2022版新教材高考數(shù)學(xué)一輪復(fù)習(xí)第8章平面解析幾何新高考新題型微課堂8多選題命題熱點之解析幾何課件新

第十四章液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用第十四章液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用1★

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC—MS聯(lián)用）對于熱穩(wěn)定性差、不易汽化的樣品，GS—MS聯(lián)用有一定的困難。因此，近年來又發(fā)展了液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。LC分離要使用大量的液態(tài)流動相，如何有效地除去流動相而不損失樣品，是LC—MS聯(lián)用的難題之一。目前應(yīng)用較多的有兩種接口裝置。LC-MS用傳送帶聯(lián)接裝置2★

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC—MS聯(lián)用）對于熱穩(wěn)定性差、不一、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀二、離子源三、質(zhì)量分析器四、串聯(lián)四級質(zhì)譜法的掃描方式和模式五、檢測器和真空泵六、LC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化七、注意事項見建議3一、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀3一、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1.液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程4一、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀1.液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程4氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）；也可以質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MS-MS）?；谏V和質(zhì)譜的儀器靈敏度相當(dāng)，加之使分離效果好的色譜成為質(zhì)譜的進(jìn)樣器，而速度快、分離好、應(yīng)用廣的質(zhì)譜儀作為色譜的鑒定器，使它們成為目前最好的用于分析微量的有機(jī)混合物的儀器。一、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀2.液質(zhì)聯(lián)用儀類型5氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）基于色譜和氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比。液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:

6氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜LC-MS聯(lián)用儀系統(tǒng)構(gòu)成7LC-MS聯(lián)用儀系統(tǒng)構(gòu)成7廣適性檢測系統(tǒng)3.液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢一、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀8廣適性檢測系統(tǒng)3.液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢一、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析熱不穩(wěn)定化合物分析氣相色譜-質(zhì)譜無法分析的樣品分析大分子量的化合物，如生化樣品極高的靈敏度9分析熱不穩(wěn)定化合物9進(jìn)一步增加HPLC的分離能力10進(jìn)一步增加HPLC的分離能力104.LC-MS聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過程液相色譜的現(xiàn)實情況：從高效液相色譜流出的化合物存在于大氣壓條件下的溶液之中質(zhì)譜的現(xiàn)實情況：在高真空工作條件下的質(zhì)譜僅接受氣相的離子:因此，液質(zhì)聯(lián)用的接口必須完成:帶電狀態(tài):“中性”-離子物態(tài)轉(zhuǎn)變：液態(tài)-氣態(tài)真空變化:760torr-10-510-8torr。從LC-MS轉(zhuǎn)變LC-MS轉(zhuǎn)變過程去除溶劑保留樣品電離化合物114.LC-MS聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過程液相色譜的現(xiàn)實情況接口12接口12API接口：Z-Spray接口1313二、離子源大氣壓電離(API)技術(shù)目前，LC-MS采用大氣壓離子化（Atmosphericpressureionization,API)技術(shù)作為液質(zhì)聯(lián)用的接口技術(shù)，也是質(zhì)譜離子化技術(shù)。API主要包括：電噴霧electrosprayionization,ESI大氣壓化學(xué)電離atmosphericpressurechemicalionization,APCI離子源：使樣品產(chǎn)生離子的裝置叫離子源。14二、離子源大氣壓電離(API)技術(shù)離子源：使樣品產(chǎn)（一）電噴霧離子源ESI（二）大氣壓化學(xué)電離APCI（三）ESI與APCI比較二、離子源15（一）電噴霧離子源ESI二、離子源15電噴霧離子化ESI接口電噴霧離子化ESI特征電噴霧離子化ESI過程影響化合物ESI電離的因素（一）電噴霧離子化ESI16電噴霧離子化ESI接口（一）電噴霧離子化ESI161.ESI接口（一）電噴霧離子源氮氣用來做去溶劑氣和錐孔氣氬氣做碰撞氣先形成帶點電荷171.ESI接口（一）電噴霧離子源氮氣用來做去溶劑氣和錐低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得到一個質(zhì)子)高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體;常見的是溶劑加合物和NH4+(M+18),Na+(M+23),和K+(M+39)加合物靈敏度取決于化合物本身和基質(zhì)（一）電噴霧離子源2.ESI特征18低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得到一個質(zhì)子)（一（1）形成帶電小液滴（2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂（3）最終形成氣相離子3.電噴霧離子化ESI過程（一）電噴霧離子源19（1）形成帶電小液滴3.電噴霧離子化ESI過程（一）電（1）形成帶點離子3.電噴霧離子化ESI過程20（1）形成帶點離子3.電噴霧離子化ESI過程202121（2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂3.電噴霧離子化ESI過程22（2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂3.電噴霧離子化ESI過程2（3）形成氣相離子對于半徑10nm的液滴,電荷的排斥作用導(dǎo)致離子從液滴表面蒸發(fā)而不是液滴的分裂。離子從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相3.電噴霧離子化ESI過程23（3）形成氣相離子對于半徑10nm的液滴,電荷的排斥作用4.ESI-MS的基本離子化原理是：溶劑由液相泵輸送到ESI毛細(xì)管，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細(xì)管流出，在ESI高壓電極處施以負(fù)的高電壓,小液滴從毛細(xì)管高速噴出而帶有過量的負(fù)電荷.從而產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)：通過溶劑組分氧化而去掉正離子或通過毛細(xì)管自身的氧化而增加負(fù)離子。在高溫和氮氣的吹掃下，溶劑逐漸揮發(fā)，變成小顆粒的液滴，由于高電場作用，極性溶質(zhì)成為帶電離子溶解在溶劑液滴上，當(dāng)溶劑顆粒逐漸減小，小到一定程度，帶電的溶質(zhì)粒子便從液滴表面蒸發(fā)出來，形成帶電離子，完成離子化244.ESI-MS的基本離子化原理是：溶劑由液相泵輸（4）影響化合物ESI電離的因素(a）化合物的濃度(b）基質(zhì)的性質(zhì)(c)化合物的表面活性(d)流速25（4）影響化合物ESI電離的因素(a）化合物的濃度25離子的釋放取決于濃度.?信號在10μM時達(dá)到飽和.?線性動態(tài)范圍限制在2-3個數(shù)量級信號的飽和歸因于離子在液滴表面過于密集,致使某些樣品離子不能到達(dá)液滴表面.ESI:樣品濃度對其響應(yīng)的影響26離子的釋放取決于濃度.ESI:樣品濃度對其響應(yīng)的影響262727ESI:基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響一般而言,樣品信號強(qiáng)度響應(yīng)隨著其它電解質(zhì)濃度的增高而降低;這一現(xiàn)象叫作‘離子抑制。樣品離子和電解質(zhì)離子對電荷及占據(jù)液滴表面的競爭導(dǎo)致離子抑制。表面競爭電荷競爭28ESI:基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響一般而言,樣品信號強(qiáng)度基質(zhì)選擇一般原則一般而言，對于正離子檢測模式，樣品必須比基質(zhì)更具堿性，以便形成(M+H)+或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子，例(M+NH4)+。對于負(fù)離子檢測模式，樣品必須比基質(zhì)更具酸性，以便形成(M-H)-或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子，例如(M+OAc)-。ESI:基質(zhì)對樣品響應(yīng)的影響29基質(zhì)選擇一般原則一般而言，對于正離子檢測模式，樣品必須ESI:流速對樣品響應(yīng)的影響ESI響應(yīng)隨流速的增加而降低對ESI接口來說,最佳工作流速為100-250μL/min.30ESI:流速對樣品響應(yīng)的影響ESI響應(yīng)隨流速的增加而降大氣壓化學(xué)電離源APCI接口大氣壓化學(xué)電離源APCI特征大氣壓化學(xué)電離源過程(二）大氣壓化學(xué)電離源APCI31大氣壓化學(xué)電離源APCI接口(二）大氣壓化學(xué)電離源（二）大氣壓化學(xué)電離源APCI1.APCI接口霧化32（二）大氣壓化學(xué)電離源APCI1.APCI接口2.大氣壓化學(xué)電離源APCI特征一般而言,只生成單電荷離子幾乎沒有碎片離子可能生成加合物和/或多聚體;一般是溶劑加合物及NH4+(M+18),Na+(M+23),和K+(M+39)加合物基質(zhì)影響較小(相對于ESI)。質(zhì)譜圖不受緩沖鹽及其緩沖力變化的影響332.大氣壓化學(xué)電離源APCI特征一般而言,只生成單電荷離3.大氣化學(xué)電離過程大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個步驟:（1）快速蒸發(fā)（2）氣相化學(xué)電離(電暈放電)343.大氣化學(xué)電離過程大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個步驟:34（1）快速蒸發(fā)液流被強(qiáng)迫通過一根窄的管路以使其得到高的線速度高溫加熱器和噴霧器使液流在脫離管路時蒸發(fā)成氣體由于溶劑蒸汽的保護(hù)，樣品分子較少受熱裂解的影響，大量的熱量用于溶劑的蒸發(fā)，但是有時也會有熱不穩(wěn)定樣品分解35（1）快速蒸發(fā)液流被強(qiáng)迫通過一根窄的管路以使其得到高的線（2）氣相化學(xué)電離36（2）氣相化學(xué)電離36Needle噴霧針（CoronaNeedle電暈針reagentgas試劑氣離子-分子反應(yīng)2.大氣壓化學(xué)電離源APCI37NeedleCoronaNeedlereagentgas大氣壓化學(xué)電離源APCI離子-分子反應(yīng)質(zhì)子轉(zhuǎn)移電子捕獲電荷交換離子加和適合于熱穩(wěn)定、易氣化的小分子低極性化合物38大氣壓化學(xué)電離源APCI離子-分子反應(yīng)質(zhì)子轉(zhuǎn)移電（三）ESI與APCI的比較共同點都屬于大氣壓電離法（API）通常產(chǎn)生(M+H)+或(M-H)-等準(zhǔn)分子離子都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片39（三）ESI與APCI的比較共同點都屬于大氣壓電離法（APIESI與APCI的比較不同點生成離子方式不同樣品兼容性不同流速兼容性不同ESI：液相離子化APCI：氣相離子化ESI：0.2-0.5ml/minAPCI：0.5-1ml/minESI：極性化合物和生物大分子APCI：非極性,小分子化合物(相對于用ESI電離的化合物而言)且有一定的揮發(fā)性40ESI與APCI的比較不同點生成離子方式不同樣品兼容性不同流4141樣品已經(jīng)變成氣相離子樣品仍處于大氣壓下必須把樣品送入質(zhì)譜高真空環(huán)境中42樣品已經(jīng)變成氣相離子42蒸氣通過樣品錐孔進(jìn)入一級真空區(qū)(離子源區(qū))并且膨脹蒸氣在膨脹時會冷卻這種冷卻可能導(dǎo)致在被分析物離子上的溶劑凍結(jié)從而生成各種質(zhì)量數(shù)的簇離子一級真空成簇過程簇離子會降低所要檢測的被分析物質(zhì)量處的信號；簇離子會增加背景信號43蒸氣通過樣品錐孔進(jìn)入一級真空區(qū)(離子源區(qū))并且膨脹一級真空成加熱一級真空區(qū)(離子源區(qū))以阻止簇離子的生成,使不帶溶劑的樣品離子被檢測在通過加熱的離子源區(qū)以后,樣品離子在靜電場作用下通過萃取錐孔通過萃取錐孔后,樣品離子進(jìn)入六極桿聚焦透鏡從六極桿聚焦透鏡出來,樣品離子進(jìn)入四極桿質(zhì)量分析器44加熱一級真空區(qū)(離子源區(qū))以阻止簇離子的生成,使不帶溶劑三.質(zhì)量分析器雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).四極質(zhì)譜儀(Q).飛行時間質(zhì)譜儀(TOF).離子阱質(zhì)譜儀（TRAP）┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質(zhì)譜儀┫三重四極（QqQ）(MS/MS) ┗TOF+TOF1.分類45三.質(zhì)量分析器雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector)單四極桿分析器Quadrupole由四根棒狀電極組成直流電壓：DC射頻電壓：RF形成二維四極電場離子在場的作用下產(chǎn)生振動，碰到四極桿而被吸收通過四極桿的離子到達(dá)檢測器被檢測2.四級桿分析器46單四極桿分析器Quadrupole由四根棒狀電極組成直4747通過改變RF，從而改變通過的離子質(zhì)量離子質(zhì)量時間掃描循環(huán)時間掃描時間回程時間程序處理時間48通過改變RF，從而改變通過的離子質(zhì)量離子質(zhì)量時間掃描循環(huán)串聯(lián)質(zhì)量分析器空間串聯(lián)時間串聯(lián)空間-時間串聯(lián)四極桿串聯(lián)Q-Q-Q離子阱FTICRQ-Trap都有碰撞活化室49串聯(lián)質(zhì)量分析器空間串聯(lián)時間串聯(lián)空間-時間串聯(lián)四極桿串聯(lián)實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS)：三重四極（QqQ）離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器MS1MS2Q1q2Q3第一級質(zhì)量分析器：用于選擇一個前體離子或母離子，然后，用適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片。mp+mf++mnmp+為前體離子；mf+為產(chǎn)物離子；mn為中性碎片；第二級質(zhì)量分析器：用于產(chǎn)物離子分析如從產(chǎn)物中再選擇一個離子，分析最后選擇的離子的碎片，則標(biāo)記MS/MS/MS，數(shù)級可進(jìn)一步增加至n次，實現(xiàn)MSn實驗50實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS)：串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿三個四極桿串聯(lián)Q-Q-QQ1–質(zhì)量分離Q2–碰撞活化CIDCollision-InducedDissociationQ3–質(zhì)量分離51串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿三個四極桿串聯(lián)Q-Q-QQ1–3.碰撞誘導(dǎo)解離CID質(zhì)譜QqQ檢測器中的碰撞反應(yīng)在CID中進(jìn)行。選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進(jìn)入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(本實驗室選擇高純氦)，發(fā)生離子—分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生‘子離子’，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜，一般稱做CID(collision-induceddissociation)譜。523.碰撞誘導(dǎo)解離CID質(zhì)譜QqQ檢測器中的CID產(chǎn)生的過程53CID產(chǎn)生的過程534.影響CID質(zhì)譜的因素：較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜，尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進(jìn)行人工解析或自己建庫。大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子，其主要的碎片應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生，所以在EI質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋。544.影響CID質(zhì)譜的因素：較大影響的因素有：所用碰撞氣體的四、掃描方式和掃描模式全掃描(FullScan)子離子掃描(DaughterScan)母離子掃描(ParentScan)中性碎片丟失掃描(ConstantNeutralLossScan)選擇離子監(jiān)測(SIR)多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)（一）掃描方式（二）掃描模式正離子模式負(fù)離子模式55四、掃描方式和掃描模式全掃描(FullScan)（一）掃1、全掃描特征：–質(zhì)譜掃描得到一段質(zhì)量范圍從而獲得質(zhì)譜圖–用于未知物的結(jié)構(gòu)分析–用于SIR方法的開發(fā)以及MRM方法開發(fā)尋找母離子最佳電離參數(shù)Q3Q2Q1=scanned=CID=selectedm/z定性尋找總分子離子峰出峰時間561、全掃描特征：Q3Q2Q1=scanned=CID=LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子，[(H2O)nH+，n=3-112]m/z102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z279,管路中鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z384,瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m/z391,管路中鄰苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z413,鄰苯二甲酸二辛酯+鈉,C24H38O4Na+,413.2668m/z538,乙酸+氧+鐵（噴霧管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.879357LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子Q3Q2Q1=scanned=selectedm/z=CID過程：通過Q1選擇目標(biāo)物質(zhì)的母離子，在Q2發(fā)生碰撞反應(yīng)，Q3對目標(biāo)物質(zhì)豐度最大的子離子進(jìn)行掃描。2、子離子掃描特征：–監(jiān)測單個離子或一系列單個離子–目標(biāo)化合物的跟蹤–提高采集靈敏度10023058Q3Q2Q1=scanned=selectedm/z=子離子質(zhì)譜圖用MS2質(zhì)量分析器掃描指定母離子的子離子碎片，所得到的質(zhì)譜圖只能是由指定母離經(jīng)碰撞產(chǎn)生。59子離子質(zhì)譜圖用MS2質(zhì)量分析器掃描指定母離子的子離子碎片，子離子掃描質(zhì)譜圖60子離子掃描質(zhì)譜圖60用MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子，所得到的母離子質(zhì)譜峰一定是能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子。母離子質(zhì)譜圖3、母離子掃描61用MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子，所得到的母母離子掃描質(zhì)譜圖62母離子掃描質(zhì)譜圖624、中性碎片丟失母離子掃描、中性丟失掃描可用來研究結(jié)構(gòu)相似性化合物（如具有相同結(jié)構(gòu)碎片、或相同結(jié)構(gòu)基團(tuán)的化合物）Q3Q2Q1=scanned=CID=scannedwithoffset634、中性碎片丟失母離子掃描、中性丟失掃描可用來研究結(jié)構(gòu)相似性中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定中性碎片的母離子，MS2質(zhì)量分析器掃描丟失指定中性碎片的離子，所得到的質(zhì)譜圖是由MS1掃描的母離子，母離子只能是丟失指定中性碎片的離子64中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定中性碎中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖65中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖655.選擇離子掃描Q3Q2Q1=scanned=selectedm/z=CID定量滿足一般要求信噪比不如MRM只監(jiān)測指定的離子665.選擇離子掃描Q3Q2Q1=scanned=sele選擇離子記錄(SIR)MS1質(zhì)量分析器是靜態(tài)，并且只監(jiān)測指定的離子。67選擇離子記錄(SIR)MS1質(zhì)量分析器是靜態(tài)，并且只監(jiān)測指選擇離子記錄掃描68選擇離子記錄掃描686.多反應(yīng)監(jiān)測SRM&MRM特征：–監(jiān)測特定母離子產(chǎn)生特定子離子碎片的化合物–目標(biāo)化合物的跟蹤–提高采集靈敏度，是靈敏度最高的定量采集方式定量最佳選擇干擾小信噪比高Q3Q2Q1=scanned=selectedm/z=CID696.多反應(yīng)監(jiān)測SRM&MRM特征：定量子離子質(zhì)譜圖指定的母離子產(chǎn)生一指定的子離子，兩個質(zhì)量分析器都是靜態(tài)的。70子離子質(zhì)譜圖指定的母離子產(chǎn)生一指定的子離子，兩個質(zhì)量分析器多反應(yīng)監(jiān)測掃描71多反應(yīng)監(jiān)測掃描71串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿72串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿72化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。子離子分析（MS/MS）子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。73化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）73（二）掃描模式一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負(fù)離子測定模式可供選擇。一般不要選擇兩種模式同時進(jìn)行。正、負(fù)離子模式建議根據(jù)文獻(xiàn)選擇。74（二）掃描模式一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。2.負(fù)離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。樣品中有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負(fù)離子模式。（二）掃描模式選擇的一般原則為75正離子模式：（二）掃描模式選擇的一般原則為75檢測器數(shù)據(jù)分析電子倍增管光電倍增管電子倍增管打拿極PCQ3五、檢測器和真空泵76檢數(shù)電子倍增管光電倍增管電子倍增管打高真空泵<10-6Torr油擴(kuò)散泵渦輪分子泵極限真空可達(dá)10-5-10-6Torr蒸汽噴射泵泵液蒸汽返流，提高本底、易污染系統(tǒng)五、檢測器和真空泵77高真空泵<10-6Torr油擴(kuò)散泵渦輪分子泵極限真空可達(dá)1高真空泵<10-6Torr油擴(kuò)散泵渦輪分子泵真空可達(dá)10-5–10-6Torr小型蒸汽渦輪機(jī)高速旋轉(zhuǎn)葉片貴、易損78高真空泵<10-6Torr油擴(kuò)散泵渦輪分子泵真空可達(dá)10-真空系統(tǒng)其他附件真空規(guī)（真空計）真空管道真空閥門吸附阱抽氣方式單泵抽氣方式雙泵差動抽氣方式79真空系統(tǒng)其他附件真空規(guī)（真空計）真空管道真空閥門1.樣品的預(yù)處理：從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結(jié)果的干擾。要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。六、LC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化分離條件選擇801.樣品的預(yù)處理：從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣品的預(yù)處理常用方法a）超濾b）溶劑萃取／去鹽c）固相萃取d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽e）色譜分離反相色譜分離親和技術(shù)分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化81樣品的預(yù)處理常用方法a）超濾812.電離源的選擇ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（蛋白質(zhì)）。只要有相對強(qiáng)的極性，ESI對小分子的分析常?？梢缘玫綕M意的結(jié)果。APCI不適合多電荷的大分子分析，它的優(yōu)勢在于非極性或中等極性的小分子的分析。822.電離源的選擇82①電離方式ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離、碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時，發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移。②樣品流速APCI源允許的流量相對較大，0.2-2mL/min，而ESI源允許流量相對較小，最大只能為1.0mL/min。③斷裂程度APCI源的探頭處于高溫，可使熱不穩(wěn)定的化合物分解，產(chǎn)生碎片；ESI源探頭處于常溫，常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生碎片。④靈敏度都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性小的化合物。⑤多電荷APCI源不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)、多肽類的生物分子，由于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子。83①電離方式ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI3.正負(fù)離子模式的選擇正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH＝3-4）或甲酸（pH＝2-3）對樣品加以酸化。負(fù)離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進(jìn)行堿化。有些酸堿性并不明確的化合物，可優(yōu)先選用APCI（+）進(jìn)行測定。843.正負(fù)離子模式的選擇正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（4.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LC／MS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。854.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比不適合的溶劑和緩沖液a不揮發(fā)的鹽b表面活性劑/洗滌劑c無機(jī)酸其它溶劑和調(diào)節(jié)劑a異丙醇、2-甲氧基乙醇及乙醇等b三氟醋酸（TFA）常用于LC-MS分析肽和蛋白質(zhì)的化合物c三乙胺（TEA）d四氫呋喃（THF)86不適合的溶劑和緩沖液865.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內(nèi)徑的微柱APCI的最佳流速～lml／min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。875.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul6.輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機(jī)溶劑比例高時可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。886.輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對流出液形成噴霧有影響用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現(xiàn)如下離子:-Na22Da.higherthanM+H-K38Da.higherthanM+H-Li6Da.higherthanM+H-NH417Da.higherthanM+H-ACN40Da.higherthanM+H2M+H,2M+Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子:-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)-Acetate60Da.higherthenM-H-Formic46Da.higherthenM-H-Cl36Da.higherthanM-H89用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現(xiàn)如下離子影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮90影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)分子量測定失敗的原因

a）流動相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂91分子量測定失敗的原因

a）流動相不合適91一般步驟確定離子源、正負(fù)模式優(yōu)化流動相、離子源參數(shù)，使Q1信號最大化打開Q2、Q3，優(yōu)化CID，確定子離子優(yōu)化Detector、Scantime等等參數(shù)分離參數(shù)優(yōu)化92一確定離子源、正負(fù)模式優(yōu)化流動相、離子源參數(shù)，使Q1信號最大分析待測物性質(zhì)極性極性、弱極性：ESI非極性：APCI熱穩(wěn)定性熱不穩(wěn)定：ESI熱穩(wěn)定：APCI分子量310LC-MS/MS<2000特殊性質(zhì)正/負(fù)模式表面活性劑？污染？影響定性結(jié)果93分極性極性、弱極性：ESI非極性：APCI熱穩(wěn)定性儀器參數(shù)的設(shè)置霧化針電壓霧化氣流量流動相比例、流速色譜柱干燥氣溫度干燥氣流量毛細(xì)管電壓碰撞活化能量檢測器電壓掃描時間質(zhì)譜峰寬離子源腔室溫度總結(jié)94儀霧化針電壓霧化氣流量流動相比例、流速色譜柱干燥氣溫度干燥氣磺胺吡啶ESIScan（+）200-300m/zScan（-）200-300m/z確定離子源、正負(fù)模式S/N=1095磺ESIScan（+）200-300m/zScan（-）20SIM（+）（m/z=250.0）SIM（-）（m/z=247.5）S/N=110096SIM（+）（m/z=250.0）SIM（-）（m/z=24優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號最大化干燥氣溫度250℃300℃350℃400℃97優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號最大化干燥氣溫度250℃300℃3優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號最大化霧化氣流量45psi50psi60psi55psi65psiQ1信號最大化98優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號最大化霧化氣流量45psi50ps打開Q2、Q3，優(yōu)化CID，確定子離子子離子掃描ProductScan尋找碎片離子1.0mTorr2.1mTorr99打開Q2、Q3