細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)一

關(guān)于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)一2第一節(jié)

培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)第2頁,共105頁，2024年2月25日，星期天3主要內(nèi)容（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程第3頁,共105頁，2024年2月25日，星期天4體外培養(yǎng)的細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞的比較相似：仍存在細(xì)胞和細(xì)胞、

細(xì)胞和基質(zhì)的相互關(guān)系單個細(xì)胞雖能生長繁殖,但不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)，

當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動停止

細(xì)胞相互溝通生物信息的結(jié)果對細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性

差異：失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，

分化減弱或不明顯

第4頁,共105頁，2024年2月25日，星期天5細(xì)胞外基質(zhì)存在于組織中，由細(xì)胞合成并分泌至胞外的成分，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，包括纖維性成分(膠原蛋白、彈性蛋白和網(wǎng)織蛋白)、連接蛋白(纖維粘連蛋白、層粘連蛋白)和空間充填分子(主要為糖胺聚糖)等，其對細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動。第5頁,共105頁，2024年2月25日，星期天6

1．影響細(xì)胞的存活、生長與死亡

正常真核細(xì)胞，大多須粘附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為定著依賴性（anchoragedependence）。例如，上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞一旦脫離了細(xì)胞外基質(zhì)則會發(fā)生程序性死亡。

第6頁,共105頁，2024年2月25日，星期天72．決定細(xì)胞的形狀細(xì)胞呈單個游離狀態(tài)時多呈球形。同一種細(xì)胞在不同的細(xì)胞外基質(zhì)上粘附時可表現(xiàn)出完全不同的形狀。細(xì)胞外基質(zhì)決定細(xì)胞的形狀這一作用是通過其受體影響細(xì)胞骨架的組裝而實(shí)現(xiàn)的。第7頁,共105頁，2024年2月25日，星期天83．控制細(xì)胞的分化細(xì)胞通過與特定的細(xì)胞外基質(zhì)成分作用而發(fā)生分化。例如，成肌細(xì)胞在纖粘連蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在層粘連蛋白上則停止增殖，進(jìn)行分化，融合為肌管。第8頁,共105頁，2024年2月25日，星期天94．參與細(xì)胞的遷移

細(xì)胞外基質(zhì)可以控制細(xì)胞遷移的速度與方向，并為細(xì)胞遷移提供“腳手架”。細(xì)胞的遷移依賴于細(xì)胞的粘附與細(xì)胞骨架的組裝。細(xì)胞粘附于一定的細(xì)胞外基質(zhì)時誘導(dǎo)粘著斑的形成，粘著斑是聯(lián)系細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架“鉚釘”。第9頁,共105頁，2024年2月25日，星期天10（一）體內(nèi)、外細(xì)胞的差異體內(nèi)：神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間相互影響體外：缺乏動態(tài)平衡的穩(wěn)定環(huán)境發(fā)生的變化分化現(xiàn)象減弱形態(tài)功能趨于單一化一定時間后死亡或者轉(zhuǎn)化獲得不死性第10頁,共105頁，2024年2月25日，星期天11體外培養(yǎng)的細(xì)胞仍具有研究的意義許多性狀仍與體內(nèi)相同如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動，細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，存在相應(yīng)基因關(guān)閉／開啟引起的現(xiàn)象，在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達(dá)與調(diào)控提供線索。第11頁,共105頁，2024年2月25日，星期天12（二）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時不能按體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定懸浮型：見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，白血病細(xì)胞，骨髓細(xì)胞或免疫細(xì)胞，不需要細(xì)胞間和細(xì)胞與培養(yǎng)表面的接觸。第12頁,共105頁，2024年2月25日，星期天13貼附型細(xì)胞的分類成纖維細(xì)胞型上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型第13頁,共105頁，2024年2月25日，星期天14成纖維細(xì)胞型梭型或不規(guī)則三角形，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。凡培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維類似時皆可稱為成纖維細(xì)胞。

第14頁,共105頁，2024年2月25日，星期天15第15頁,共105頁，2024年2月25日，星期天16上皮型細(xì)胞：扁平不規(guī)則多角形，彼此緊密相連。生長時呈膜狀移動，細(xì)胞很少單獨(dú)行動。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。第16頁,共105頁，2024年2月25日，星期天17游走細(xì)胞型：散在生長，不連成片，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

第17頁,共105頁，2024年2月25日，星期天18多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

第18頁,共105頁，2024年2月25日，星期天19（三）培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程第19頁,共105頁，2024年2月25日，星期天20培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。種類、供體的年齡等。人胚成纖維細(xì)胞可傳30～50代，約150～300個增殖周期，能維待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞僅可傳幾代供體為成體或衰老個體，則生存時間較短；肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。第20頁,共105頁，2024年2月25日，星期天21生命周期的三個階段原代培養(yǎng)期

傳代期

衰退期

第21頁,共105頁，2024年2月25日，星期天22原代培養(yǎng)：從體內(nèi)取出組織,分離出細(xì)胞、接種培養(yǎng)到第一次傳代。原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。特點(diǎn)細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous）細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實(shí)驗(yàn)對象第22頁,共105頁，2024年2月25日，星期天23原代培養(yǎng)分為兩種方法直接接種組織塊由組織分離出細(xì)胞后接種第23頁,共105頁，2024年2月25日，星期天24第24頁,共105頁，2024年2月25日，星期天25組織塊接種：牛胎兒成纖維細(xì)胞第25頁,共105頁，2024年2月25日，星期天26傳代期：原代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（CellLine）。此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在原代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。第26頁,共105頁，2024年2月25日，星期天27衰退期：增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。少數(shù)情況下，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性質(zhì)（Malignancy）。這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。第27頁,共105頁，2024年2月25日，星期天28細(xì)胞的一代生存期1．潛伏期（LatentPhase）

2．指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）3．停滯期（StagnatePhase）

第28頁,共105頁，2024年2月25日，星期天291．潛伏期（LatentPhase）細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先是懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著細(xì)胞貼附于底物表面，稱貼壁，各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。經(jīng)過延展過程變成極性細(xì)胞可運(yùn)動，基本無增殖。細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。第29頁,共105頁，2024年2月25日，星期天30不同的細(xì)胞貼壁的時間不同如巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等粘附能力強(qiáng),

能在數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)粘附到固相表面

如神經(jīng)元細(xì)胞、羊水細(xì)胞，粘附能力弱,

需要數(shù)小時乃至更長的時間才能粘附到固相表面可利用此特點(diǎn)（粘附：快、牢；慢、弱）

分離、純化細(xì)胞第30頁,共105頁，2024年2月25日，星期天31第31頁,共105頁，2024年2月25日，星期天32貼附過程：3步貼附因子粘附細(xì)胞開始附著細(xì)胞進(jìn)一步

牢固附著—伸展第32頁,共105頁，2024年2月25日，星期天33細(xì)胞貼壁影響因素生物因素：血清、培養(yǎng)液中的促附著因子機(jī)械、物理等其他因素：流動：培養(yǎng)液流動可阻止細(xì)胞附著離心：促進(jìn)附著低溫：可抑制附著第33頁,共105頁，2024年2月25日，星期天34加速細(xì)胞貼壁的措施包被培養(yǎng)皿底面：對分化程度高、生長能力差的細(xì)胞可在培養(yǎng)瓶皿表面包被有利于細(xì)胞粘附和生長的生物活性物質(zhì)如:--通過其所帶電荷先吸附培養(yǎng)皿底部,培養(yǎng)的細(xì)胞再與其結(jié)合。血清內(nèi)含有多種能夠促進(jìn)細(xì)胞粘附的成分減少接種時細(xì)胞懸液的量，待細(xì)胞粘附和貼壁之后，再補(bǔ)充足夠的培養(yǎng)液第34頁,共105頁，2024年2月25日，星期天35培養(yǎng)液中離子成分及其濃度如，培養(yǎng)液中的Ca含量過低時不利于

細(xì)胞的粘附、貼壁和鋪展合適的培養(yǎng)溫度第35頁,共105頁，2024年2月25日，星期天36細(xì)胞鋪展（伸展）

(spread)

進(jìn)行生命活動的一種基本的生長特點(diǎn)或生長行為鋪展?fàn)顩r制約細(xì)胞的分裂增殖活動鋪展的過程細(xì)胞先由圓形變?yōu)閳A餅形(放射狀鋪展細(xì)胞)逐漸鋪開伸展成為扁平的極性細(xì)，鋪展的越好與生長基質(zhì)的表面接觸面越大極性細(xì)胞就是細(xì)胞在體外的特征性細(xì)胞形態(tài)鋪展?fàn)顩r與細(xì)胞的生長有密切關(guān)系只有當(dāng)細(xì)胞鋪展到合適的程度DNA合成才開始進(jìn)行第36頁,共105頁，2024年2月25日，星期天372，指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）是細(xì)胞增值最旺盛的階段，是細(xì)胞一代中活力最好的時期,是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。以細(xì)胞分裂指數(shù)（MitoticIndex：MI）作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的重要標(biāo)志。即每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)低，永生細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響

第37頁,共105頁，2024年2月25日，星期天382，指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）接觸抑制（ContactInhibition）由于細(xì)胞增殖而的相互接觸，進(jìn)而抑制細(xì)胞的運(yùn)動和增殖，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。接觸抑制是創(chuàng)面愈合過程中一個十分有趣的現(xiàn)象。當(dāng)周邊的上皮向創(chuàng)面中央爬行時,一旦上皮細(xì)胞互相接觸,就停止分化和增殖。該現(xiàn)象就叫"接觸抑制"。因此,創(chuàng)面上不會出現(xiàn)多余的皮贅。這也是一種十分巧妙和"神秘"的調(diào)控現(xiàn)象。

第38頁,共105頁，2024年2月25日，星期天39接觸抑制（Contactinhibition）細(xì)胞相互接觸時，將停止增長；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；轉(zhuǎn)化的細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長。第39頁,共105頁，2024年2月25日，星期天403．停滯期（StagnatePhase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動，培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。第40頁,共105頁，2024年2月25日，星期天41第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)第41頁,共105頁，2024年2月25日，星期天42主要內(nèi)容（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品（三）細(xì)胞培養(yǎng)液（四）細(xì)胞的原代、繼代培養(yǎng)（五）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇（六）細(xì)胞污染第42頁,共105頁，2024年2月25日，星期天43（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需條件1營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境

溫度:

37℃

O2

CO2:

5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-

pH:

7.2-7.4

滲透壓

濕度3無污染4無毒第43頁,共105頁，2024年2月25日，星期天44（二）細(xì)胞培養(yǎng)所需用品：無菌間、超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動吸引器，培養(yǎng)板，凍存管第44頁,共105頁，2024年2月25日，星期天451．超凈工作臺(Hood):A.水平流超凈工作臺(Horizontalairflow)B.垂直流超凈工作臺(Lateralairflow)C.層流空氣超凈工作臺(Laminarairflow)第45頁,共105頁，2024年2月25日，星期天46水平流超凈工作臺背送風(fēng)，但病毒是不實(shí)用的，容易對人有害第46頁,共105頁，2024年2月25日，星期天47垂直流超凈工作臺第47頁,共105頁，2024年2月25日，星期天48第48頁,共105頁，2024年2月25日，星期天49超凈工作臺的清潔維護(hù)：

保持工作臺上無死角，讓空氣得到充分過濾，即試驗(yàn)完畢后，將所有的用品收藏起來，工作臺上只留有酒精燈及橡皮頭。工作前和工作完畢都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培養(yǎng)液等物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)先用水擦，然后用酒精再擦。還需定期檢測工作臺濾器過濾的效率。第49頁,共105頁，2024年2月25日，星期天50整個接種操作應(yīng)在近火焰處進(jìn)行，且動作要迅速

正

確

錯

誤第50頁,共105頁，2024年2月25日，星期天51接種過程中盡可能達(dá)到懸空要求防止操作帶來的污染正

確

錯

誤第51頁,共105頁，2024年2月25日，星期天52接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯

誤第52頁,共105頁，2024年2月25日，星期天53瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤第53頁,共105頁，2024年2月25日，星期天542，CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，100%濕度，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。第54頁,共105頁，2024年2月25日，星期天55濕度以第二天第一次開門，能看到玻璃門上的水珠第55頁,共105頁，2024年2月25日，星期天563．消毒設(shè)備：

A.高壓消毒鍋（Autoclave）：110oC，15lb，20分鐘，適合于橡皮、紙、布、塑料制品和液體（9lb，10分鐘）等。消毒后必須在烤箱中低溫烤干。

B.干熱消毒箱：150-200oC，2-3小時。

適合于玻璃器皿、金屬器械等。C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、動物皮毛

等，酒精濃度為75－95％。

第56頁,共105頁，2024年2月25日，星期天57高壓消毒鍋第57頁,共105頁，2024年2月25日，星期天58

D.濾膜過濾：正壓過濾:

蠕動泵通入培液；通入氣體。

負(fù)壓過濾：用水泵或油泵抽濾。

濾膜孔徑為0.22μm，為延長濾膜壽命可同時添加0.45μm和1.2μm濾膜。第58頁,共105頁，2024年2月25日，星期天59濾膜濾器第59頁,共105頁，2024年2月25日，星期天60兩種：1，一次性濾器；2，買濾膜自己裝（需要消毒）第60頁,共105頁，2024年2月25日，星期天614.蒸餾器與去離子純水系統(tǒng)：

1）用三蒸水，通過去離子純水系統(tǒng)，電阻需達(dá)到170萬歐姆以上。

2）專門的去離子水系統(tǒng)5.倒置相差顯微鏡：需用相差鏡頭和濾光片，集光器的選擇應(yīng)與接物鏡的放大倍數(shù)一致。第61頁,共105頁，2024年2月25日，星期天62純水系統(tǒng)

第62頁,共105頁，2024年2月25日，星期天63倒置相差顯微鏡1，物鏡朝上2，工作距離大3，相差干涉第63頁,共105頁，2024年2月25日，星期天645，培養(yǎng)器皿第64頁,共105頁，2024年2月25日，星期天65培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶第65頁,共105頁，2024年2月25日，星期天665，恒溫水浴箱，血清滅活，細(xì)胞解凍第66頁,共105頁，2024年2月25日，星期天676，移液管第67頁,共105頁，2024年2月25日，星期天68第68頁,共105頁，2024年2月25日，星期天69第69頁,共105頁，2024年2月25日，星期天707，低速離心機(jī)第70頁,共105頁，2024年2月25日，星期天71（三）細(xì)胞培養(yǎng)基干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基種類RPMI-1640（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、DMEM-低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）、McCoys5A、M199、F12等第71頁,共105頁，2024年2月25日，星期天72Gibco干粉培養(yǎng)液液體培養(yǎng)液1，培養(yǎng)在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3,丙酮酸鈉、抗生素等第72頁,共105頁，2024年2月25日，星期天73Hyclone胎牛血清Gibco胎牛血清血清使用前要根據(jù)需要的量進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融，血清保存要放置－20℃第73頁,共105頁，2024年2月25日，星期天74培養(yǎng)液的選擇沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考

選擇培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)液。可以查閱參考文獻(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時咨詢。

其它實(shí)驗(yàn)室慣用的培養(yǎng)液不妨一試，許多培養(yǎng)液可以適合多種細(xì)胞。

用多種培養(yǎng)液培養(yǎng)目的細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法，但比較繁瑣。

總之，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的首選是AIMV培養(yǎng)基（SFM）。第74頁,共105頁，2024年2月25日，星期天75血清使用注意事項(xiàng)血清必須貯存于–20～-70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。血清解凍步驟(逐步解凍法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由–20℃直接至37℃解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。熱滅活（heat-inactivation）是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍之血清。目的是使血清中之補(bǔ)體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闀斐沙恋砦镲@著增多，且會影響血清之品質(zhì)。勿將血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)第75頁,共105頁，2024年2月25日，星期天76補(bǔ)體系統(tǒng)原指血清中引起免疫性細(xì)胞溶解（抗體包裹細(xì)胞溶解）的不耐熱因子；現(xiàn)指至少由20種截然不同的血清蛋白組成的完整功能相關(guān)系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)主要的功能是通過在病原體表面的作用，破壞其細(xì)胞膜或者“調(diào)理”病原體表面供巨噬細(xì)胞吞食，此外還能引起發(fā)炎反應(yīng)。加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。

第76頁,共105頁，2024年2月25日，星期天77凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沉淀物，因?yàn)闀枞^濾膜。

顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會影響細(xì)胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號的血清。血清沉淀物

第77頁,共105頁，2024年2月25日，星期天78谷氨酰胺L－谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

配制方法為：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入0.5-2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4mM第78頁,共105頁，2024年2月25日，星期天79酚紅大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH指示橙色表示中性pH黃色代表酸性pH紫色表示堿性pH在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用，為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。第79頁,共105頁，2024年2月25日，星期天80細(xì)胞消化液由組織中分離細(xì)胞和細(xì)胞傳代常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液，單獨(dú)或混合使用第80頁,共105頁，2024年2月25日，星期天81胰蛋白酶溶液主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散消化細(xì)胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用EDTA·4Na溶液一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便常用工作液濃度為0.02%。注意：使用EDTA處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響細(xì)胞生長第81頁,共105頁，2024年2月25日，星期天82（四）細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)第82頁,共105頁，2024年2月25日，星期天83鼠胎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)取材：用頸椎脫位法使孕鼠迅速死亡。把整個孕鼠浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀在軀干中部環(huán)行剪開皮膚，剖腹取出子宮置于無菌平皿中。用消過毒的剪刀剪開子宮，取出鼠胎，剪去頭、爪，以平衡鹽溶液洗去血污切割：用PBS將取出的組織塊清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細(xì)將組織反復(fù)剪碎，直到成1mm3左右的小塊，再用平衡鹽溶液清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清消化、接種培養(yǎng)：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量），與組織塊混勻。置37℃水浴，觀察消化情況（每隔幾分鐘搖動一下試管），靜止，吸去上清，加入5～10ml細(xì)胞培養(yǎng)液，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第83頁,共105頁，2024年2月25日，星期天84全量換液和半量換液換液時機(jī)的選擇：培養(yǎng)液pH值：細(xì)胞生長旺盛，代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，pH值下降，營養(yǎng)液酸化變黃。細(xì)胞狀態(tài)細(xì)胞換液第84頁,共105頁，2024年2月25日，星期天85細(xì)胞傳代原代細(xì)胞傳代以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株細(xì)胞系傳代以得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)接觸抑制營養(yǎng)枯竭將培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)器皿中消化下來，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的器皿中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同，在一代中，細(xì)胞培增3～6次第85頁,共105頁，2024年2月25日，星期天86消化法傳代培養(yǎng)步驟第86頁,共105頁，2024年2月25日，星期天87(五)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇冷凍保存要點(diǎn)冷凍過程要緩慢：緩凍速溶4℃30－60分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16－18小時（或過夜）→液氮長期保存或使用程序降溫盒，每秒下降1℃凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。細(xì)胞濃度控制在：5x106－2x107/ml。常用細(xì)胞冷凍保存液5%或10％DMSO＋完全培養(yǎng)液10％甘油＋完全培養(yǎng)液第87頁,共105頁，2024年2月25日，星期天88冷凍細(xì)胞注意事項(xiàng)凍存液配制

:現(xiàn)用現(xiàn)配，DMSO是易燃物凍存液體積：要小，0.5-1ml凍存細(xì)胞數(shù)：與正常傳代細(xì)胞數(shù)目要相當(dāng)，避免復(fù)蘇后細(xì)胞傳代比例發(fā)生變化凍存速度：降溫緩慢4C，10－30min-20C，1--2h-80C，1hour–過夜

-196C，1--2year完善記錄：凍存細(xì)胞名稱，PD，凍存日期，凍存人，存放位置，其它特殊信息等第88頁,共105頁，2024年2月25日，星期天89細(xì)胞凍存管，做好標(biāo)記第89頁,共105頁，2024年2月25日，星期天90第90頁,共105頁，2024年2月25日，星期天91細(xì)胞復(fù)蘇速融凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全培養(yǎng)液中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO如果細(xì)胞對冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中第91頁,共105頁，2024年2月25日，星期天92（六）細(xì)胞污染細(xì)菌污染真菌污染細(xì)菌和真菌的清除支原體污染支原體的清除第92頁,共105頁，2024年2月25日，星期天93細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

第93頁,共105頁，2024年2月25日，星期天94真菌污染真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。

第94頁,共105頁，2024年2月25日，星期天95白色念珠菌（倒置顯微鏡下）

中間長梭型的是正在分裂的念珠菌第95頁,共105頁，2024年2月25日，星期天96細(xì)菌和真菌的清除使用抗生素抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍藥物沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。第96頁,共105頁，2024年2月25日，星期天9795％以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）精氨酸支原體（M.arginini）豬鼻支原體（M.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawii）危害：世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到11%能改變細(xì)胞的DNA,RNA及蛋白表達(dá)不能通過可視法對其進(jìn)行檢測對細(xì)胞的生長率影響較小，不易引起注意污染來源：操作環(huán)境不良操作人員的疏失實(shí)驗(yàn)器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染第97頁,共105頁，2024年2月