GB 18281.1-2015 醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 生物指示物 第1部分：通則

醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物第1部分：通則2015-12-10發(fā)布中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局IGB18281的本部分的全部技術(shù)內(nèi)容為強制性?！?部分：環(huán)氧乙烷滅菌用生物指示物；——第4部分：干熱滅菌用生物指示物；——第5部分：低溫蒸汽甲醛滅菌用生物指示物。本部分是GB18281的第1部分?！黾恿俗院缴镏甘疚锏木唧w信息；——增加了對標(biāo)簽的綜合要求的圖表；——增加了生物指示物的使用關(guān)于具體的最低生物量和/或抗力標(biāo)準(zhǔn)的范圍等其他方面的要求，這與本部分中規(guī)范性引用的國際文件有一致性對應(yīng)關(guān)系的我國文件如下：——GB/T7408—2005數(shù)據(jù)元和交換格式信息交換日期和時間表示法(ISO8601:2000, 醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 GB/T18279.2—2015醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌環(huán)氧乙烷第2部分：GB18279.1應(yīng)用指南 醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第1部分；醫(yī)療器械滅菌過程醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第2部分：建立滅菌劑量(ISO11137-2: 醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射最終滅菌醫(yī)療器械的包裝第3部分：劑量測量指南(ISO11137-3:第1部分：材料、無菌屏障系統(tǒng)和包裝系 GB/T19633.2—2015最終滅菌醫(yī)療器械的包裝第2部分；成形、密封和裝配過程的確認 GB/T19973.1—2015醫(yī)療器械的滅菌微生物學(xué)方法第1部分；產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測Ⅱ IDT);24628—2009醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物與化學(xué)指示物測試設(shè)備(ISO18472:2006,0287—2003醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系用于法規(guī)的要求(ISO13485:2003,IDT);0466.1—2009醫(yī)療器械用于醫(yī)療器械標(biāo)簽、標(biāo)記和提供信息的符號第1部分：通本部分做了下列編輯性修改：——按照GB/T1.1的要求進行了一些編輯上的修改；——刪除了國際標(biāo)準(zhǔn)的前言。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)行機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本部分由國家食品藥品監(jiān)督管理總局提出。本部分由全國消毒技術(shù)與設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC200)歸口。本部分起草單位：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司、3M中國有限公司、國家食品藥品監(jiān)督管理局廣州醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心。本部分所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：Ⅲ本部分規(guī)定了用于滅菌周期監(jiān)測的生物指示物(包括染菌載體和菌懸液)在生產(chǎn)、標(biāo)簽、檢測方法和性能等方面的通用要求。GB18281的其他部分規(guī)定了對用于不同滅菌過程的生物指示物的具體要求。附錄F中介紹了生物指示物的詳細圖解和組成部分，其中包含GB18281中的兩類生物指示物，這抗力特性取決于試驗微生物的種類、數(shù)量、準(zhǔn)備方式和初級包裝的效果。關(guān)于生物指示物的選擇、對于任何一個(包括GB18281的其他部分所描述的)滅菌過程，生物指示物的抗力也取決于測試時的微生物環(huán)境。理論上，這可能導(dǎo)致生物指示物的準(zhǔn)備過程中產(chǎn)生很多不確定因素。此外，滅菌過程中可能會出現(xiàn)各種情況，這就要保證產(chǎn)品在各種條件下能充分暴露。因此，當(dāng)暴露在特定滅菌過程各種條件下時，規(guī)范生產(chǎn)的生物指示物的抗力性能表現(xiàn)為D值和相關(guān)的z值。這些值在GB18281的其他部分中都有所規(guī)定。專業(yè)制造商、使用者和權(quán)威管理部門都參與了GB18281的第1部分～第5部分的起草，其代表了在GB18281的其他部分中所未涉及的具體滅菌過程的生物指示物也要遵循GB18281的通用要求，包括抗力性能的測試。這類指示物不能準(zhǔn)確定義，可能用于新的滅菌過程，也可用單獨的微生物負載來代表。如果這些生物指示物含有世界衛(wèi)生組織風(fēng)險評估小組一組以外的微生物，應(yīng)滿足合適的保GB18281規(guī)定了確認要求和滅菌過程的控制。1學(xué)兔兔www.bzfx醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物1.1.1GB18281的本部分規(guī)定了擬用于確認和監(jiān)測滅菌周期的生物指示物(包括染菌載體、試驗菌懸1.1.2本部分的基本要求適用于GB18281的其他各部分。對于用于特殊滅菌過程中的生物指示物的要求在GB18281的其他部分都有所規(guī)定。本部分適用于沒有特殊要求的生物指示物。本部分不適用于依靠物理方式去除微生物的檢測體系，例如過濾過程或利用清洗消毒器或流通蒸汽等物理和/或機械方法去除微生物的過程。然而，本部分應(yīng)包含相應(yīng)的微生物測試系統(tǒng)的內(nèi)容。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。ISO8601數(shù)據(jù)元和交換格式信息交換日期和時間表示法(Dataelementsandinterchangeformats—Informationinterchange—Representationofdatesandtimes)ISO11135-1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌環(huán)氧乙烷第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認和常規(guī)控制的要求(Sterilizationofhealthcareproducts—Ethyleneoxide—Part1:Requirementsfordevelop-ment,validationandroutinecontrolofasterilizationprocessformhealthcareproducts-Ethyleneoxide-Part2:GuISO11137-1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認和常規(guī)控制要求(Sterilizationofhealthcareproducts—Radiation—Part1:Requirementsvalidationandroutinecontrolofasterilizationprocessformedicaldevices)products—Radiation—Part2:Establishingthesterilizationdose)ISO11137-3醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌輻射第3部分：劑量測量指南(SterilizationofhealthcareISO11607-2最終滅菌醫(yī)療器械的包裝第2部分：成形、密封和裝配過程的確認(Packagingforterminallysterilizedmedicaldevices-Part2:Validationrequiremen2ISO11737-1醫(yī)療器材的滅菌微生物學(xué)方法第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(Sterilizationofmedicaldevices—Microbiologicalmethodssystems—Requirementsforregulatorypurposes)beusedwithmedicaldevicelabels,labellingandinfISO17665-1醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌濕熱第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的要求(Sterilizationofhealthcareproducts—Moistheat—Part1:RequirementsISO18472醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物與化學(xué)指示物測試設(shè)備(Sterilizationofhealthcareprod-3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。生物指示物biologicalindicator可涂覆試驗微生物的支持材料。菌落形成單位colonyformingunit由單個或多個細胞生長構(gòu)成的肉眼可見的活的微生物群落。在規(guī)定的條件下，滅活試驗微生物總數(shù)的90%所需的時間或劑量。3學(xué)兔兔www.bzfxw微生物生長和(或)繁殖能力的喪失。在設(shè)定的條件下，試驗微生物的滅活與對滅菌介質(zhì)暴露增強的關(guān)系曲線圖。已染上規(guī)定數(shù)量試驗微生物的載體。標(biāo)定的微生物總數(shù)nominalpopulation制造商標(biāo)定的活的微生物數(shù)量。無菌屏障系統(tǒng)和保護性包裝的組合。[ISO/TS11139:2006,定義2.28]過程挑戰(zhàn)裝置processchallengedevice;PCD對某一滅菌過程構(gòu)成特定抗力的裝置，用于評價該滅菌過程的性能。為測量滅菌過程中產(chǎn)生的物理和/或化學(xué)參數(shù)相關(guān)組合而設(shè)計的測量設(shè)備。次級包裝secondarypackage自含式生物指示物self-containedbiologicalindicator初級包裝中含有試驗微生物恢復(fù)生長所需培養(yǎng)基的生物指示物。存活-殺滅區(qū)間survival-killwindow在規(guī)定的條件下滅菌處理時，生物指示物從全部存活微生物(存活時間)過渡到全部殺滅微生物(殺滅時間)的暴露程度。包含活的試驗微生物的液體。4GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006實際可回收的菌落形成單位或其他合適單位的數(shù)量。注：見附錄A。使D值變化一個數(shù)量級所需溫度的數(shù)值。注：見ISO11138-3和ISO11138-4。4生產(chǎn)通用要求制造商應(yīng)按照本部分建立、記錄和持續(xù)運行一套完整的質(zhì)量體系(例如ISO13485、GMPS或國家其他要求)用以覆蓋所有的操作要求。特別是制造商要在生產(chǎn)的各個階段采取有效措施來降低對生物指示物產(chǎn)生的不良影響。制造的組成成分應(yīng)包括摻入或直接接觸試驗菌懸液、染菌載體或其初級包裝的所有材料和組成成分。最終產(chǎn)品應(yīng)符合本部分的要求：a)生產(chǎn)(第5章);b)標(biāo)簽(4.3);c)抗力特性(6.4);注：生物指示物的使用方法參見ISO14161。本部分規(guī)定的步驟和方法應(yīng)由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)和經(jīng)驗豐富的實驗室人員來實施(見4.1.1)。試驗微生物應(yīng)為被確定的菌株，來源于公認的菌種保藏機構(gòu)，并能通過正確的檢測方法進行a)試驗微生物需用合適的方法來處理，不需要特殊保藏方法，不需要特殊的操作條件，不需要特殊的運輸和郵遞要求(例如世界衛(wèi)生組織風(fēng)險評估小組一組要求);b)在規(guī)定的保質(zhì)期內(nèi)運輸和儲存，可以有效保持其菌株的抗力。注：一般來說，生物指示物使用的試驗微生物來自細菌芽孢。5除細菌芽孢外，試驗微生物也可以是被證明對滅菌過每批試驗微生物懸液的最初接種物應(yīng)符合以下要求：a)可追溯到公認的菌種保藏機構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株；b)驗證其種類和純度。指定保存試驗微生物菌種的方法應(yīng)當(dāng)能保證培養(yǎng)物不受污染，且引起其固有的性質(zhì)發(fā)生變化的不利影響減少到最小。對試驗微生物懸液的活菌計數(shù)按照附錄A的規(guī)定進行。用戶需要試驗微生物生長指數(shù)情況時，應(yīng)將有效試驗微生物數(shù)表達為占顯微鏡檢測所得細菌4.3制造商提供的信息(標(biāo)簽)——可追溯生產(chǎn)過程的唯一性編號；——試驗微生物的名稱；在適當(dāng)?shù)牡胤绞褂脟H公認的符號(見4.1.3和ISO15223)。4.3.2每批產(chǎn)品的外包裝應(yīng)該包括表1中給出的信息。信息要求菌懸液染菌載體生物指示物提供試驗微生物的菌種名稱或縮寫和該菌種的編號必需必需必需菌懸液的標(biāo)稱容積(mL)必需——產(chǎn)品適用過程、抗力以及影響抗力的操作過程和載體必需必需必需詳細的儲藏條件必需必需必需處置方法必需必需必需使用指南，尤其是有關(guān)滅菌處理后用于恢復(fù)試驗活菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的數(shù)據(jù)必需必需必需每毫升試驗微生物的數(shù)量(菌懸液)或每單位菌含量(染菌載體或生物指示物)必需必需必需次級包裝中產(chǎn)品的數(shù)量必需必需參考本部分必需必需必需根據(jù)要求對制造商提供的抗力以及數(shù)量進行檢測的方法。64.4.1應(yīng)遵照試驗微生物懸液的存儲和運輸條件，確保試驗微生物懸液符合本部分和GB18281的其4.4.2對染菌載體的包裝方式應(yīng)不影響其標(biāo)明的數(shù)量和每個染菌載體的性能。4.4.3應(yīng)遵照染菌載體的存儲和運輸條件，確保染菌載體符合本部分和GB18281的其他部分的要求。4.4.4單獨包裝的生物指示物應(yīng)放入次級包裝中才能進行運輸和儲存。用于運輸和儲存的包裝應(yīng)確保生物指示物符合本部分和GB18281的其他部分的要求。5生產(chǎn)具體要求5.1.1合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件應(yīng)能保證穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合本部分和GB18281的其他部分性能要求5.1.2菌懸液培養(yǎng)基應(yīng)不影響試驗微生物的穩(wěn)定性，同時要與染菌載體和生物指示物制造工藝和材料相兼容。5.1.3收集及隨后的處理方法應(yīng)保證載體染菌時使用的菌懸液不含有對染菌載體或生物指示物的效能可能產(chǎn)生不良影響的培養(yǎng)基殘留物。5.2.1載體、內(nèi)層和次級包裝的材料應(yīng)不得含有任何對生物指示物的性能產(chǎn)生不良影響的污染物(物5.2.2載體、內(nèi)層和次級包裝以及特殊的儲藏條件的標(biāo)識應(yīng)符合本部分要求，保證生物指示物在有效期內(nèi)性能良好。制造商應(yīng)向購買者提供每種載體尺寸的最大值和最小值。5.2.3在滅菌過程中或滅菌后，載體和初級包裝應(yīng)不得殘留或釋放任何物質(zhì)到培養(yǎng)基，否則會抑制少量存活菌在培養(yǎng)條件下的生長。應(yīng)按附錄B進行試驗，檢查是否符合這一要求。5.2.5用于載體和初級包裝的原材料應(yīng)能經(jīng)受暴露于滅菌過程，以保證染菌載體和生物指示物性能在預(yù)期用途下穩(wěn)定。應(yīng)通過觀察滅菌過程中載體和初級包裝暴露于極限變化范圍及其物理和化學(xué)變化的程度來檢驗是否符合標(biāo)準(zhǔn)。5.2.6生物指示物的制造商應(yīng)研究滅菌條件，并對生物指示物滅菌條件的適用性進行測試。5.3染菌載體5.3.2除非制造商已經(jīng)證明多個菌種的使用不會嚴(yán)重影響在特殊滅菌過程中試驗微生物的性能，否則滅菌不可行，接種前應(yīng)依據(jù)ISO11737-1建立可接受的生物負載量限度要求(見附錄B)。5.3.4載體的接種應(yīng)保持一致的微生物數(shù)量。75.4.1應(yīng)把單個載體分別裝入初級包裝內(nèi)作為生物指示物。5.4.2預(yù)期適用的初級包裝應(yīng)被確認(見附錄B)。5.4.3包裝應(yīng)符合國際標(biāo)準(zhǔn)或國家標(biāo)自含式生物指示物的性能應(yīng)經(jīng)過驗證，其中包括經(jīng)過滅菌過程后試驗微生物在培養(yǎng)基中的恢復(fù)6.1.1每批次/批量生物指示物的抗力應(yīng)經(jīng)過試驗，以證明符合本部分及GB18281的其他部分的性能6.1.2滅菌過程中生物指示物的抗力性能在GB18281的其他部分中沒有規(guī)定時，應(yīng)該按照已經(jīng)描述滅菌過程的試驗條款確定。6.1.3某些滅菌過程中使用不符合GB18281要求的生物指示物的最小菌量和抗力，需確定和明示，并被公認。能夠提供以下信息的生物指示物是可以被接受的：a)符合GB18281所有其他要求(包括菌量和抗力的檢測方法);c)當(dāng)菌量和/或抗力(若適用)低于GB18281的相關(guān)部分的規(guī)定值時，產(chǎn)品標(biāo)簽要有明確警示。6.1.4抗力試驗應(yīng)包括活菌計數(shù)和抗力特性的測定(見6.3和6.4)。6.1.5生物指示物的抗力可用FBo應(yīng)確定活菌數(shù)量(見附錄A)。在有效期內(nèi)，制造商或第三方機構(gòu)利用制造商給出的方法檢測出活菌的數(shù)量，應(yīng)介于制造商標(biāo)定值的50%～300%之間。6.4.1抗力特性的確定應(yīng)使用至少以下兩種方法的組合：a)通過建立存活曲線測定D值(見附錄C);b)通過部分陰性分析法測定D值(見附錄D);c)驗證存活-殺滅反應(yīng)特性(見附錄E)。6.4.2由這些方法獲得的數(shù)值應(yīng)在GB18281的其他部分規(guī)定的范圍之內(nèi)。在生物指示物標(biāo)簽上至少標(biāo)有兩個上述數(shù)據(jù)。理想狀態(tài)下，存活菌曲線在整個滅活區(qū)間呈線性關(guān)系。實際上有些誤差，但是線性應(yīng)保持在可接受8范圍之內(nèi)。通過計數(shù)法建立的存活菌的抗力曲線大于5×10',而通過部分陰性分析法基于存活試驗微生物統(tǒng)計分析建立的曲線則低于5×10'。通過兩種方法獲得的D值有良好的相關(guān)性，與線形存活曲線無嚴(yán)重偏差。GB18281的其他部分可增加其他的要求[例如用于濕熱滅菌(ISO11138-3)或者干熱滅菌(ISO11138-4)的生物指示物的z值]。本部分和GB18281的其他部分規(guī)定的抗力特性規(guī)定了測試條件的細節(jié)。6.4.4用所得的全部存活菌數(shù)的常用對數(shù)值的一半對時間作圖，所得的曲線的線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于6.5試驗條件抗力特性的測定應(yīng)在指定的試驗條件下進行，見表2。表2試驗所需要的最少樣本GB18281.1的測試方法檢測樣品的最少量最少暴露次數(shù)檢測樣品的最小總量測試活菌的初始數(shù)量”44附錄C存活曲線方法45附錄D部分陰性分析法附錄E存活-殺滅區(qū)間2最小總數(shù)應(yīng)取決于方法組合的選擇124或204注：對于特殊滅菌過程的一般性檢測方法在GB18281的其余部分有所解釋?！の唇?jīng)過滅菌的染菌載體和生物指示物的活菌數(shù)。6隨后的ts(見表D.1)在暴露條件下額外的檢測不用于計算，但卻是作為評判結(jié)果有效與否的條件。7培養(yǎng)條件7.1培養(yǎng)箱7.1.1培養(yǎng)箱應(yīng)能設(shè)置、監(jiān)測與確認具體的培養(yǎng)條件。7.1.2除了對常規(guī)的溫度進行監(jiān)測以外，培養(yǎng)箱溫度分布也要被驗證。7.2生長培養(yǎng)基7.2.1生長培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)被規(guī)定和證明，可以支持不少于100個試驗微生物接種體的生長。7.2.2標(biāo)簽上應(yīng)包括暴露于滅菌過程后培養(yǎng)條件的信息。7.2.3生長培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)被確認以確保它可以去除任何可能影響測試菌活性的滅菌因子殘留。7.3.1應(yīng)確認培養(yǎng)溫度和時間。7.3.2制造商應(yīng)提供培養(yǎng)指南(見表1)。對于一個公認的滅菌過程例如濕熱滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌，利用合適性能測試菌，分別為嗜熱脂肪芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，其培養(yǎng)時間通常為7d。對于一個新的9(規(guī)范性附錄)試驗活菌數(shù)測定A.1概述A.1.1通過菌落形成單位檢測方法統(tǒng)計染菌載體或已包裝的生物指示物上的試驗活菌。這種方法常用于預(yù)期回收菌量在5×101CFU以上的情況。A.1.2應(yīng)按照A.2～A.4規(guī)定的方法檢查相關(guān)產(chǎn)品恢復(fù)的試驗菌。這種方法適用于處理和未處理的樣A.1.3可以使用已證明的與平板計數(shù)每批量/批次或每次暴露至少使用4個測試樣品。A.3樣品的準(zhǔn)備和培養(yǎng)方法混勻器和/或混合器混勻、漩渦振蕩、超聲波或其他合適將培養(yǎng)物與融化的固體瓊脂培養(yǎng)基混合或涂布在有固體培養(yǎng)基的平板上，菌落數(shù)控制在30CFU~300CFU之間最為精確。A.3.3應(yīng)利用合適的檢測方法統(tǒng)計活菌數(shù)。A.3.4生物指示物制造商應(yīng)確認或提供合適的試驗微生物恢復(fù)培養(yǎng)基，和/或準(zhǔn)備培養(yǎng)基的全部資料A.4培養(yǎng)和計數(shù)A.4.1平板樣本或濾膜應(yīng)在制造商規(guī)定的溫度和時間下培養(yǎng)。通常，嗜熱菌的培養(yǎng)溫度在55℃~60℃下，時間不少于48h;常溫菌的培養(yǎng)溫度在30℃~37℃A.4.2經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r間培養(yǎng)后，應(yīng)對平板或濾膜上的菌落數(shù)進行計數(shù)，再計算出每個合適單位上恢復(fù)試驗微生物的平均數(shù)。(規(guī)范性附錄)用經(jīng)過滅菌處理的載體和初級包裝材料測定細菌的生長抑制B.1概述本方法通過確定載體和初級包裝材料對滅菌后試驗微生物生長可能的抑制效果來測定其在確定滅菌過程中的適用性。這些材料物理性能的適用性應(yīng)經(jīng)過測定。檢測方法在GB18281的其他部分已給出?？沽x的相關(guān)要求見ISO18472。B.2材料菌計數(shù)確定，分成含有少于100CFU活菌的試樣。B.3方法示物相同體積的生長培養(yǎng)基。B.3.2取具有代表性的12個未染菌載體，分成6組，每組2個。應(yīng)用制造生物指示物的材料進行培養(yǎng)溫度的培養(yǎng)基中分別加入一組2個載體(見B.3.1)。記錄完成轉(zhuǎn)移的時間。B.3.6將包含載體樣本的生長培養(yǎng)基在規(guī)定的溫度下培養(yǎng)2h±10min以便載體上的抑制物解除吸附。將此培養(yǎng)基取出培養(yǎng)箱，每管接種不多于100個活菌的試驗微生物懸液，再把此接種細菌的培養(yǎng)基放回培養(yǎng)箱。在正常使用條件下，按確定的恢復(fù)生物指示物的時間進行培養(yǎng)。B.3.7將未經(jīng)暴露過程，包含2個載體的剩余3組轉(zhuǎn)移到3管培養(yǎng)基中作為對照，培養(yǎng)2h±10min,再每管接種不少于100個試驗微生物，在確定時間內(nèi)按照B.3.6相同的方法培養(yǎng)。B.3.9生長培養(yǎng)基對照，將3管無載體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)2h±10min,再每管接種不少于100個試驗微生物，在確定時間內(nèi)按照B.3.6相同的方法培養(yǎng)。方法進行活菌檢查。B.4.2如在載體對照中出現(xiàn)一個或多個“無菌生長”,則表明載體不適合生產(chǎn)染菌載體或者生物指示物。菌載體或者生物指示物。B.5初級包裝材料生長抑制性的確定出的步驟檢測)。生物指示物，則等于正常接觸恢復(fù)培養(yǎng)基面積。檢測樣品應(yīng)該浸沒在生長培養(yǎng)基中。本方法是通過直接計數(shù)菌落數(shù)(CFU)檢測存活試驗微生物的數(shù)量。利用活菌計數(shù)法檢測存活被C.2.1測試樣品如芽孢懸液、染菌載體或已包裝的生物指示物，應(yīng)包含在材料當(dāng)中。a)有一次暴露中樣本未經(jīng)滅菌因子處理(例如0暴露時間);b)至少有一次暴露使活菌數(shù)降低到最初接種量的0.01%(減少4lg);C.3.4如果滅菌因子在試驗樣本上或內(nèi)部有殘留，要盡快去除以免影響測試結(jié)果。如果需要去除程C.3.6應(yīng)用合適的無菌稀釋液調(diào)整菌懸液濃度。將培養(yǎng)物與融化的固體瓊脂培養(yǎng)基混合或涂布在有確定最佳線性曲線。回歸分析時不應(yīng)包括原先細菌數(shù)0.51g范圍內(nèi)的存活數(shù)據(jù)點。計算所得直線斜率G—Z(tlgy);A—Zt;B——Zlgy;計算所需要的數(shù)據(jù)在表C.1給出。GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006回歸分析需要的樣本數(shù)據(jù)暴露間隔(t)mintlgyt?=0.0t?2=0tslgy分配變量ABCGE按照C.3.7,回歸分析時不應(yīng)包括0.5lgy?范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點。b)最佳線性曲線斜率的示例見表C.2和以下計算過程：表C.2斜率的計算示例回收菌量(y)暴露間隔(t)miny?=2.5×10lgy?=6.3979y?=3.4×105lgy?=5.5315tzlgy?=11.0630y?=3.1×10lgy?=4.4914y?=1.7×103lgy?=3.2304ys=1.9×102lgy?=2.2788tslgys=18.2304分配變量A=20B=21.9300C=120G=66.6414E=107.3317‘按照C.3.7,回歸分析時不應(yīng)包括0.5lgy?范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點。GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006驗微生物的數(shù)量。部分陰性分析法是一種部分測試樣沒有表現(xiàn)出生長情況(部分陰性范圍),并且這種D.1.2Holocomb-spearman-karbe法(見D.3.1)與有限Holcomb-spearman-karbe法(見D.3.2)要求覆D.1.3試樣應(yīng)暴露在除時間外的滿足所有過程變量要求確定的暴露條件下，并保持在規(guī)定區(qū)間內(nèi)(穩(wěn)D.2.4生長培養(yǎng)基應(yīng)能滿足培養(yǎng)條D.應(yīng)將試樣分級暴露在除時間外，符合所有過程變量規(guī)定的確定暴露條件下，并保持穩(wěn)定狀態(tài)。試驗樣本總數(shù)量不應(yīng)少于100CFU。每次暴露過程中最少使用20個重復(fù)。D.至少應(yīng)使用5個暴露條件，至少包括1組所有試樣出現(xiàn)有菌生長的試樣、2組部分試樣出現(xiàn)GB18281.1—2015/ISO111培養(yǎng)基應(yīng)該一致。如果液體培養(yǎng)基已經(jīng)由制造商提供在生物指示物里，應(yīng)按照制造商規(guī)定的方法進行。生物指示物制造商應(yīng)確定或者能提供制備一份生物指示物所需的合適回收培養(yǎng)基和/或完整的數(shù)據(jù)(見4.3)D.應(yīng)按照制造商指定的方法為試樣接種。經(jīng)過制造商建議的培養(yǎng)期后，或經(jīng)確認的培養(yǎng)時間，應(yīng)檢查培養(yǎng)基(見7.3)。根據(jù)試驗微生物的特點，液體培養(yǎng)基的渾濁度、培養(yǎng)基表面的生長情況或試管底部沉淀物將表明試驗微生物的生長情況。如果生長培養(yǎng)基屬于生物指示物的一部分，如自含式生物指示物，則應(yīng)按照制造商提供的使用說明判斷試驗微生物是否出現(xiàn)生長情況。D.通過觀察pH值顏色變化，從而顯示自含式生物指示物中試驗微生物的生長情況。D.結(jié)果應(yīng)記錄為在每次亞致死暴露過程中帶有非回收試驗微生物的染菌載體與染菌載體的總D.3.1.2利用HSKP計算D.此計算方法是建立在5組暴露試驗條件的最小數(shù)基礎(chǔ)之上，至少應(yīng)包含以下條件：——其中1組樣品是全部試驗菌生長；——其中2組樣品有部分樣品生長；——其中2組樣品是全部不生長菌(見表D.1)。D.D值的平均值用以下公式計算：N?——每個生物指示物的活菌平均數(shù)，用活菌計數(shù)法計算(見附錄A),計算時需要的數(shù)據(jù)見表D.1HSKP計算時所需要的樣品數(shù)據(jù)暴露在滅菌因子下的時間暴露樣品數(shù)量n無菌生長的樣品數(shù)量rr?注：t?為所有測試樣均出現(xiàn)生長情況的暴露組中，暴露在滅菌因子下的最長暴露時間；t?—ts是部分陰性區(qū)域的增加時間；t?和t,是所有試樣均沒出現(xiàn)生長情況的連續(xù)暴露時間?！と绻闯霈F(xiàn)陰性單元，即，未出現(xiàn)陰性試樣(r=0),且所有單元在暴露時間t?前出現(xiàn)生長情況；同時，在暴露時間ts之后的過程中全部為陰性試樣(r=n?),即未出現(xiàn)生長情況，則測試有效。D.對于暴露在滅菌因子下的暴露時間t?-ts,因子X和γ按如下公式計算：r;——在暴露時間t;時出現(xiàn)未生長試樣的數(shù)量；n;在暴露時間t;下暴露的數(shù)量。從以上X;和y;的計算值中，在每一次暴露時間t;的U.值可以被計算如下：D.任何試樣的平均無菌時間Unsk,可以通過對每一次暴露時間t?-ts的U,值的求和來計算：菌時間的Unsk可以用以下公式計算：D.D的平均值D,可用下面的公式中計算：注：lg(Euler常量)=lg(0.5772)=-0N?每個試樣的初始活菌數(shù)量(見附錄A)。D.3.1.2.7按照以下公式計算D(p=0.05)的95%置信區(qū)間Dat:D.方差V用以下公式計算：D.3.1.3HSKP計算方法舉例表D.2可變的時間間隔和可變的樣本數(shù)量的數(shù)據(jù)示例滅菌劑暴露時間tmin暴露試樣數(shù)量n表現(xiàn)未生長試樣的數(shù)量r,n?=20r?=0n?=19rz=4n?=21ra=8n?=20r?=12GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006表D.2(續(xù))滅菌劑暴露時間min暴露試樣數(shù)量n表現(xiàn)未生長試樣的數(shù)量r,ns=20rs=16ns=20注：為了γ?和γs的計算，兩者的γs=0.2,這是因為在這個例子中表現(xiàn)出未生長的試樣的數(shù)量以恒定比率增長，U?=X;y;=14×0.21=2.94GB18281.1—2015/ISO11138-U?=23×0.17=3.91U?=34×0.22=7.48U?=45×0.2=9.0U?=55×0.2=11.0U?=65×0=0D.用以下公式計算平均無菌時間Unsk:Uhsk=2.94+3.91+7.48+9.0+11.0+0=34.33N?——初始菌量1×10?。D.Date=D±2√V方差V用以下公式計算：每一個時間t;方差公式中的“a”和所有結(jié)果的求和可以用以下公式計算：a=0.25(2.9917+5.7070+6.1137+3.3684+0.0000)D.“a”被計算出后，方差V用以下公式計算：式中：N?=1×10?。=4.5452×(0.19045)2=4.5452×0.03627=0.1649D.按照以下公式計算D(p=0.05)的95%置信區(qū)間Dak:Dale=D±2√VDal=D-2√V=6.54-(2×0.4061)=5.73Dak=D+2√V=6.54+(2×0.4061)=7.35D.3.2LHSKPD.LHSKP計算方法是建立在至少5組暴露試驗條件下的基礎(chǔ)之上，至少包含以下條件： 其中1組樣品應(yīng)是全部試驗菌生長；——其中2組樣品應(yīng)有部分樣品生長；-—其中2組樣品應(yīng)是全部不生長菌(見表D.3)。表D.3相同時間間隔和相同樣品數(shù)量的LHSKP計算所需的數(shù)據(jù)示例滅菌因子下的暴露時間tmin暴露試樣數(shù)量n表現(xiàn)無菌生長的試樣數(shù)量rts(U?)如果未出現(xiàn)陰性單元，即，未出現(xiàn)陰性試樣(r=0),且所有單元在暴露時間t?前出現(xiàn)生長情況；同時，在暴露時間ts之后的過程中全部為陰性試樣(r=nz),即未出現(xiàn)生長情況，則測試有效。D.LHSK方法類似于有限HSKP法(見D.3.1)。不同之處在于，LHSK利用公式計算，該公式要求在每個暴露條件下有相同數(shù)量重復(fù)和在暴露的過程中恒定的時間間隔。D.無菌生長平均時間Unsk用以下公式計算：式中：Uhsk——無菌生長的平均時間；U?——所有試樣顯示無菌生長的第一次暴露；d——暴露條件之間的時間間隔或劑量差別(是一個恒量);n——每次暴露條件下樣品的重復(fù)數(shù)量(每次暴露的相同樣品數(shù)量，例如20);N。每個指示物的平均活菌數(shù)，用活菌計數(shù)法(見附錄A);2r—u?~U,,中包含的所有的陰性數(shù)的總和。D.D的平均值D可以用以下公式計算：D.D.D.D.D.變量V可用以下公式計算：標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)用以下公式計算：D(p=0.05)的95%置信區(qū)間Dat用以下公式計算：Dal=D±2SD置信下限：置信上限：D.3.2.2LHSKP的計算方法示例D.D值用以下公式計算：N?=1×10?,相同時間間隔和相同數(shù)量的樣品的數(shù)據(jù)暴露時間tmin暴露菌片的數(shù)量n不長菌的測試樣品數(shù)量r;t?=20(U)n?=20r?=0(r=0)n?=20rz=1n?=20r?=7n?=20r?=15t?=28(U)ns=20rs=19ts=30(U?)ns=20rs=20(r=n)*GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006表D.4(續(xù))暴露時間tmin暴露菌片的數(shù)量n不長菌的測試樣品數(shù)量r.n?=20r?=20(r=n)*·如果未出現(xiàn)陰性單元，即，未出現(xiàn)陰性試樣(r=0),且所有單元在暴露時間U?前出現(xiàn)生長情況；同時，在暴露時間U,之后的過程中全部為陰性試樣(r=n),即未出現(xiàn)生長情況，則測試有效。D.無菌保證的平均暴露時間Unsk用以下公式計算：U?=30;n=20;N?=1×10?;D.變量V用以下公式計算：標(biāo)準(zhǔn)誤差SD用以下公式計算：D值(p=0.05)的95%置信區(qū)間Dak用以下公式計算：D.3.3SMCPD.經(jīng)過驗證等同于D.3.1和D.3.2的分析方法也可以用于部分陰性數(shù)據(jù)的分析。D.當(dāng)反應(yīng)特性可以預(yù)見時，SMCP作為一種稀釋培養(yǎng)計數(shù)法可以實際應(yīng)用。D.SMCP的計算需要在部分陰性區(qū)域內(nèi)的時間t,表現(xiàn)無菌生長的數(shù)量r,樣品的重復(fù)數(shù)量n,在陰性區(qū)域內(nèi)的一個暴露時間和每一個樣品上的注釋菌量N。。D.為了通過SMCP得到正確的數(shù)據(jù)，D值應(yīng)為在部分陰性區(qū)域內(nèi)的至少三個可重復(fù)循環(huán)的平D.材料的應(yīng)用與D.2相同。D.為了得到95%的置信區(qū)間，每一個暴露條件下要不少于50個重復(fù)，同時為了建立相同于D.3.3.2用SMCP計算試樣應(yīng)在同一批/次的存活-殺滅區(qū)間內(nèi)的確定的暴露條t——暴露時間；lgA——每個樣品中初始染菌量N?的lg值；lgB——暴露t時間之后的含菌量的lg值。D.以下公式可以重新定義部分陰性的數(shù)據(jù)庫：或lgB—lg(lnn/r)或lg[2.303lg(n/r)];N被檢測樣品的數(shù)量除以陰性樣品的數(shù)量的商的自然對數(shù)；N——每一個暴露時間下的試樣的數(shù)量；r——空白或者無菌生長的試樣數(shù)量。D.D(p=0.05)的95%置信區(qū)間Da用以下公式計算：D.上述公式只有在表D.5僅用部分陰性區(qū)內(nèi)一組數(shù)據(jù)計算D值暴露時間tmin暴露測試樣品的數(shù)量n不長菌的測試樣品數(shù)量r;t——暴露時間；N?！總€試樣中初始活菌數(shù)=1×10?;lgB——暴露t時間之后的含菌量的lg值，或lg(lnn/r)或lg[2.303lg(n/r)];n——每一個暴露時間下的試樣的數(shù)量；r——空白或者無菌生長的試樣數(shù)量。時，95%置D.D(p=0.05)的95%置信區(qū)間Dx用以下公式計算。只有當(dāng)時，95%置=0.37+1.96×0.04828=0.465GB18281.1—2015/ISO11138-1:2006=3.92=0.37-1.96×0.04828=0.37-0.095=0.275=4.08(規(guī)范性附錄)存活-殺滅反應(yīng)特性監(jiān)測一次/批生物指示物的存活-殺滅反應(yīng)特性，是為該次/批所有生物指示物性能一致提供保證的又一方法。E.2.1試樣應(yīng)是芽孢懸液、染菌載體或包裝好的生物指示物。E.2.2應(yīng)使用相關(guān)的抗力儀。E.2.3培養(yǎng)箱應(yīng)能設(shè)定特定培養(yǎng)條件的溫度，并能監(jiān)測確認。E.2.4培養(yǎng)基應(yīng)滿足培養(yǎng)條件。E.3方法E.3.1應(yīng)不少于50個相同的試樣，證實存活時間和殺滅時間(見表2)。通過存活曲線(見附錄C)或者部分陰性分析法(見附錄D)計算的D值應(yīng)被用于存活-殺滅反應(yīng)特性的規(guī)定。E.3.2樣品暴露后應(yīng)按照制造商給出的方法進行培養(yǎng)。E.3.3所標(biāo)明的每個生物指示物中試驗微生物存活的暴露時間表示存活特性。所標(biāo)明的每個生物指示物中殺滅所有試驗微生物的暴露時間表示殺滅特性。E.3.4存活-殺滅反應(yīng)特性應(yīng)用相關(guān)的抗力儀測定，使用相關(guān)的抗力儀過程參數(shù)。E.3.5存活時間和殺滅時間的相關(guān)數(shù)值用以下公式計算：殺滅時間≤(lgN。+4)×D值E.3.6每次暴露中使用的樣品數(shù)，應(yīng)根據(jù)所使用的生物指示劑物抗力儀的容積和操作特點確定。在測(規(guī)范性附錄)生物指示物組成部分的關(guān)系生物指示物組成部分的關(guān)系見表F.1。表F.1生物指示物組成部分的關(guān)系圖解組成術(shù)語微生物試驗微生物懸浮在液體中的微生物*試驗微生物懸液?!接種在表面的微生物“染菌載體初級包裝染菌載體單獨包裝的生物指示物包含有處理過的染菌載體的生長培養(yǎng)基處理好的染菌載體的生長性能測試滅菌過程準(zhǔn)備使用的染菌載體和生長培養(yǎng)基結(jié)合的系統(tǒng)自含式生物指示劑注：插圖反映了常見的物理配置的圖形演示。液體狀的試驗微生物懸液將懸浮的培養(yǎng)基作為載體介質(zhì)，而非固體物質(zhì)(見3.2)。根據(jù)微生物的目的是用來保存還是檢測，采用的液體可能會發(fā)生變化。如果用于監(jiān)測滅菌過程，可以被定義為一種生物指示物。在某些情況下，表面可以作為檢測目的的產(chǎn)品。[1]ISO31(allparts)Quantitiesandunits[2]ISO690;1987Documentation—Bibliographicreferences—Content,formandstructure[3]ISO1000:1992SIunitsandrecommendationsfortheuseoftheirmultiplesandofcertainotherunits[4]ISO1000:1992/Amd1:1998SIunitsandrecommendationsfortheuseoftheirmultiplesandofcertainotherunits—Amendment1[5]ISO10241:1992Internationalterminologystandards—Preparationandlayout[6]ISO/TS11139Sterilizationofhealthcareproducts—Vocabulary[7]ISO14161:2000Sterilizationofhealthcareproducts-Biologicalindicators—Guidancefortheselection,useandinterpretationofresults[8]ISO14937:2000Sterilizationofhealthcareproducts—Generalrequirementsforcharacter-izationofasterilizingagentandthedevelopment,validationandroutinecontrolofasterilizingprocessformedicaldevices[9]IEC60027(allparts)Lettersymbolstobeusedinelectricaltechnology[10]ARMITAGE,P.andALLEN,I.,MethodsofEstimatingtheLD50inQuantalResponseData,J.ofHyg.Vol.XLVIII,pp.298-322,1950.[11]COCHRAN,W.G.,EstimationofBacterialDensitiesbyMeansofthe“MostProbableNumber”,Biometrics,Vol.6,No.1,pp.105-116,1950.[12]GADDUM,J.H.,Reportsonbiologicalstandards,III,Methodsofbiologicalassaydependingonaquantalresponse,Spec.Rep.Ser.Med.Res.Council,London,No.183,1933.[13]HALVORSON,H.O.andZIEGLER,N.R.,Applicationofstatisticstoproblemsinbacteri-ology,J.Bact.25,pp.101-121,1933.[14]HOLCOMB,R.G.andPFLUG,L.J.,TheSpearman-Karbermethodofanalyzingquantalas-saymicrobialdestructiondata,in;PflugI.J.,ed.,SelectedPapersonofSterilizationProcesses,5thedn.,Minneapolis,EnvironmentalSterilizationLaboratory,pp.83-[15]JOHNSON,E.A.andBROWN,B.,Wm.,Jr.,TheSpearmanEstimatorforSerialDilutionsAssays,Biometrics,Vol.17,pp.79-88,1961.[16]LEWIS,J.C.,TheEstimationofDecimalReduction