以mTOR為靶點的抗EV71化合物的設計、合成及生物活性評價

以mTOR為靶點的抗EV71化合物的設計、合成及生物活性評價手足口?。╤and,footandmouthdisease,HFMD）是一種嚴重威脅人類特別是嬰幼兒生命健康的傳染病。近幾十年來,HFMD在全球各地廣泛傳播。國家衛(wèi)生健康委員會報告顯示,截至2015年,我國手足口病累計發(fā)病1176萬余例,其中死亡3361例,年均發(fā)病率約為117/10萬,居丙類傳染病報告發(fā)病數(shù)之首。隨著我國生育政策的放開,手足口病的防控形勢將日趨嚴峻。引發(fā)手足口病的主要病原體為腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）,其具有高度的傳染性和變異性。目前臨床上尚無能夠有效抑制EV71的抗病毒藥物,多數(shù)藥物還處于研發(fā)階段,因此研發(fā)高效抗EV71藥物的需求尤為迫切。當前,抗病毒藥物的作用靶點大多集中于病毒本身,由于病毒的高度變異性使該類藥物極易出現(xiàn)耐藥性。而基于宿主的抗病毒藥物作用機制主要是通過抑制宿主細胞內(nèi)病毒所需蛋白質(zhì)或分子,以影響病毒生命周期,進而達到抑制病毒的目的?；谒拗骷毎邪l(fā)抗病毒藥物不僅能解決耐藥性問題,同時還具有廣譜適用性。目前,已成為抗病毒藥物研發(fā)領(lǐng)域的新趨勢。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）,是哺乳動物宿主細胞內(nèi)的一種重要功能蛋白,在感受細胞內(nèi)營養(yǎng)信號,調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯的過程中發(fā)揮重要作用。當病毒侵染宿主細胞后,會觸發(fā)細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路,進而激活mTOR,為病毒的RNA復制和蛋白質(zhì)合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。通過抑制宿主細胞mTOR蛋白,可以阻止病毒的RNA復制和蛋白質(zhì)合成,抑制病毒感染。本課題以mTOR為作用靶點,基于其蛋白結(jié)構(gòu),開發(fā)mTOR抑制劑以得到全新廣譜且不耐藥的抗EV71藥物。Torin2是一種活性較好的mTOR抑制劑(IC₅₀=0.25nM)。在活性篩選過程中發(fā)現(xiàn),Torin2對EV71具有較強的抑制活性(IC₅₀=0.01μM)。而Torin2的水溶性較差,導致藥物吸收代謝性質(zhì)較差,難以進一步成藥?；谝陨涎芯炕A(chǔ),本論文以Torin2為先導化合物,對其進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,以期獲得良好活性和成藥性的全新結(jié)構(gòu)mTOR抑制劑。通過分析Torin2與mTOR蛋白之間的相互作用方式,發(fā)現(xiàn)喹啉環(huán)上的氮原子與mTOR蛋白ATP結(jié)合位點上VAL2240氨基酸形成氫鍵,是Torin2發(fā)揮活性的關(guān)鍵;而三氟甲基取代部分則對提高藥物代謝性質(zhì)具有促進作用。因此決定保留這兩部分,對原有六元內(nèi)酰胺環(huán)進行改變,分別采用柔性開環(huán)側(cè)鏈和五元環(huán)替換原有六元內(nèi)酰胺環(huán),期望通過改變原有三環(huán)剛性平面結(jié)構(gòu),降低分子間作用力,改善其溶解性等藥物理化性質(zhì),同時對原有吡啶酰胺側(cè)鏈進行替換,考察不同電性、不同環(huán)系取代基對活性的影響?；谝陨显O計思路,共設計了喹啉衍生物類、五元環(huán)類和Torin2衍生物類三大類化合物,經(jīng)過計算機虛擬篩選,結(jié)合合成可行性分析,最終選擇喹啉基丁烯酮類28個,噁唑并喹啉類24個,Torin2衍生物類46個進行合成。根據(jù)化合物類別不同,共設計了6條合成路線,完成了98個新化合物的合成工作,且結(jié)構(gòu)全部經(jīng)MS、¹HNMR進行確證。為了全面考察化合物的生物活性,通過開展體外抗EV71活性測試、mTOR激酶抑制活性測試、mTORC1/mTORC2抑制活性實驗,分別在細胞水平、酶水平和分子水平對所設計的化合進行了全面的生物活性評價。體外抗EV71活性測試結(jié)果顯示,喹啉基丁烯酮類和噁唑并喹啉兩類化合物中只有8個化合物（HTL-2-34、HTL-2-35、HTL-2-38、HTL-3-26、HTL-4-32、HTL-5-21、HTL-5-23、HTL-6-30）顯示出了對EV71的中等抑制活性,而大部分Torin2衍生物類化合物則顯示出了較強的EV71抑制活性,其中12個化合物（HTL-6-45、HTL-6-48、HTL-6-49、HTL-7-01、HTL-7-03、HTL-7-06、HTL-7-11、HTL-7-15、HTL-7-16、HTL-7-19、HTL-7-28、HTL-7-29）活性與Torin2接近,IC₅₀處于同一數(shù)量級。從三類目標化合物中選擇活性較好的33個化合物進行了mTOR激酶抑制活性測試和mTORC1/mTORC2抑制活性實驗,其中mTOR激酶抑制活性結(jié)果與體外抗EV71活性測試結(jié)果總體呈現(xiàn)正相關(guān)性,Torin2衍生物類化合物較其它兩類化合物相比也顯示了較強的mTOR激酶抑制活性,進一步證明了所合成化合物的抗EV71作用是通過抑制mTOR激酶而實現(xiàn)的。mTORC1/mTORC2抑制活性實驗結(jié)果顯示,在挑選的喹啉基丁烯酮類和噁唑并喹啉類化合物中,只有HTL-5-21對mTORC1/mTORC2具有雙重抑制作用,而大部分細胞活性較好的Torin2衍生物類化合物則均能同時抑制mTORC1和mTORC2,這也間接解釋了此類化合物較其它兩類化合物活性更為突出的原因。為全面考察所設計化合物的成藥性,除了進行相關(guān)活性測試外,本文還對活性較好的5個優(yōu)選化合物進行了體內(nèi)藥物代謝實驗,實驗結(jié)果顯示,除陽性藥外,3個化合物（HTL-6-28、HTL-7-03和HTL-7-17）的口服生物利用度大于20%,具有一定的成藥潛力。另外,水溶性是影響藥物成藥的重要理化性質(zhì),根據(jù)文獻所述,Torin2雖然具有良好的活性和藥物代謝性質(zhì),但其水溶性較差（水溶解度僅為1.29μg/ml）,成為了制約其進一