血清蛋白電泳

關(guān)于血清蛋白電泳血清和血漿血清:是指離體的血液經(jīng)過自然凝固而析出的液體部分.

血漿:是指離體并經(jīng)過抗凝的血液經(jīng)過離心沉淀后的上清部分.

血清中無纖維蛋白原第2頁,共35頁，2024年2月25日，星期天簡介人類血液中有125種以上蛋白質(zhì)成分。白蛋白、脂蛋白、抗體、補體、凝血酶原和凝血因子、抗凝血因子、α1-抗胰蛋白、α1-糖蛋白、α2-巨球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和其他微量蛋白等成分。第3頁,共35頁，2024年2月25日，星期天歷史1809年，Pehce(俄國物理學(xué)家)首先發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年，Tiselius(瑞典)制成界面電泳儀，應(yīng)用于蛋白質(zhì)研究1948年，Wieland和Fischer建立了濾紙電泳法，奠定了區(qū)帶電泳技術(shù)的基礎(chǔ)1959年，Raymond和Weintraub創(chuàng)建聚丙烯酰胺凝膠電泳第4頁,共35頁，2024年2月25日，星期天電泳和電泳技術(shù)電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。第5頁,共35頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用電泳技術(shù)除了用于小分子物質(zhì)的分離分析外,最主要用于蛋白質(zhì),核酸等生物分子的研究.由于電泳法設(shè)備簡單,操作方便,具有高分辨率及選擇性特點,已成為醫(yī)學(xué)檢驗中常用的技術(shù).

第6頁,共35頁，2024年2月25日，星期天COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI電泳用于分離物質(zhì)的原理第7頁,共35頁，2024年2月25日，星期天電泳分類按分離的原理不同：區(qū)帶電泳、自由界面電泳、等速電泳、等電聚焦電泳按支持介質(zhì)的不同：紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳按支持介質(zhì)形狀不同：薄層電泳、板電泳和柱電泳按用途不同：分析電泳、制備電泳、定量免疫電泳和連續(xù)制備電泳。第8頁,共35頁，2024年2月25日，星期天影響電泳的因素在電泳中,電場,帶電粒子和促使帶電粒子移動的介質(zhì)是產(chǎn)生電泳的三大要素.因而,影響電泳的主要因素有：電場強度的影響溶液的pH值溶液的離子強度電滲溫度、分子大小、吸附作用等第9頁,共35頁，2024年2月25日，星期天電滲

液體對固體支持物的相對移動，由緩沖液的水分子和支持介質(zhì)的表面之間產(chǎn)生的一種相關(guān)電荷所引起。如果電滲與電泳方向相同，V變大；反之變小。第10頁,共35頁，2024年2月25日，星期天血清蛋白醋酸

纖維素薄膜電泳第11頁,共35頁，2024年2月25日，星期天原理在pH8.6堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動各種蛋白質(zhì)pI不同，帶電荷量有差異蛋白質(zhì)的分子大小與分子形狀不相同帶電荷多、分子量小者，泳動較快；反之則較慢第12頁,共35頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的等電點、分子量及遷移率蛋白質(zhì)名稱等電點相對分子量電泳遷移率白蛋白4.846.9萬5.9*10-5α1-球蛋白5.0620萬5.1*10-5α2-球蛋白5.0630萬4.1*10-5β-球蛋白5.129萬～15萬2.8*10-5γ-球蛋白6.86～7.3015.6萬～30萬1.0*10-5第13頁,共35頁，2024年2月25日，星期天電泳結(jié)果示意圖γβα2α1清蛋白第14頁,共35頁，2024年2月25日，星期天染色時染料與蛋白質(zhì)特異結(jié)合而不與醋纖膜結(jié)合，染色深淺與蛋白質(zhì)的量成正比染色一段時間后脫色，將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng)脫色、比色即可計算出各蛋白質(zhì)組分的相對百分?jǐn)?shù)。如同時測定出總蛋白濃度，還可計算出各蛋白組分的絕對濃度第15頁,共35頁，2024年2月25日，星期天正常血清電泳掃描圖譜第16頁,共35頁，2024年2月25日，星期天試劑緩沖液：巴比妥緩沖液（pH8.6）染色液：麗春紅S染色液漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液洗脫液：0.1mol/LNaOH溶液第17頁,共35頁，2024年2月25日，星期天操作準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備CAM的準(zhǔn)備點樣吸3-5μl血清均勻點于CAM無光澤面電泳無光澤面朝下，點樣側(cè)置于負(fù)極端，通電染色將薄膜條浸入麗春紅S染色液，染5-10min漂洗

第18頁,共35頁，2024年2月25日，星期天醋纖膜規(guī)格及點樣示意圖第19頁,共35頁，2024年2月25日，星期天定量取試管6支，在白蛋白管內(nèi)加入0.1mol/LNaOH液6ml，其余各管加入3ml，將各蛋白區(qū)帶剪下分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中，37℃10-20min向白蛋白管中加入40%醋酸0.6ml,其余各管加0.3ml,以中和部分NaOH用520nm比色，以空白管調(diào)零，讀各管吸光度第20頁,共35頁，2024年2月25日，星期天計算

設(shè)各部吸光度分別為AA、Aa1、Aa2、Aβ、Aγ。吸光度總和（AT）為：

AT=AA+Aa1+Aa2+Aβ+Aγ

白蛋白（%）＝（AA*2

AT）*100%a1-球蛋白（%）=（Aa1AT）*100%……第21頁,共35頁，2024年2月25日，星期天注意事項通電時，不得接觸槽內(nèi)緩沖液或CAM，以防觸電緩沖液液面要保證一定高度標(biāo)本：血清應(yīng)新鮮，不得溶血染料：對蛋白質(zhì)的各組分親和力相同，水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的染料蛋白質(zhì)復(fù)合物穩(wěn)定且易洗脫比色第22頁,共35頁，2024年2月25日，星期天注意事項電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開不明顯原因：點樣過多點樣不均勻、不整齊樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過濕，樣品擴(kuò)散；薄膜未完全浸透或溫度過高導(dǎo)致干燥或水分蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行緩沖液變質(zhì)；樣品不新鮮CAM質(zhì)量不高等電滲現(xiàn)象

第23頁,共35頁，2024年2月25日，星期天評價優(yōu)點：CAM電泳具有靈敏度高，標(biāo)本用量少，分辨率高，區(qū)帶清晰，電泳時間短，操作簡便快捷；CAM對染料不吸附，蛋白區(qū)帶均勻，背景清晰，既易比色定量，又易透明后進(jìn)行光密度掃描。缺點：有輕微電滲現(xiàn)象，薄膜吸水性差，電阻容易增大，當(dāng)電流較大時，薄膜中水分極易蒸發(fā)，造成蛋白質(zhì)分子變性破壞。第24頁,共35頁，2024年2月25日，星期天臨床意義第25頁,共35頁，2024年2月25日，星期天麗春紅S染色參考范圍蛋白質(zhì)組分g/L占總蛋白的百分?jǐn)?shù)(%)白蛋白35～5257～68α1-球蛋白1.0～4.01.0～5.7α2-球蛋白4.0～8.04.9～11.2β-球蛋白5.0～10.07.0～13.0γ-球蛋白6.0～13.09.8～18.2第26頁,共35頁，2024年2月25日，星期天各組分構(gòu)成

Alb：白蛋白α1：α1酸性糖蛋白；α1抗胰蛋白酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白α2：觸珠蛋白；銅蘭蛋白；α2巨球蛋白；α脂蛋白β：轉(zhuǎn)鐵蛋白；補體系統(tǒng)；β脂蛋白γ：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE；CRP第27頁,共35頁，2024年2月25日，星期天臨床意義

肝病型：Alb降低β和γ-球蛋白增高出現(xiàn)β和γ難以分離，出現(xiàn)“β-γ橋”，此現(xiàn)象往往是由于IgA增高所致，IgA與肝纖維化有關(guān)。見于急慢性肝炎和肝硬化。第28頁,共35頁，2024年2月25日，星期天臨床意義M蛋白血癥型Alb輕度降低單克隆γ球蛋白（M蛋白）增高在β與γ-球蛋白區(qū)或γ-球蛋白區(qū)出現(xiàn)一條致密濃集的M蛋白帶見于MM、巨球蛋白血癥等第29頁,共35頁，2024年2月25日，星期天臨床意義腎病型：表現(xiàn)為白蛋白及γ-球蛋白降低，α2和β-球蛋白升高。見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎功能衰竭等。炎癥型：表現(xiàn)為α1、α2和β三種球蛋白均增高，見于各種急、慢性炎癥和應(yīng)激反應(yīng)。蛋白缺乏癥：主要包括α1抗胰蛋白酶缺乏癥、γ-球蛋白缺乏癥等（較少見）第30頁,共35頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共35頁，2024年2月25日，星期天雙白蛋白血癥型

主要特征：在白蛋白部位有兩個區(qū)帶，掃描出現(xiàn)雙峰，呈剪刀狀。產(chǎn)生原因：持久型主要是一種家族性血清蛋白異常的疾病，極少見，為常染色體不完全顯性遺傳；暫時型主要是指腎功能不全的患者在治療期間使用大劑量的β-內(nèi)酰胺類抗生素，可形成快泳動性的白蛋白成分，治療中斷即逐漸消失。

第32頁,共35頁，2024年2月25日，星期天先天性白蛋白缺陷型

主要特征：由于血清白蛋白的