31單元八 微生物的常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù) 項(xiàng)目一 微生物的常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)（一、細(xì)菌總數(shù)的測定）

微生物學(xué)基礎(chǔ)單元十一微生物的常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)

１細(xì)菌總數(shù)測定的概念和意義一、細(xì)菌總數(shù)的測定

項(xiàng)目一微生物的常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)細(xì)菌總數(shù)測定的概念：指單位質(zhì)量或體積的被檢食品（藥物)中所含活的細(xì)菌總數(shù)；檢測細(xì)菌總數(shù)的衛(wèi)生學(xué)意義:

?細(xì)菌總數(shù)可以作為食品（藥物)被污染程度的標(biāo)志。細(xì)菌總數(shù)越多，則表明食品（藥物）污染越嚴(yán)重,受致病菌污染的可能性也越大；

?細(xì)菌總數(shù)可以預(yù)測食品存放的期限。如細(xì)菌總數(shù)為10個(gè)/cm2的魚在0℃下只可保存6天,而總數(shù)為103個(gè)/cm2的魚可保存12天。

2細(xì)菌總數(shù)測定的目的要求和基本原理一、細(xì)菌總數(shù)的測定

目的要求：

?學(xué)習(xí)活菌計(jì)數(shù)的技術(shù)方法；

?掌握細(xì)菌總數(shù)的測定及報(bào)告方式；基本原理:

?細(xì)菌總數(shù)是指食品（藥物)檢樣經(jīng)過處理,在一定條件（培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等)下培養(yǎng)后,所得1g或1mL檢樣中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)；

?平板計(jì)數(shù)法是通過將樣品稀釋成系列稀釋液,使樣品中細(xì)菌分散成單個(gè)細(xì)胞,取一定量的稀釋液接種，使其均勻分布在計(jì)數(shù)平板上。一般認(rèn)為每個(gè)菌落由一個(gè)細(xì)菌繁殖而成,因此,培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目即可計(jì)算出樣品中的細(xì)菌數(shù)；

?用這種方法測得的菌落數(shù)是培養(yǎng)基上生長的活菌數(shù),不含有死菌,故此法又稱為活菌計(jì)數(shù)法。

３實(shí)訓(xùn)用品一、細(xì)菌總數(shù)的測定

實(shí)訓(xùn)用品：培養(yǎng)基和試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液,無菌生理鹽水；儀器和材料：恒溫培養(yǎng)箱（36℃±1℃,30℃±1℃)、冰箱（2~5℃)、恒溫水浴箱(46℃土1℃)、天平（感量為0.1g)、均質(zhì)器、振蕩器、吸管(1mL和10mL)、錐形瓶(容量250mL、500mL)、培養(yǎng)皿(直徑90mm)。

４操作步驟一、細(xì)菌總數(shù)的測定

細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)程序：

４操作步驟－－樣品稀釋一、細(xì)菌總數(shù)的測定

樣品稀釋步驟：第一步：固體和半固體樣品稱取25g樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000~10000r/min均質(zhì)1~2min，制成1:10的樣品勻液；第二步：液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1:10的樣品勻液；第三步：用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻,制成1:100的樣品勻液；第四步：按上項(xiàng)操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次,換用1支1mL的無菌吸管；

４操作步驟－－樣品稀釋一、細(xì)菌總數(shù)的測定

樣品稀釋步驟：第五步：根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液)，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí),吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內(nèi),每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí),分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照；第六步：及時(shí)將冷至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿15~20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻；

４操作步驟－－培養(yǎng)一、細(xì)菌總數(shù)的測定

培養(yǎng)操作步驟：第一步：待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),置36℃±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h；第二步：如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL),凝固后翻轉(zhuǎn)平板，進(jìn)行培養(yǎng)。

４操作步驟－－菌落計(jì)數(shù)一、細(xì)菌總數(shù)的測定

菌落計(jì)數(shù)操作步驟：可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-formingunits,cfu)表示；第一步：選取菌落數(shù)在30~300cfu、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30cfu的平板記錄具體菌落數(shù),大于300cfu的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)；第二步：其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)；第三步：當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

４操作步驟－－結(jié)果與報(bào)告一、細(xì)菌總數(shù)的測定

結(jié)果與報(bào)告：菌落總數(shù)的６種計(jì)算方法①若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),即為每g（mL)樣品中細(xì)菌總數(shù)；

②若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi),按如下公式計(jì)算:

４操作步驟－－結(jié)果與報(bào)告一、細(xì)菌總數(shù)的測定

結(jié)果與報(bào)告：菌落總數(shù)的６種計(jì)算方法③若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300cfu，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),其他平板記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算；

④若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30cfu，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算；

⑤若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算；

⑥若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30～300cfu，其中一部分小于30cfu或大于300cfu時(shí)，則以最接近30cfu或300cfu的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

４操作步驟－－結(jié)果與報(bào)告一、細(xì)菌總數(shù)的測定

結(jié)果與報(bào)告：菌落總數(shù)報(bào)告的５個(gè)原則

①菌落數(shù)小于100cfu時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告；②菌落數(shù)大于或等于100cfu時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字,后面用０代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字；

③若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)則報(bào)告菌落蔓延；

④若空白對(duì)照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效；

⑤稱重取樣以cfu/g為單位報(bào)告，體積取樣以cfu/mL為單位報(bào)告。

５實(shí)訓(xùn)結(jié)果一、細(xì)菌總數(shù)的測定

實(shí)訓(xùn)結(jié)果：將各稀釋度的平板菌落數(shù)填入下表：結(jié)果報(bào)告：該樣品的細(xì)菌總數(shù)是________cfu/g(mL)。培養(yǎng)皿序號(hào)稀釋度培養(yǎng)皿１培養(yǎng)皿２平均數(shù)

６注意事項(xiàng)一、細(xì)菌總數(shù)的測定

注意事項(xiàng)：檢驗(yàn)中所用玻璃器皿,如培養(yǎng)皿、吸管、試管等必須徹底洗滌干凈方可進(jìn)行滅菌,不得殘留有抑菌物質(zhì)；用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對(duì)照。若空白對(duì)照上有菌落生長,則檢測結(jié)果無效,同時(shí)要查明污染的來源；檢樣加入培養(yǎng)皿后，應(yīng)在20min內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其