TSPOT-TB-不含醫(yī)院名稱

TSPOTTB不含醫(yī)院名稱TSPOTTB不含醫(yī)院名稱TSPOTTB不含醫(yī)院名稱TSPOTTB不含醫(yī)院名稱TSPOTTB不含醫(yī)院名稱1一、背景一、背景2公司成立于2003年，依托牛津大學(xué)科研技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品基于T細(xì)胞檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)最先獲得認(rèn)可產(chǎn)品：T-SPOT?.TB在歐洲、美國(guó)、加拿大和其它地區(qū)正式上市OxfordImmunotec公司簡(jiǎn)介Above:UKheadquartersAbingdon,OxonBelow:USheadquarters,Marlborough,MAOxfordImmunotec公司簡(jiǎn)介Above:UK3結(jié)核病——全球關(guān)注的問題全球20億人口感染結(jié)核新增活動(dòng)性結(jié)核病人約900萬/年每年130萬患者死亡中國(guó)450萬活動(dòng)性結(jié)核病人新增活動(dòng)性結(jié)核病人約145萬/年死亡人數(shù)約13萬/年試劑盒研制臨床背景結(jié)核病——全球關(guān)注的問題試劑盒研制臨床背景4活動(dòng)性結(jié)核及潛伏感染接觸活動(dòng)性結(jié)核病患者暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機(jī)體免疫力清除沒有癥狀,結(jié)核桿菌仍舊存在而不能被偵測(cè)

X-光/CT掃描顯示正常沒有抗體應(yīng)答診斷困難傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測(cè)只有TST（PPD）機(jī)體被感染受機(jī)體免疫力抑制沒有臨床癥狀終身處于感染狀態(tài)潛伏感染有臨床癥狀具有傳染性結(jié)核桿菌可以通過涂片、培養(yǎng)檢測(cè)出胸部的X-光或CT掃描顯示異常

肺外結(jié)核難以診斷(特別是兒童)活動(dòng)性結(jié)核5%5%再次激活活動(dòng)性結(jié)核及潛伏感染接觸活動(dòng)性結(jié)核病患者暴露程度不足，結(jié)核桿5控制結(jié)核的關(guān)鍵早發(fā)現(xiàn)早治療控制結(jié)核的關(guān)鍵早發(fā)現(xiàn)6二、方法原理二、方法原理7γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs，interferon-gammareleaseassays）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT，Enzyme-LinkedImmunoSpotassay）結(jié)核桿菌特異抗原早期抗原靶6（ESAT-6，earlysecretedantigenictarget6）培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10，culturefiltrateprotein10）試劑盒研制技術(shù)背景γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)試劑盒研制技術(shù)背景8γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs）TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞γ干擾素γ干擾素檢測(cè)陰性γ干擾素檢測(cè)陽(yáng)性γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs）TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞9結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀。基于IGRAs原理的產(chǎn)品目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等國(guó)家寫入本國(guó)的結(jié)核診療指南中γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs）結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（101983年，在南北兩個(gè)半球地理位置相距遙遠(yuǎn)的兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)、獨(dú)立地創(chuàng)立了這項(xiàng)技術(shù)。一個(gè)研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當(dāng)時(shí)正在當(dāng)?shù)豈argaret女王醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)研究所攻讀博士學(xué)位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一個(gè)研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物系的學(xué)者CecilC.Czerkinsky（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）1983年，在南北兩個(gè)半球地理位置相距遙遠(yuǎn)的兩個(gè)研究小組幾乎11近二十多年來，隨著抗體制備、PVDF膜材料等技術(shù)改良，ELISPOT分析技術(shù)已經(jīng)是當(dāng)世公認(rèn)的最靈敏的抗原特定T細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況，靈敏度高。其技術(shù)原理，可一句話概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD2005）。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）近二十多年來，隨著抗體制備、PVDF膜材料等技術(shù)改良，ELI12酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）13由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6及CFP10抗原結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6及CFP10抗原14采用γ-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)原理，依靠結(jié)核特異抗原保證效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的特異性結(jié)合酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)的特性，提高檢測(cè)靈敏度TSPOT-TB-不含醫(yī)院名稱15三、試劑及檢測(cè)過程三、試劑及檢測(cè)過程16試劑盒主要原材料研究試劑盒主要原材料研究17試劑盒主要組成成分結(jié)核桿菌特異抗原（ESAT-6、CFP10）植物血凝素（PHA）對(duì)照抗原預(yù)包被的培養(yǎng)板、標(biāo)記二抗、底物顯色液試劑盒主要組成成分18國(guó)外上市情況2004年-英國(guó)MHRA認(rèn)證和歐盟CE認(rèn)證（EU）2005年-加拿大上市許可2006年-韓國(guó)上市許可2008年-美國(guó)FDA的PMA認(rèn)證2010年-中國(guó)、新加坡和俄羅斯的產(chǎn)品注冊(cè)

試劑盒國(guó)外上市及應(yīng)用情況國(guó)外上市情況試劑盒國(guó)外上市及應(yīng)用情況19采集樣本（外周抗凝全血）密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）洗滌PBMCs檢測(cè)過程檢測(cè)過程20把PBMCs及結(jié)核特異抗原一同加入到預(yù)包被抗γ-干擾素抗體的培養(yǎng)孔中37℃二氧化碳孵育16-20小時(shí)檢測(cè)過程檢測(cè)過程21洗滌培養(yǎng)孔加標(biāo)記二抗孵育1小時(shí)檢測(cè)過程檢測(cè)過程22洗滌培養(yǎng)孔加顯色液用蒸餾水終止反應(yīng)檢測(cè)過程檢測(cè)過程231個(gè)斑點(diǎn)=1個(gè)效應(yīng)T細(xì)胞檢測(cè)過程檢測(cè)過程24陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果空白對(duì)照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽(yáng)性對(duì)照（PHA）實(shí)際效果圖陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果空白對(duì)照實(shí)際效果圖25四、比較四、比較26結(jié)核病的常規(guī)診斷方法（1）細(xì)菌學(xué)檢查是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但涂片陽(yáng)性率低，培養(yǎng)又耗費(fèi)時(shí)日（2）分子生物學(xué)檢查雖然快速、靈敏，但操作煩瑣、技術(shù)要求高（3）結(jié)核抗體診斷診斷價(jià)值有限，但其簡(jiǎn)便、快速，可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法之一（4）PPD（TST）實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)的結(jié)核感染檢測(cè)方法，對(duì)于接種過卡介苗(BCG)或環(huán)境分枝桿菌感染的受試者會(huì)出現(xiàn)一定的假陽(yáng)性結(jié)果，對(duì)于使用激素或免疫抑制劑的受試者會(huì)出現(xiàn)一定的假陰性結(jié)果結(jié)核病的常規(guī)診斷方法271、方法學(xué)比較——細(xì)菌學(xué)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)——涂片、培養(yǎng)結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”涂片：快速，簡(jiǎn)便，特異性較好，靈敏度差培養(yǎng)：耗時(shí)長(zhǎng)，特異性高，靈敏度稍高于涂片——美國(guó)FDA臨床數(shù)據(jù)——國(guó)內(nèi)臨床數(shù)據(jù)——國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)1、方法學(xué)比較——細(xì)菌學(xué)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)282、結(jié)核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陰性結(jié)果：1、表示未受結(jié)核菌感染2、某些情況下不排除已受結(jié)核菌感染,使用免疫抑制劑等;免疫功能低下如重癥結(jié)核病,慢性消耗性疾病,腫瘤,艾滋病,高齡等。3、陰性也不表示沒有結(jié)核感染.值得注意的是假陰性情況,在臨床上有感染結(jié)核的確切依據(jù)而患者PPD試驗(yàn)卻陰性,這種情況常見于以下疾?。撼醮胃腥窘Y(jié)核菌4～8周以內(nèi),重度營(yíng)養(yǎng)不良,惡性腫瘤,機(jī)體免疫缺陷性疾?。ㄏ忍煨悦庖呷毕莅Y,艾滋?。?免疫抑制劑使用者等,個(gè)別老年人因機(jī)體變態(tài)反應(yīng)功能低下也常呈陰性反應(yīng)。2、結(jié)核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陰性結(jié)果：29結(jié)核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陽(yáng)性結(jié)果：1.一般陽(yáng)性和中度陽(yáng)性：結(jié)核病現(xiàn)癥患者；已受結(jié)核菌感染但并不意味著發(fā)病或患??；卡介苗接種所致變態(tài)反應(yīng)；2.強(qiáng)陽(yáng)性：結(jié)核病患者；感染結(jié)核菌未發(fā)病者.強(qiáng)陽(yáng)性人群結(jié)核病的發(fā)病率高,在未找到病變時(shí)可作預(yù)防性治療。

結(jié)核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陽(yáng)性結(jié)果：30T-SPOT.TB

及皮試的比較皮試TST(PPD)的影響因素1、免疫力狀況——年齡、藥物2、交叉反應(yīng)——卡介苗、環(huán)境分枝桿菌3、檢測(cè)操作、結(jié)果判斷T-SPOT.TB及皮試的比較皮試TST(PPD)的影響因31方法學(xué)比較——TSTVsT-SPOT.TB假陽(yáng)性—卡介苗接種—環(huán)境分枝桿菌假陰性—免疫力狀況—年齡（新生兒、老年人）—藥物特異性—不受卡介苗接種影響—不受環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度—基本不受免疫力狀況影響—肺外結(jié)核檢出率高—藥物、年齡方法學(xué)比較——TSTVsT-SPOT.TB假陽(yáng)性特異32例：研究數(shù)據(jù)293例懷疑結(jié)核病的非洲兒童平均年齡3歲，約46%HIV抗體陽(yáng)性，多數(shù)合并營(yíng)養(yǎng)不良57例確診結(jié)核病的兒童中，ELISPOT陽(yáng)性率81%；TST陽(yáng)性率35%年齡、HIV感染狀態(tài)和營(yíng)養(yǎng)不良的嚴(yán)重程度對(duì)ELISPOT結(jié)果無影響，但均能導(dǎo)致TST結(jié)果的顯著差異LiebeschuetzetalLancet.2004例：研究數(shù)據(jù)293例懷疑結(jié)核病的非洲兒童Liebeschue33方法學(xué)比較——TSTVsT-SPOT.TBT-SPOT.TBtestTSTStudiesofIGRASpecificityinSubjectsinLowEndemicitySettingsSubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%SubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%AdamsetalScandJInfectDis.2008;40(3):196-203.1800.0%100.0%

BocchinoetalEurJClinMircroInfectDis(2008)

May10*49510.2%89.8%50816.0%84.0%DetjenetalClinInfectDis2007Aug1;45(3):322-8*4012.5%97.5%401742.5%57.5%BarsegianetalJHospInf(2008)epubaheadofprint9511.1%98.9%953233.7%66.3%ClarketalClin&ExpImmunol2007Nov;150(2):238-444700.0%100.0%

DhedaetalAIDS200519;2038-411800.0%100.0%

MeieretalEJCMID200524;529-5361100.0%100.0%1100.0%100.0%SUBTOTAL(T-SPOTvs.TSThead:headstudiesonly)19573.6%96.4%1965729.1%70.9%方法學(xué)比較——TSTVsT-SPOT.TBT-SPO34五、臨床及評(píng)價(jià)五、臨床及評(píng)價(jià)351、將該產(chǎn)品（方法學(xué)IGRA）

寫入診療指南的國(guó)家（Guidelines）英國(guó)、愛爾蘭、德國(guó)、法國(guó)、意大利、瑞士、荷蘭、葡萄牙、丹麥、挪威美國(guó)、加拿大日本、韓國(guó)、澳大利亞等1、將該產(chǎn)品（方法學(xué)IGRA）

寫入診療指南的國(guó)家（Guid36TSPOT-TB-不含醫(yī)院名稱37指南解讀（一）建議用IGRA替代TST用于結(jié)核篩查德國(guó)、英國(guó)、瑞士、丹麥、波蘭等適用于抗TNF-α

治療人群指南解讀（一）建議用IGRA替代TST用于結(jié)核篩查38指南解讀（二）TST和IGRA兩者均可美國(guó)、法國(guó)、澳大利亞、日本等卡介苗(BCG)接種人群首選IGRA（美國(guó)）指南解讀（二）TST和IGRA兩者均可39指南解讀（三）兩步法：先用TST，再用IGRA以提高靈敏度及特異性加拿大、西班牙、荷蘭、韓國(guó)、澳大利亞等主要適用于接觸追蹤指南解讀（三）兩步法：先用TST，再用IGRA以提高靈敏度及402、應(yīng)用方向1）結(jié)核病輔助診斷/療效評(píng)價(jià)“菌陰”結(jié)核病患者的輔助診斷肺外結(jié)核的鑒別診斷抗癆治療的療效評(píng)價(jià)2）免疫力低下/受抑制患者的結(jié)核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結(jié)核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3）兒童結(jié)核病的輔助診斷4）結(jié)核密切接觸者/高危人群的結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者的家屬/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5）接觸追蹤2、應(yīng)用方向1）結(jié)核病輔助診斷/療效評(píng)價(jià)41對(duì)于“涂陰”結(jié)核病患者有很高的檢出率（94.2%）對(duì)于肺外結(jié)核病患者有很高的檢出率（90.3%）對(duì)于結(jié)核潛伏感染的檢測(cè)，不受卡介苗（BCG）接種影響，比PPD檢測(cè)更準(zhǔn)確不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)量的多少來判斷受試者是活動(dòng)性結(jié)核病患者或是潛伏感染者對(duì)于結(jié)核/癌癥患者的鑒別診斷，須結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行判斷對(duì)于“涂陰”結(jié)核