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1豬A型塞內(nèi)卡病毒分離鑒定技術(shù)規(guī)范本文件適用于豬A型塞內(nèi)卡病毒的病原分離和鑒定GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范4縮略語(yǔ)DNAmarker：DNA相對(duì)分子質(zhì)量5.1主要試劑25.2主要儀器設(shè)備穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽、凝膠成像儀、倒置生物用一次性注射器吸取臨床發(fā)病豬只水泡液0.5mL~1mL，并將水泡液裝入保存管，水泡液4℃3000r/min離心10min，以0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌后，-73按常規(guī)方法將PK-15細(xì)胞分裝在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶若接種細(xì)胞第1代72h后未出現(xiàn)明顯CPE，按上述收毒方法收獲細(xì)胞/病毒液再接種生長(zhǎng)良好的單層PK-15細(xì)胞進(jìn)行盲傳，即1mL第一代細(xì)胞/病毒液加4mL細(xì)胞維持液，37°C培養(yǎng)。如此盲傳3代~5代，再進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR引物針對(duì)SVAVP1蛋白基因保守區(qū)域，引物取，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取核酸反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20反應(yīng)體系中各組分見(jiàn)表2，反應(yīng)體系可根據(jù)表中各組分比例4體積(μL）BstDNA聚合酶緩沖液BstDNA聚合酶12221反應(yīng)體系見(jiàn)表3，反應(yīng)體系可根據(jù)表中各組分比體積(μL）5131159結(jié)果判定9.1RT-LAMP9.2RT-PCR9.3病毒分離鑒定6NaCl0.5mol/L（pH8.0）乙二胺四待上述混合物完全溶解后，加蒸餾水至1000mL，置4℃冰箱中備用，如配制1%的瓊脂糖凝膠和用A.31.0%瓊脂糖凝膠板制備微波爐充分溶解后，加入溴化乙錠，倒入凝膠板中，在距離底板0.5mm的位置上放置梳子，凝膠7CCGATCTCGACTACTGAATGTAATTAAGGTACTGGAGAAGCCACAGCAACAGGTGCACAGCAGGACGATGGTTACTTTTGTCTTCTAACACCGCTTCCCGACCCGCTACTCGTTTCGGCCTGTACGTCAACCCGTCTGACAGTTACAGTTTGGCCTGTTTCACTTACTTTAGATCAGACCTTGAAGTCACGGTGGTCTCACTGGAGATTTGGAATTCGCCGTGGGGTGGTTC

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