細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測

關(guān)于細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測1.1細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是指細(xì)胞基因調(diào)控的一種自主性的自殺現(xiàn)象。或者說在一定的生理或病理條件下，細(xì)胞遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。程序性細(xì)胞死亡(ProgrammedCellDeath,PCD)

細(xì)胞凋亡同細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化一樣，是機體生存和發(fā)育離不開的最基本生物現(xiàn)象，通過凋亡可以平衡機體內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目，清除衰老、過剩、有害的細(xì)胞。

第2頁,共32頁，2024年2月25日，星期天與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病

第3頁,共32頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征

凋亡的起始：微絨毛消失，細(xì)胞間接觸消失，與周圍細(xì)胞脫離，細(xì)胞質(zhì)中線粒體大體完整，染色質(zhì)固縮；細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面；凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍；凋亡小體逐漸被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。

第4頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共32頁，2024年2月25日，星期天是細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷或大劑量細(xì)胞毒藥物作用后出現(xiàn)的反應(yīng)。

早期表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，線粒體腫脹。

繼而溶酶體破裂,細(xì)胞內(nèi)容物流出,引起炎癥。1.2細(xì)胞壞死第6頁,共32頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別——————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質(zhì)2.誘導(dǎo)因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反應(yīng)7.凋亡小體8.基因調(diào)控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹胞膜及細(xì)胞器相對完整細(xì)胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化（180-200bp），電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整，局部無炎癥反應(yīng)有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無第7頁,共32頁，2024年2月25日，星期天2細(xì)胞凋亡的流式檢測方法利用流式儀測定細(xì)胞光散射可對凋亡細(xì)胞進行分析凋亡早期細(xì)胞因體積減小，胞漿及染色質(zhì)固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大凋亡晚期細(xì)胞FSC、SSC均變小壞死細(xì)胞則因細(xì)胞膜通透性改變，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC、SSC變大，胞膜破裂，胞內(nèi)含物釋出后FSC、SSC均變小。第8頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

2.1PI單染檢測2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測2.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定2.4線粒體膜電位檢測2.5Caspases細(xì)胞酶的檢測2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU2.7凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P532細(xì)胞凋亡的流式檢測方法第9頁,共32頁，2024年2月25日，星期天與細(xì)胞周期相同，利用PI染色，通過檢測DNA含量來同時判定細(xì)胞周期和凋亡。凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶釋放，細(xì)胞DNA發(fā)生有序降解，被降解的低分子量DNA片段從變性細(xì)胞膜（經(jīng)乙醇及透膜劑處理）漏出細(xì)胞外，使得凋亡細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減低，在流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞DNA含量直方圖中G0/G1峰前可出現(xiàn)亞二倍體峰，即凋亡峰通過峰下的面積值可得出凋亡細(xì)胞在所測細(xì)胞群中所占的比率。2.1PI單染檢測第10頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共32頁，2024年2月25日，星期天PI單染色法的最大優(yōu)點在于獲得凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的同時可以與細(xì)胞周期中其他時相的細(xì)胞進行比較該法簡便、標(biāo)本制備容易、檢測費用低缺點：PI單染色法無法確認(rèn)來自哪一時相的凋亡，對于S期和G2/M期的細(xì)胞發(fā)生凋亡時，凋亡峰有時與G1峰或S峰相互重疊，導(dǎo)致G1峰或S峰增寬而無典型的sub-G1峰出現(xiàn)，所以無法分析來自S期或G2/M期細(xì)胞的凋亡，應(yīng)借助其他方法進行檢測第12頁,共32頁，2024年2月25日，星期天磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）異位：正常情況下，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。

2.2AnnexinV/PI(7-AAD)雙染檢測第13頁,共32頁，2024年2月25日，星期天AnnexinV選擇性結(jié)合PS。用帶有熒光標(biāo)記的AnnexinV，就可以用流式細(xì)胞儀非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。PI(7-AAD)可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，AnnexinV可以進入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

第14頁,共32頁，2024年2月25日，星期天此法簡單、可靠，由于凋亡時細(xì)胞膜的改變大大早于DNA的改變，因此AnnexinV/PI(或7-AAD)雙染色是檢測早期凋亡細(xì)胞的敏感方法。由于該法必須用活細(xì)胞，因此檢測時間受到限制，且對凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞無法準(zhǔn)確區(qū)分。第15頁,共32頁，2024年2月25日，星期天Fluo-3-Am為新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑，進入細(xì)胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶Fluo-3留在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Fluo-3與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強度是Fluo-3本身的40倍以上，當(dāng)用480nm波長激發(fā)時，其熒光強度與游離鈣離子濃度成正比。Fluo-4將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F，熒光強度比Fluo-3強1倍Fluo-4與鈣離子的親和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通過培養(yǎng)，能夠輕易進入細(xì)胞中。AM進入細(xì)胞后會被胞內(nèi)酯酶所水解，產(chǎn)生的Fluo-4隨后會和鈣離子結(jié)合并發(fā)出熒光。2.3細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定第16頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共32頁，2024年2月25日，星期天JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrialmembranepotential)ΔΨm的理想熒光探針。線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光……正常細(xì)胞

線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光……凋亡細(xì)胞

線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。2.4線粒體膜電位檢測第18頁,共32頁，2024年2月25日，星期天喜樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，3小時后用JC-1檢測線粒體膜電位的改變?？梢?，凋亡細(xì)胞紅色熒光降低。第19頁,共32頁，2024年2月25日，星期天caspases家族在凋亡過程中起到非常重要的作用，其中caspases-3是最重要的指示蛋白酶。研究結(jié)果表明，caspases-3可在凋亡發(fā)生的早期被激活，激活的caspases-3繼而使其他caspases裂

解并被激活，同時還可激活細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的相關(guān)成分。

caspases-3的活性只有在凋亡的早期才能檢測到，隨后在凋亡的過程中持續(xù)升高，在凋亡的晚期快速下降。對caspases-3的連續(xù)監(jiān)測，可動態(tài)觀察凋亡的整個過程。2.5Caspases細(xì)胞酶的檢測第20頁,共32頁，2024年2月25日，星期天該法簡單、快速，但不適于常規(guī)多功能流式細(xì)胞儀(不具備紫外光源)的檢測。主要有Caspases-3流式細(xì)胞檢測試劑盒，Caspases-2/Caspases-4/Caspases-6/Caspases-7/Caspases-9等抗體第21頁,共32頁，2024年2月25日，星期天2.6DNA碎片分析：Apo-BrdU核酸內(nèi)切酶活化使核小體內(nèi)DNA斷裂為50~300kb片段，裂解為200bpDNA碎片，暴露出多個3’羥基末端。利用外源性TdT使外源性dUTP或

BrdUTP連接到DNA碎片的3'羥基末端。以熒光標(biāo)記抗dUTP或抗BrdUTP抗體檢測dUTP或BrdUTP數(shù)量，從而間

接檢測凋亡加PI染色，在定量檢測凋亡細(xì)胞同時顯示凋亡細(xì)胞在細(xì)胞周期中所位置第22頁,共32頁，2024年2月25日，星期天在此法中，細(xì)胞固定先用甲醛，再用乙醇因為在凋亡細(xì)胞中可以檢測出兩群DNA：一群是低分子量的DNA(100~200bp)，彌散分布在凋亡細(xì)胞

另一群是高分子量的DNA或仍然黏附在核基質(zhì)上的DNA，

乙醇固定后沖洗不能將其從細(xì)胞中洗去。第23頁,共32頁，2024年2月25日，星期天用樹堿(CPT)誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，0、120和150分鐘時用TUNEL(BrdUTP)/PI雙染法檢測DNA斷裂，同時分析細(xì)胞周期?？梢姷蛲鲭S著誘導(dǎo)時間的增加而增多，且可知凋亡發(fā)生的時相。第24頁,共32頁，2024年2月25日，星期天此方法靈敏度高、特異性好，目前己被廣泛采用。由于DNA斷裂發(fā)生在細(xì)胞凋亡的早期階段，先于其形態(tài)學(xué)上的改變，可用于早期凋亡的研究。通過與PI雙染色，克服了PI單染色法的缺點，可以鑒定細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期的具體時相。第25頁,共32頁，2024年2月25日，星期天2.7凋亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2、P53的檢測在細(xì)胞凋亡的研究中，要重視對凋亡相關(guān)蛋白的檢測，它們在特定的信號傳導(dǎo)通路中與啟動凋亡的信號分子相互作用。從凋亡的開始到凋亡的結(jié)束，許多信號傳導(dǎo)通路都需要或受到特定的蛋白間相互作用的調(diào)控。凋亡相關(guān)蛋白：主要有Apo-1(Fas)、FasL的相關(guān)抗體，Bcl-2相關(guān)檢測抗體、p53等調(diào)控凋亡的基因蛋白產(chǎn)物第26頁,共32頁，2024年2月25日，星期天注意事項有些蛋白存在于細(xì)胞膜表面，如Fas；有些則存在于胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，如p53、bc1-2標(biāo)本的處理方法不同破膜是關(guān)鍵，最佳的破膜既能使膜通透性增強，又能保持膜的完整性，使膜表面的抗原分子不被破壞。皂角素(saponin)是目前最佳的破膜劑，它優(yōu)于乙醇、甲醇和甲醛等。第27頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3.細(xì)胞凋亡檢測面臨的問題3.1凋亡假陽性產(chǎn)生原因：

PS外翻使凋亡細(xì)胞和凋亡小體容易被鄰近細(xì)胞所吸附并被吞噬吞噬細(xì)胞并非僅為專職的吞噬細(xì)胞(如單核和粒細(xì)胞)，成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞也具吞噬作用。尤其是實體瘤，?？梢娫诘蛲黾?xì)胞周圍的腫瘤和非腫瘤細(xì)胞中有含有凋亡小體的吞噬體。

鄰近細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞后的殘留物中即包含了變化的細(xì)胞膜、

斷裂DNA等凋亡特征物。即使很輕微處理（胰酶消化/機械振蕩/細(xì)胞刮取等）均會造成PS

的外翻。第28頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3.2區(qū)分凋亡、壞死和凋亡的“壞死期”：產(chǎn)生原因：晚期凋亡與壞死相似

細(xì)胞膜破裂，用PI排染和AnnexinV結(jié)合實驗無法區(qū)分。胰酶消化時間過長、機械損傷(如細(xì)胞刮取、腫瘤細(xì)胞分

離或反復(fù)離心等)、電穿孔或某些藥物處理時，細(xì)胞膜的

通透性和對稱性均會改變。解決方法：形態(tài)學(xué)特征是區(qū)分凋亡和壞死的“金標(biāo)準(zhǔn)”。第29頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3.3