分子生物學(xué)-第四章-核酸的體外擴(kuò)增

核酸的體外擴(kuò)增第四章核酸的體外擴(kuò)增第四章1第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)第一節(jié)聚合酶鏈反應(yīng)2一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)史PCR的最早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史,20世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。PCR的實(shí)現(xiàn)1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件：模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系，以及DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。一、PCR3

4PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都需要重新添加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。PCR的改進(jìn)與完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸51988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別，將此酶命名為TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱6二、PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：②退火（annealing）（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，將溫度降至引物的Tm值左右或以下（55℃左右），引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，形成雜交鏈；①變性（denature）：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；1、基本原理（已知目的片段兩側(cè)的堿基序列）二、PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，7③延伸(extension)：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。以上三步為一個(gè)循環(huán)，約需2～4分鐘，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，大約2～3小時(shí)后，新生DNA片段理論上可達(dá)到230拷貝，約為109個(gè)分子。③延伸(extension)：DNA模板--引物結(jié)合物在Ta8PCR反應(yīng)的基本原理示意圖TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT

ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA

變性（950C，30s）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA退火（450C～550C，30s～1min）ataagcccgaaaggttcgtttatccaacggctaggcattt

5′5′5′5′3′3′3′3′PCR反應(yīng)的基本原理示意圖TATTCGGGCTTTCCAAG9TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAataagcccgaaaggttcgtttatccaacggctaggcattt

延伸（720C，1～幾分鐘）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt循環(huán)25～305′3′5′3′5′5′3′3′TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG......102、PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增遵循酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原則。反應(yīng)初期，目的DNA片段的增加呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的逐漸積累，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的增加減慢，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，又稱“平臺(tái)期”。到達(dá)平臺(tái)期所需要的PCR循環(huán)數(shù)取決于樣品模板的拷貝數(shù)、PCR的擴(kuò)增效率以及DNA聚合酶種類和活性，以及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。多數(shù)情況下，平臺(tái)期在PCR反應(yīng)中不可避免。但在平臺(tái)期之前，擴(kuò)增的目的DNA片段數(shù)量已經(jīng)滿足實(shí)驗(yàn)的需要，如果產(chǎn)量不夠，可將產(chǎn)物DNA樣品稀釋后作為模板，進(jìn)行新一輪PCR反應(yīng)。2、PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增遵循酶111、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（50～100μl）

三、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件10×緩沖液1/10體積

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各1umol/L

模板DNA102～105拷貝TaqDNA聚合酶1～5u

Mg2+1.5mmol/L

雙蒸水至50～100ul1、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（50～100μl）三、PCR反122、PCR引物設(shè)計(jì)①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

③引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列：④兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3′端的互補(bǔ)重疊。PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上游的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則：2、PCR引物設(shè)計(jì)①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20b13⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。⑥引物3′端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。⑦引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末143、模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，常見的病原體標(biāo)本有病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等。病理生理標(biāo)本有細(xì)胞、血液、絨毛、羊水細(xì)胞、尿液、上皮細(xì)胞、體外培養(yǎng)細(xì)胞系。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。3、模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。154、PCR反應(yīng)條件的控制（一）PCR反應(yīng)的緩沖液

提供合適的酸堿度與某些離子（二）鎂離子濃度

總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L（三）底物濃度

dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L（四）TaqDNA聚合酶

2.5U（100ul）（五）引物

濃度一般為0.1～0.5umol/L4、PCR反應(yīng)條件的控制（一）PCR反應(yīng)的緩沖液16（六）反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)①變性溫度和時(shí)間

950C，30s②退火溫度和時(shí)間

低于引物Tm值50C左右，一般在45～550C③延伸溫度和時(shí)間

720C，1min/kb（10kb內(nèi)）④循環(huán)次數(shù)

25～30次Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)（六）反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)①變性溫度和時(shí)間9517四、PCR反應(yīng)特點(diǎn)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；（關(guān)鍵）

②堿基配對(duì)原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

④靶基因的特異性與保守性。1、特異性強(qiáng)2、靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。四、PCR反應(yīng)特點(diǎn)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

①183、簡(jiǎn)便、快速

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。4、對(duì)標(biāo)本的純度要求低3、簡(jiǎn)便、快速不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制19五、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

1、凝膠電泳分析

瓊脂糖凝膠電泳：通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。2、酶切分析

3、分子雜交

4、核酸序列分析

五、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析1、凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳：201234

54：PCR擴(kuò)增結(jié)果123421六、PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對(duì)策所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽(yáng)性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽(yáng)性問題。（一）假陰性：應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性。最常見的原因：1、TaqDNA聚合酶活力不夠或活性受到抑制2、引物設(shè)計(jì)不合理3、提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)4、PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)（如溫控不準(zhǔn)）5、循環(huán)次數(shù)不夠離心機(jī)的質(zhì)量或使用不正確，造成離心標(biāo)本模板沒有分離出來(lái)造成假陰性。6、離心機(jī)問題六、PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對(duì)策所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)22在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶、增加5-10次循環(huán)。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用TaqDNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時(shí)，首先在原來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加23PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。因?yàn)镻CR技術(shù)高度靈敏，極其微量的靶基因污染都會(huì)造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤，所以污染是PCR假陽(yáng)性的主要根源。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。（二）假陽(yáng)性PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)24（三）污染1、標(biāo)本間交叉污染標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。2、PCR試劑的污染主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。（三）污染1、標(biāo)本間交叉污染25還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.

4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見.因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大.還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染26七、PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展

1、筑巢PCR先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴(kuò)增獲取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特異性。2、共享引物PCR利用3條引物擴(kuò)增兩種不同的DNA序列，其中一條引物與兩種待擴(kuò)序列都互補(bǔ)，它與另兩條引物分別組成兩對(duì)PCR引物。常用于確定同屬細(xì)菌的不同種。七、PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展1、筑巢PCR先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含273、多重PCR4、不對(duì)稱PCR在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，由于每一對(duì)引物與模板DNA的不同片段相結(jié)合，因而擴(kuò)增片段長(zhǎng)短不同。由此可檢測(cè)是否存在某些基因片段的缺失或突變。兩條引物使用不同的濃度，在低濃度引物逐漸耗盡時(shí)，高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA。（獲取單鏈DNA）3、多重PCR4、不對(duì)稱PCR在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，由于285、錨定PCRmRNA或總RNA3′5′5′3′合成第一鏈cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶5′3′GG…GG末端轉(zhuǎn)移酶5′3′GG…GGCC…CC擴(kuò)增（用于欲擴(kuò)增片段旁側(cè)序列不清楚時(shí)獲取目的片段）5、錨定PCRmRNA或總RNA3′5′5′3′合成第一鏈c296、反向PCR（擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知序列）已知序列酶切環(huán)化PCR6、反向PCR（擴(kuò)增已知DNA序列兩側(cè)的未知序列）已知序列酶309、重組PCR7、彩色PCR8、原位PCR用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記引物5′端，擴(kuò)增后產(chǎn)物可發(fā)出不同顏色的熒光。將組織固定，處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用合成帶突變的引物，復(fù)制完整的突變基因。（研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系）9、重組PCR7、彩色PCR8、原位PCR用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)3111、定量PCR10、差異顯示PCR（篩選和克隆差異表達(dá)基因）將所要比較的兩種mRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA第一鏈，再用3′錨定引物和5′隨機(jī)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過電泳比較PCR產(chǎn)物的差異片段，再經(jīng)過片段回收、再擴(kuò)增和mRNA雜交分析、克隆及序列分析，最終確定差異表達(dá)的基因。（對(duì)mRNA進(jìn)行定量測(cè)定）用PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)的DNA含量來(lái)推測(cè)模板DNA的量，通常用正常穩(wěn)定表達(dá)的基因作參照。11、定量PCR10、差異顯示PCR（篩選和克隆差異表達(dá)基因32第二節(jié)連接酶鏈反應(yīng)（Ligasechainreaction，LCR）

連接酶鏈反應(yīng)的最大優(yōu)勢(shì)在于能準(zhǔn)確地分析基因序列中單個(gè)堿基突變。LCR的引物是兩對(duì)分別互補(bǔ)的引物，引物長(zhǎng)度為20～26個(gè)。LCR識(shí)別點(diǎn)突變的特異性高于PCR，其特異性首先取決于引物與模板的特異性結(jié)合，其次是耐熱連接酶的特異性。LCR的基本原理：利用DNA連接酶特異地將雙鏈DNA片段連接，經(jīng)變性-退火-連接三步驟反復(fù)循環(huán)。若引物對(duì)與模板完全互補(bǔ)，則在DNA連接酶作用下，使得相鄰兩個(gè)引物A和B、A′和B′連接、擴(kuò)增。若引物所對(duì)應(yīng)的模板發(fā)生了堿基突變，引物間就不能連接和擴(kuò)增。第二節(jié)連接酶鏈反應(yīng)（Ligasechainrea33LCR原理示意圖變性3′5′5′3′退火3′5′5′3′3′5′5′3′AA′BB′連接3′5′5′3′變性、退火、連接3′5′5′3′LCR原理示意圖變性3′5′5′3′退火3′5′5′3′3′34第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT—PCR）所謂逆轉(zhuǎn)錄，是指以RNA為模板，利用宿主細(xì)胞中4種dNTP為原料在引物的3′端以5′3′方向合成與RNA互補(bǔ)的DNA鏈的過程，此過程與中心法則相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）。在逆轉(zhuǎn)錄過程中以RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptionase）。實(shí)際上，逆轉(zhuǎn)錄并非轉(zhuǎn)錄，而是一種復(fù)制形式，必須有引物存在才能完成。一、逆轉(zhuǎn)錄第三節(jié)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT—PCR）所謂逆轉(zhuǎn)錄，是指以35二、逆轉(zhuǎn)錄酶1970年Temin在Rous肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，以后發(fā)現(xiàn)所有RNA腫瘤病毒中都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶是逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA編碼的，是多功能酶：①具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，能和其它DNA聚合酶一樣，沿5′3′

方向合成DNA，并需要引物提供3′—OH；②具有RNA酶H（RNaseH）活性，能特異性水解RNA-DNA雜交體上的RNA；③具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，以逆轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA為模板合成互補(bǔ)DNA鏈。逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)DNA沒有3′5′外切酶活性，因此它沒有校對(duì)功能，錯(cuò)誤率相對(duì)較高。二、逆轉(zhuǎn)錄酶1970年