎn)物呈棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）—反應產(chǎn)物呈橘紅色

4-氯-1-萘酚—反應產(chǎn)物呈灰藍色第6頁,共22頁，2024年2月25日，星期天生物素-親和素放大技術是一種以生物素(biotin，B)和親和素(avidin，AV)具有的多級放大結合特性為基礎的實驗技術，它既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標記，與標記免疫技術的有機結合，極大提高了分析測定的靈敏度。特點：靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、適用性常見類型：BAB法和ABC法第7頁,共22頁，2024年2月25日，星期天ABC法原理1、預先按一定比例將親和素（或鏈霉親和素）與酶標生物結合，形成可溶的親和素（或鏈霉親和素）-生物素-過氧化物酶復合物（ABC或SABC）。2、當其與檢測反應體系中的生物素化抗體（直接法）或生物素化二抗（間接法）相遇時，ABC（或SABC）中未飽和的親和素結合部位就可與抗體上的生物素結合，使抗原-抗體反應與ABC（或SABC）標記體系連成一體進行檢測。第8頁,共22頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點

一個親和素（A）有4個生物素結合位點，一個過氧化物酶可結合多個生物素分子，ABC法將親和素作為“橋”把生物素化的抗體與生物素結合的酶連接起來，形成一個網(wǎng)絡狀復合物，其中網(wǎng)絡了大量酶分子，因此應用于檢測體系時，極大提高酶在抗原-抗體反應中的濃度，提高檢測敏感性。第9頁,共22頁，2024年2月25日，星期天實驗原理將分離得到的淋巴細胞制成涂片，加入的CD3單克隆抗體與待檢單個核細胞涂片作用。

CD3陽性的細胞就會與CD3單克隆抗體特異性結合，再用生物素化抗鼠IgG檢測CD3單抗與待檢細胞結合的情況。最后加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶(ABC橋聯(lián)法)，與生物素化抗鼠IgG結合，酶遇到底物時，能催化底物產(chǎn)生有色不溶性產(chǎn)物。根據(jù)細胞被底物著色的情況可以判定CD3陰性和陽性的細胞，測定其陽性百分率。第10頁,共22頁，2024年2月25日，星期天SABCB-山羊抗鼠IgG抗體鼠抗CD3單抗CD3T淋巴細胞間接ABC法：CD3——鼠抗CD3單抗——B-山羊抗鼠IgG抗體——SABC第11頁,共22頁，2024年2月25日，星期天實驗器材與試劑1、5%BSA

2、抗CD3單克隆抗體3、生物素化羊抗鼠IgG(二抗)4、鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶(SABC)5、3,3,-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)6、0.0lmol/LpH7.2PBS7、淋巴細胞分離液8、丙酮9、玻片、吸水紙、顯微鏡等第12頁,共22頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟1、無菌采集靜脈血3ml/2人，注入盛有肝素的無菌試管中（肝素濃度為20U/ml全血），立即輕輕搖勻，使血液抗凝。2、用無菌吸管加入等體積即3ml的室溫PBS液，使血液等倍稀釋。第13頁,共22頁，2024年2月25日，星期天3、取10ml試管2支，分別加入1.5ml淋巴細胞分離液（Ficoll），將離心管傾斜45

角，在距分層液界面上1cm處將稀釋血液沿試管壁緩慢加至分層液上面，每管3ml，注意保持兩者界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。第14頁,共22頁，2024年2月25日，星期天4、2000轉(zhuǎn)/分離心30min，離心后另取1只10ml試管，加入6mlPBS液，用毛細吸管輕輕插到白膜層，取吸淋巴細胞層至此試管中，1500轉(zhuǎn)/分離心10min洗滌2次。5、第2次洗滌后棄去上清，用移液器將沉淀細胞和試管壁所剩PBS液（約200ul）混勻，吸取20ul細胞懸液于潔凈載玻片上，制成涂片，自然干燥。第15頁,共22頁，2024年2月25日，星期天6、純丙酮固定20min，雙蒸水洗去多余丙酮，自然干燥。7、在標本處滴加5%BSA封閉液50ul，室溫封閉10min，甩去多余液體，不洗。8、滴加鼠抗人CD3單抗50ul，置濕盒中37℃作用1h。第16頁,共22頁，2024年2月25日，星期天固定的目的使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，細胞內(nèi)分解酶反應終止，以防止細胞自溶，保持細胞形態(tài)和結構。保存組織細胞抗原性防止標本脫落除去妨礙抗體結合的類脂，便于保存抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐敗和后續(xù)組織制備中的細胞結構和成分的改變第17頁,共22頁，2024年2月25日，星期天9、PBS洗3次，每次2min，用吸水紙將細胞周圍擦干。10、加B-山羊抗小鼠IgG抗體50ul，置濕盒中37℃作用20min。11、重復9。12、加SABC50ul，置濕盒中37℃作用20min。13、重復9。第18頁,共22頁，2024年2月25日，星期天14、加DAB50ul，室溫10～13分鐘，雙蒸水洗。（DAB需現(xiàn)配現(xiàn)用，即將A、B、C液各1滴加入1ml雙蒸水中混合）15、加蘇木素染液復染30s。16、加蓋玻片鏡檢。第19頁,共22頁，2024年2月25日，星期天五、實驗結果判定陽性細胞染成棕黃色，陰性