兩種豬腹瀉相關(guān)病毒病原學(xué)特征研究

兩種豬腹瀉相關(guān)病毒病原學(xué)特征研究仔豬腹瀉持續(xù)在中國、韓國以及美國等地爆發(fā),發(fā)病仔豬呈現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀,嚴(yán)重的能導(dǎo)致仔豬迅速脫水而引起死亡,死亡率較高,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前,引起仔豬腹瀉的病原還沒有完全弄清,各國學(xué)者普遍認(rèn)為豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV),豬傳染性胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritisViru,TGEV),輪狀病毒(Rotavirus,RV)以及其它腸道病毒性病原等為豬腹瀉的主導(dǎo)。但是一些免疫過的豬場又會重新暴發(fā)腹瀉,該現(xiàn)象引起各國學(xué)者反思。近年來一些新發(fā)腹瀉病毒如豬丁型冠狀病毒(Porcinedeltacoronavirus,PDCoV),哺乳動物呼腸孤病毒(Mammalianorthoreovirus,MRV)等先后被報道,引起了人們的關(guān)注。本研究主要對兩株新分離豬腹瀉相關(guān)病毒的生物學(xué)特征開展了一系列研究。2013年,作者從腹瀉仔豬糞便中分離到一株能在Vero細(xì)胞上增殖,并引起細(xì)胞腫脹、變圓等病變的未知病毒。通過RT-PCR檢測,PEDV、TGEV、PDCoV以及RV均呈陰性,最終利用高通量測序技術(shù)確定該病毒為3型呼腸孤病毒,命名為MRV-ZJ2013。病毒大小約70-100nm、無囊膜,感染細(xì)胞后整齊排列在細(xì)胞質(zhì)中。MRV-ZJ2013毒株感染Vero細(xì)胞(MOI=0.01)后呈“S”型增長,在感染后第36h病毒量達(dá)到最高值(108.33TCID50/mL),隨后進(jìn)入平臺期。MRV-ZJ2013對溫度和紫外線比較敏感,在100℃處理1h或254nmUV照射30min后病毒完全失活。致病性試驗顯示,MRV-ZJ2013毒株感染組出生仔豬后出現(xiàn)輕微腹瀉、軟便、食欲不振等現(xiàn)象,有部分試驗豬(3/6)在感染后的第1或2d有排毒現(xiàn)象。感染后,仔豬體內(nèi)抗MRV3IgG水平顯著升高,直到感染后第14d,體內(nèi)仍能檢測到抗體。宰殺癥狀明顯的仔豬,解剖發(fā)現(xiàn)其腸系膜輕微充血。組織病理切片顯示MRV3感染組有小腸絨毛表層脫落,內(nèi)層出現(xiàn)空洞等現(xiàn)象。免疫組化染色顯示腸絨毛上存在病原。上述結(jié)果表明,MRV-ZJ2013毒株毒力較弱,盡管能夠產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但不能引起明顯癥狀。分子克隆MRV-ZJ2013基因組10個片段并上傳至GenBank中(登錄號為KY419120至KY419129)。MRV-ZJ2013毒株L1,M2,S1節(jié)段與3型代表株T3D相似度最高,其它的7個片段與1型代表毒株(T1L)相似度最高。氨基酸序列對比結(jié)果相似,λ1,μ1,μNS和σ1蛋白(分別由L1,M2,M3和S1編碼)氨基酸序列與T3D毒株序列相似度最高,其它蛋白氨基酸序列與T1L毒株相似度最高。與所有已發(fā)表的豬MRV基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn),MRV-ZJ2013毒株與美國毒株相似度最低;MRV-ZJ2013毒株S1基因進(jìn)化樹結(jié)果顯示其屬于血清型3型,與亞洲分離的豬呼腸孤病毒親緣關(guān)系最近;MRV-ZJ2013毒株基因組中有5個片段(M1,S3,M3,S2和S4)與中國蝙蝠MRV親緣關(guān)系最近,L3,M2和S1與豬MRV親緣關(guān)系最近,而L1和L2基因則與水貂MRV親緣關(guān)系最近。將10個階段串聯(lián)之后利用RDP4重組分析,結(jié)果顯示MRV-ZJ2013毒株S2,S3,L2,L3,M2,S1等片段存在重排,重排親本可能來源于蝙蝠MRV、豬MRV、水貂MRV和未知來源MRV。因此,推測MRV-ZJ2013毒株可能是由蝙蝠MRV,豬MRV以及水貂MRV基因組重排而來。針對L1基因設(shè)計特異性引物建立豬呼腸孤病毒巢式RT-PCR檢測方法,對從浙江、江西、山東、河南、黑龍江等省58個豬場共采集224份腹瀉仔豬糞便樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示55個豬場(55/58,94.8%)共檢出147個陽性樣品(147/224,65.6%),其中第一輪從16個豬場檢出陽性樣品28個(28/224,12.5%)。建立基于衣殼蛋白δ1蛋白為包被抗原的間接ELISA(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測方法,并檢測從江蘇、湖南、江西、河南、浙江、黑龍江和山東等省收集的1037份不同年齡段豬血清樣品,MRV3抗體檢出率為77%(OD450nm平均值為0.69±0.32)。母豬和1周齡以內(nèi)仔豬血清樣品陽性率和抗體平均水平都最高,后備母豬抗體水平最低。東部各省中,黑龍江省樣品陽性率以及抗體平均水平均低于其它省份,而其它省份之間差異不顯著。綜合上述數(shù)據(jù),本研究認(rèn)為MRV廣泛存在于中國東部豬場。豬丁型冠狀病毒(Porcinedeltacoronavirus)屬冠狀病毒科(Coronaaviridae),冠狀病毒亞科(Coronaviriaae),是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類冠狀病毒,能感染各年齡段的豬群,引起腹瀉、嘔吐和脫水癥狀。本研究利用體外模型對PDCoV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程進(jìn)行研究。PDCoV感染5h后,細(xì)胞外開始檢測到病毒,說明此時子一代病毒完成組裝并釋放到胞外。透射電鏡觀察PDCoV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過程發(fā)現(xiàn),PDCoV通過膜融合進(jìn)入細(xì)胞,隨后在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制和翻譯。病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中間體(ERGIC)完成病毒組裝,隨后被轉(zhuǎn)運到高爾基體中完成“成熟”過程,最終被囊泡運輸排出細(xì)胞。PDCoV感染LLC-PK1和IPEC-J2細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)膜重排(Membraner