蛋白免疫快速診斷應(yīng)用技術(shù)

關(guān)于蛋白免疫快速診斷應(yīng)用技術(shù)交流提綱

前言一）、免疫檢測基礎(chǔ)知識及免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述二）、快速免疫檢測技術(shù)現(xiàn)狀和前景展望三）、快速免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用介紹四）、思考——

胸懷大志，放眼世界，立志細(xì)節(jié)第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天前言：1、個人所從事的行業(yè)和專業(yè)的限制1）醫(yī)學(xué)專業(yè)、生物專業(yè)、化學(xué)專業(yè)（人）2）臨床免疫類檢驗試劑（人用）的開發(fā)3）對客戶/臨床需求有所了解2、有可能找到的共同點1）所采用技術(shù)方法具有共同點2）為了共同的目標(biāo)——為人類健康服務(wù)第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測基礎(chǔ)知識及免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)技術(shù)的范疇1、對具有免疫活性物質(zhì)的定性、定量測定2、對免疫系統(tǒng)的組成成分的數(shù)量、狀態(tài)的測定第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測基礎(chǔ)知識及免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用特點1、對象——“包羅萬象”2、方法——“兼容并蓄”第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

抗原的概念與屬性1、免疫原性——可識別、可反應(yīng)性（誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性）2、免疫反應(yīng)性

——選擇結(jié)合性（和免疫應(yīng)答產(chǎn)物特異性結(jié)合的特性）第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

抗原抗體反應(yīng)的特點1、特異性2、可逆性3、適合比例性第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫學(xué)檢測技術(shù)評價標(biāo)準(zhǔn)1、Specificity（特異）2、Sensitivity（敏感）3、Simplicity（簡便）4、Safety（安全）5、Saving（節(jié)約）第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展綜述

免疫檢測技術(shù)的進(jìn)展1、經(jīng)典的免疫分析技術(shù)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、溶血反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合實驗特點：成本低、技術(shù)簡單、結(jié)果易于判斷，但不易于實現(xiàn)自動化。2、現(xiàn)代的免疫分析技術(shù)熒光免疫標(biāo)記、放射性免疫標(biāo)記、酶免疫標(biāo)記、鑭系（稀土）元素免疫標(biāo)記、膠體顆粒標(biāo)記、臨床化學(xué)免疫分析技術(shù)、發(fā)光免疫標(biāo)記、流式免疫微球技術(shù)及生物傳感器技術(shù)等。特點：靈敏、特異、快速、易于測定及實現(xiàn)自動化。第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT概念的引入POCT——PointofCareTesting不需要固定的場地、不需要太多的時間、也不需要特定的地方、在沒有實驗室設(shè)備的條件下也能完成檢測。檢測可在患者身邊或者靠近患者的地方完成。Testsdesginedtobeatornearthesitewherethepatientislocated,thatdonotrequirepermanentspace,andthatareperformedoutsidethephysicalfacilitiesoftheclinicallaboratory.(美國病理家學(xué)會CollegeofAmericanPathologists）

第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT技術(shù)已使用了上千年1、約公元前1500年法老的私人醫(yī)生注意到有些人的尿液吸引了很多螞蟻，而另一些人的尿液則沒有。2、后來發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象與尿液中的葡萄糖濃度有關(guān)第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來美國FDA對簡便實驗的定義1988年美國臨床實驗室改良法案：臨床豁免權(quán)1、全自動化儀器直接使用未處理過的標(biāo)本/毛細(xì)管血（指尖血）、鼻拭子或尿液；2、對標(biāo)本只需進(jìn)行基本的、無技術(shù)要求的處理，包括去污；3、對試劑只需要進(jìn)行基本的、無技術(shù)要求的處理，例如，將試劑A和試劑B混勻4、分析步驟不需要操作者干預(yù)5、不需要技巧或?qū)ｉT知識第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來美國FDA對簡便實驗的定義6、無需電子或機(jī)械設(shè)備保養(yǎng)7、所得結(jié)果不需要操作者校準(zhǔn)、解釋和計算8、結(jié)果易讀，例如陽性或陰性，直接讀出數(shù)值，線條很明顯或無線條存在，即等級明顯9、試驗性能可與可溯源的參考方法相比較10、有用戶可看懂的快速參考指南

/cdrh/ovid/guidance/1171.pdf第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT的術(shù)語1、護(hù)理點/床邊/即時檢驗（PointofCareTesting)2、近患者檢驗(NearPatientTesting)3、醫(yī)務(wù)室檢驗(PhysiciansOfficeTesting)4、床邊檢驗(BesideTesting)5、實驗室外檢驗(Extra-laboratoryTesting)6、分散檢驗(DecentralizedTesting)7、機(jī)構(gòu)外檢驗(OffsiteTesting)8、輔助檢驗(AncillaryTesting)9、替換點檢驗(AlternativeSiteTesting)第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來看看發(fā)生了什么變化？不需要專業(yè)的操作者需要專業(yè)的操作者不需要專業(yè)的裝置需要專業(yè)的裝置第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產(chǎn)品都在哪里應(yīng)用日間病房救護(hù)車醫(yī)生研究室血庫社區(qū)衛(wèi)生診所環(huán)境實驗室健康義診家庭康復(fù)機(jī)構(gòu)消防隊康復(fù)中心第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來為什么要推動POCT產(chǎn)品？護(hù)理過程最佳化病人護(hù)理產(chǎn)出災(zāi)難救助測試平臺法規(guī)要求工業(yè)吸引力勞動力問題第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產(chǎn)品的優(yōu)點操作人員不需要技術(shù)背景周轉(zhuǎn)時間的改善提高了治療的忠誠度檢測越好，做的越頻繁樣品量少經(jīng)濟(jì)利益減少住院天數(shù)減少并發(fā)癥第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產(chǎn)品的優(yōu)點：周轉(zhuǎn)時間摘自Price,BMJ2001的文章試驗實驗室POCT分鐘（變化%）尿液分析404-36（90）妊娠785-71（94）葡萄糖106-4（60）第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT產(chǎn)品的缺陷操作者無技術(shù)背景結(jié)果質(zhì)量差，與實驗室結(jié)果有一定差異不經(jīng)濟(jì)資料不便記錄第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來當(dāng)前POCT的應(yīng)用（1）1、乳膠凝集試驗實驗時間為10-15分鐘快速、基本不需要儀器試劑可以冷凍敏感性差8-10%的反應(yīng)結(jié)果不好解釋2、直接熒光抗體試驗30-60分鐘，需要多個步驟需要有昂貴的熒光顯微鏡及熟練的操作人員第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來當(dāng)前POCT的應(yīng)用（2）3、FISH(熒光原位雜交）需要一段已知的DNA序列需要一臺熒光顯微鏡，且有熟練顯微鏡操作的人員步驟多，實驗時間為1-2小時4、免疫層析（滲濾）試驗敏感性高、特異性強(qiáng)總實驗時間5-15分鐘不需要儀器、也不需要基本的培訓(xùn)樣品不需要特殊處理免疫層析（滲濾）產(chǎn)品是繼尿試紙條和血糖試條之后，當(dāng)前最為受歡迎的POCT產(chǎn)品第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來免疫滲濾試驗主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。A：金標(biāo)記抗體B：標(biāo)本中的抗原C：包被抗體D：NC膜E：吸水材料F：塑料盒第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來免疫層析試驗免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流（lateralflow）)向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區(qū)域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后通過標(biāo)記物顯色來判定試驗結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗。第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、快速免疫檢測技術(shù)的過去、現(xiàn)狀和未來POCT的未來？？？？微流體技術(shù)？納米技術(shù)？第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹能用來做什么傳染病抗原或抗體測定腫瘤標(biāo)志物測定激素測定農(nóng)藥殘留測定抗生素測定毒素測定藥物濫用（毒品）測定第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹針對檢驗、我們能做什么傳染病抗原或抗體測定腫瘤標(biāo)志物測定？？？？激素測定農(nóng)藥殘留測定抗生素測定毒素測定藥物濫用（毒品）測定立足需求，充分考慮和整合各種優(yōu)勢資源！第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹我們要怎么去做調(diào)研：我們要做采用什么平臺技術(shù)平臺建設(shè)：我們建立快速免疫層析技術(shù)平臺項目：我們要做什么項目？準(zhǔn)備：我們擁有了哪些資源，我們還缺少什么資源？第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹免疫層析技術(shù)平臺硬件：實驗室；設(shè)備；生產(chǎn)車間？軟件：SOP?人員：專業(yè)培訓(xùn)、團(tuán)隊建設(shè)第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹如何去開發(fā)一個膠體金層析產(chǎn)品

——以尿妊娠試紙（HCG)為例第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的反應(yīng)原理圖雙抗體夾心法第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的產(chǎn)品研發(fā)準(zhǔn)備1、生物材料的準(zhǔn)備：配對的單克隆抗體（特異性針對HCG-α,β亞基)二抗2、主要生產(chǎn)材料硝酸纖維素膜（特定孔徑、流速）樣品墊結(jié)合墊吸收墊（吸水紙）、片材（PVC襯板）等第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)的研發(fā)準(zhǔn)備3、主要設(shè)備點膜儀噴金儀干燥設(shè)備粘帖裝置切刀第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制1、特異性的單克隆抗體親和力特異性穩(wěn)定性第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制2、標(biāo)記物與蛋白偶聯(lián)顆粒大小顆粒的均一性顆粒的形狀標(biāo)記物與蛋白的最佳比例標(biāo)記影響影響因素考慮第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制蛋白與膠體金的偶聯(lián)：最佳pH測定：取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調(diào)為3，4，5，6，7，8，9，10；加入過量待標(biāo)記蛋白；取96孔培養(yǎng)板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100μl加入孔中，重復(fù)三次；每孔分別加入20μl濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制蛋白與標(biāo)記物的偶聯(lián)：最佳偶聯(lián)比例確定：以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml10%氯化鈉。第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制3、樣品墊

玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。樣品墊的作用：減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布；去除樣品中雜質(zhì)顆粒；調(diào)節(jié)樣品等。樣本墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通常可以將洗滌劑、粘性增強(qiáng)劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復(fù)雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制4、結(jié)合墊玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為：

-吸附一定量的標(biāo)結(jié)合物顆粒；

-吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；

-保持標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；

-保證標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維素膜(Nitrocellulose)：推薦使用Millipore，S&S等國外公司的硝酸纖維素膜。

NC膜的作用：-在檢測線和對照線條帶區(qū)域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；

-反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測結(jié)果

NC膜的重要參數(shù)：孔徑、對稱性、層析速度、蛋白結(jié)合力、強(qiáng)度、表面質(zhì)量、厚度、批間均一性等。第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維膜硝酸纖維膜的分類標(biāo)準(zhǔn)(μm和s)μm:指的是膜孔徑，此說法實際上是沿用了一直以來的一個形象稱呼。

s:以秒為單位的定義為，每4cm膜，水的層析時間是**s.

換算情況大致為：8μm=135s；6μm=180s不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時間也就越短，讀數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時間長，讀數(shù)慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應(yīng)時間越長，發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時間的反應(yīng)不一定就能夠真正的提升靈敏度。

135s一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法.

第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制5、硝酸纖維膜如何選擇物理性能膜的物理性能主要是2個參數(shù)，膜厚度和寬度厚度不均勻影響生物原料在膜上的擴(kuò)散性能，點出來的C/T線寬窄不一，另外也影響爬速；寬度(檢測區(qū)的長度)和爬速及靈敏度的關(guān)系跑水性能注入足夠溶液到槽內(nèi)，將不同批次膜每隔1cm做一次標(biāo)記（總長大于4cm）并放到傾斜支架，整個支架下端放入溶液槽，膜開始吸液，計時。記錄每個標(biāo)記處的通過時刻，并與對照組比較。跑板時，理論上溶液呈水平線形式上吸，觀測是否有波浪傾斜或包圍潤濕等反?，F(xiàn)象。點樣測試

C/T線出線時間和靈敏度

第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、快速免疫層析技術(shù)的應(yīng)用介紹尿妊娠試紙（HCG)部分材料的工藝和質(zhì)量控制6、吸收墊