酶的分離工程

關(guān)于酶的分離工程第四章酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化：將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開而獲得所要求的酶制品的過程。第2頁,共116頁，2024年2月25日，星期天思考題：思考題1.名詞解釋：酶的抽提、離子交換層析、凝膠層析、凝膠電泳、酶的結(jié)晶2.酶分離純化的特點(diǎn)、基本環(huán)節(jié)有哪些？3如何根據(jù)酶的性質(zhì)選擇分離純化方法4寫出三種分離純化酶蛋白的方法，并簡述其原理。

5細(xì)胞破碎的目的、方法及原理。

6酶抽提的目標(biāo)、方法及影響因素。。第3頁,共116頁，2024年2月25日，星期天思考題7.酶液制備的過程有哪些？8.說明有機(jī)溶劑沉淀分離法的優(yōu)缺點(diǎn)。9.酶的結(jié)晶方法有哪些？10.分析說明酶分離純化的應(yīng)用第4頁,共116頁，2024年2月25日，星期天[教學(xué)目的]

了解酶的分離純化方法；掌握酶生產(chǎn)、研究的重要環(huán)節(jié)：酶的分離流程與各單元操作的原理。[重點(diǎn)與難點(diǎn)]1、如何運(yùn)用本章所學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)（如分子質(zhì)量、pI、帶電狀態(tài)、亞基組成、溶解性等）進(jìn)行研究。2、如何耦合與集成酶分離工程的單元操作。[課堂教學(xué)設(shè)計(jì)]

圖示以講清復(fù)雜的原理，生產(chǎn)科研實(shí)例與理論相結(jié)合。[教學(xué)時(shí)數(shù)]5學(xué)時(shí)第5頁,共116頁，2024年2月25日，星期天生物分離是從生物材料、微生物的發(fā)酵液、生物反應(yīng)液或動(dòng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)液中分離并純化有關(guān)產(chǎn)品（如具有藥理活性作用的蛋白質(zhì)等）的過程，又稱為下游加工過程。第6頁,共116頁，2024年2月25日，星期天作業(yè)題1.根據(jù)酶生物合成的模式及產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)，設(shè)計(jì)發(fā)酵工藝條件，提出提高產(chǎn)酶量的措施，請(qǐng)舉例說明。2.說明為什么酶的分離純化每步均要檢測總蛋白、總活力、比活力、純化倍數(shù)、回收率，總個(gè)流程中他們變化趨勢如何？他們能代表純化的目標(biāo)（純度、數(shù)量、速度、收率）嗎？為什么？3.比較吸附層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析在原理、操作(裝柱、過柱）及應(yīng)用方面的異同點(diǎn)。第7頁,共116頁，2024年2月25日，星期天作業(yè)題4.比較說明用于酶層析分離的層析介質(zhì)應(yīng)該具有的共性和個(gè)性：它們是吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析。5.用于表明酶純度的是哪種電泳？用于制備的是哪種電泳？原理？第8頁,共116頁，2024年2月25日，星期天作業(yè)題6.等密度梯度離心、層析聚焦與等電聚焦電泳有何異同？7.離子交換纖維素為什么較離子交換樹脂更常用于酶等大分子物質(zhì)的分離？第9頁,共116頁，2024年2月25日，星期天酶的分離純化策略一原則二方法選擇三純化策略四純見檢定第10頁,共116頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)注意的問題：一、防止酶的變性失活

1.低溫操作

2.控制pH

3.減少泡沫形成

4.防重金屬、有機(jī)溶劑、微生物污染

5．防止提純過程中丟失一些輔助因子或亞基二、選擇有效的純化方法三、酶活性測定貫穿純化過程的始終。第11頁,共116頁，2024年2月25日，星期天酶分離純化的一般步驟:層析法電泳法超離心法透析和超濾鹽析（硫酸銨鹽析）等點(diǎn)電沉淀有機(jī)溶劑沉淀離心│←前處理→│←粗分級(jí)→│←細(xì)分級(jí)→│材料選擇與處理細(xì)胞破碎（機(jī)械破碎、溶漲和自溶、酶解、化學(xué)處理）有效成分的抽提生物組織→→提取液→

→粗產(chǎn)品→→結(jié)晶分子大小溶解度電荷性質(zhì)吸附性質(zhì)生物親和力依據(jù)原理第12頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)酶溶液的制備（前處理）把酶從生物原料中抽提出來，作成酶溶液。酶溶液的制備包括：材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎、抽提、凈化脫色、抽提液的濃縮等幾個(gè)步驟。第13頁,共116頁，2024年2月25日，星期天一、材料預(yù)處理及細(xì)胞破碎（一）材料預(yù)處理酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：胞外酶，胞內(nèi)酶（游離酶和膜結(jié)合酶）。微生物胞外酶可以用鹽析或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀成酶泥；胞內(nèi)酶要先收集菌體，經(jīng)細(xì)胞破碎后提取；動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織等；植物材料應(yīng)避免單寧等物質(zhì)著色污染。第14頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細(xì)胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同。（二）細(xì)胞破碎1、機(jī)械破碎法2、物理破碎法3、化學(xué)破碎法4、酶促破碎法第15頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1）搗碎法利用搗碎機(jī)高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。一般用于動(dòng)物組織，植物肉質(zhì)種子，柔嫩的葉，芽等材料的破碎。

2）研磨法利用研缽、石磨、細(xì)菌磨、球磨等研磨器械所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。助磨劑：精制石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化鋁工業(yè)：高速珠磨機(jī)（High-speedbeadmill）如：Dyno-mill球磨機(jī)第16頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3）勻漿法（homogenization）利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。勻漿器的研杵的磨球和玻璃管內(nèi)壁之間間隙常保持在十分之幾毫米距離。破碎細(xì)胞的程度比組織搗碎機(jī)高。大型細(xì)胞破碎器：Manton-Gaulin勻漿器主要是高壓下使細(xì)胞通過小孔隙而被擠碎，每小時(shí)可處理數(shù)十升至數(shù)千升樣品，適用于微生物發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。對(duì)于酵母等難破碎及高濃度細(xì)胞可采用多次循環(huán)方法絲狀真菌、較小的G+菌不宜用此法第17頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1）壓力差破碎法高壓沖擊法、突然降壓法（如：爆破性減壓法）2）溫度差破碎法反復(fù)凍融多次,由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎.

3）超聲波破碎法（Ultrasonication）

桿菌比球菌容易破碎

G-比G+容易破碎酵母菌不易破碎第18頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1）滲透作用：將指數(shù)生長期的菌體用緩沖液洗凈，并懸浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris緩沖液中，離心，加入MgCl2劇烈攪拌，可使一些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來；2）自溶：向菌體中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變保持一定時(shí)間后可以使細(xì)胞自溶；3）表面活性劑：膜結(jié)合的酶在細(xì)胞破碎后很難溶解，常借助于表面活性劑與脂蛋白形成微泡，使之溶解。3、化學(xué)破碎法第19頁,共116頁，2024年2月25日，星期天lysozyme、protease、cellulase、zymolyase

價(jià)格高，通用性差，產(chǎn)物抑制的存在用溶菌酶專一性地分解原核微生物細(xì)胞壁，使胞內(nèi)酶釋放。4、酶促破碎法（Enzymaticlysis）第20頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（一）酶提取的方法（二）影響酶提取的主要因素二、酶的提取大多數(shù)酶蛋白是屬于球蛋白，因此，可用稀鹽，稀堿或稀酸的水溶液進(jìn)行抽提；抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)的連結(jié)。第21頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1、鹽溶液提取一般采用稀鹽溶液進(jìn)行酶的提取，濃度一般控制在0.02~0.5mol/L。常采用等滲溶液，即0.125mol/LNaCl和0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸緩沖液或0.1mol/LTris-HCl。必要時(shí)，緩沖液中可加入EDTA（1~5mmol/L）、巰基乙醇（3~20mmol/L）等。例：酵母醇脫氫酶用0.5mol/LNa2HPO4溶液提取。6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取?？莶輻U菌堿性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。第22頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2、酸溶液提取例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取3、堿溶液提取例：細(xì)菌L-天冬酰胺酶可用pH11.0~12.5的堿溶液提取。pH值與酶的穩(wěn)定性相關(guān)，選擇pH不能超出酶的穩(wěn)定范圍，從抽提效果而言pH值要偏離目的酶等電點(diǎn)，也就是說酶如果是酸性蛋白質(zhì)則宜用稀堿溶液來抽提，反之堿性蛋白用酸來抽提。第23頁,共116頁，2024年2月25日，星期天4、有機(jī)溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶難溶于水,稀鹽,稀酸,或稀堿中,常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。

如植物種子中的酶，一般用70%~80%的乙醇來提取。動(dòng)物細(xì)胞微粒體中的酶用正丁醇來提取。常用的有機(jī)溶劑：乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等,這些溶劑可以與水互溶或部分互溶,同時(shí)具有親水性和親脂性。例：琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶、細(xì)胞色素氧化酶等，用丁醇提取，都取得良好效果。第24頁,共116頁，2024年2月25日，星期天影響酶提取的主要因素1、溫度為防止變性失活,制備具有活性的酶,提取溫度一般不易過高，一般在0℃~10℃的低溫操作.

但如果抽提的酶比較穩(wěn)定也可以用高溫。如胃蛋白酶可以在37℃抽提。第25頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2、pH值酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān).首先考慮酶的穩(wěn)定性；其次應(yīng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)；一般選擇pH4-6為宜。提取溶劑的pH應(yīng)在酶的穩(wěn)定范圍內(nèi),為了提高酶的溶解度，提取時(shí)pH值應(yīng)避開酶的等電點(diǎn)。第26頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3、提取液的體積一般為原料體積的3~5倍，最好分幾次提取。4、輔助因子：在提取操作時(shí)適當(dāng)加入底物或輔酶成分，可以改變提高酶的穩(wěn)定性。為了防止蛋白酶的降解作用，可加入PMSF（苯甲基磺酰氟）；為防止氧化，則加入半胱氨酸或巰基乙醇。第27頁,共116頁，2024年2月25日，星期天5、其他含酶原料顆粒大小、攪拌、提取時(shí)間。攪拌能促使被提取物的溶解,一般采用溫和攪拌為宜,速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫,增大了與空氣的接觸面,會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活.因?yàn)榈?8頁,共116頁，2024年2月25日，星期天三、酶溶液的絮凝、凈化與脫色（一）絮凝發(fā)酵液黏度較大，細(xì)胞表面電荷排斥以及多糖蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)形成的水化層等給酶溶液的離心或過濾帶來困難。通過絮凝劑處理后的酶溶液經(jīng)過離心或過濾將細(xì)胞碎片和雜蛋白、粘多糖、核酸以及脂類等大分子物質(zhì)去除。無機(jī)（如醋酸鈣和磷酸鈣等），有機(jī)（如聚丙烯酰胺等）和天然高分子（如殼多糖等）第29頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（二）過濾或離心凈化

1、離心分離——從細(xì)胞抽提物中除掉固體離心機(jī)的選擇：工業(yè)：連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)、間歇卸料的圓盤式離心機(jī)2、過濾——從細(xì)胞抽提物中除掉固體渦流膜過濾法（cross-flowmembranefiltration）第30頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3、雙水相萃取適用于直接從含有菌體等雜質(zhì)的酶液中提取純化目的酶。（1）原理：利用溶質(zhì)在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。雙水相系統(tǒng)是指某些高聚物之間或高聚物與無機(jī)鹽之間在水中以適當(dāng)?shù)臐舛热芙鈺?huì)形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)

開始于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)已應(yīng)用到酶、核酸、生長激素、病毒等分離提純。第31頁,共116頁，2024年2月25日，星期天雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)((Two-aqueousphaseextraction,簡稱ATPS)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下可以形成雙水相,由于被分離物在兩相中分配不同,便可實(shí)現(xiàn)分離第32頁,共116頁，2024年2月25日，星期天各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖甲基纖維素羧甲基葡聚糖、葡聚糖（Dex）乙基羥乙基纖維素羥丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉、甲酸鈉、酒石酸鉀鈉第33頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（2）影響酶在兩相中分配系數(shù)的因素1）兩相的組成2）高分子聚合物的分子量、濃度、極性等3）兩相溶液的比例4）酶的分子量、電荷、極性等5）溫度、pH值等第34頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（3）雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)雙水相體系為酶的溶解和抽提提供了適宜環(huán)境，而且處理容量大。設(shè)備簡單。操作方便、快速、條件溫和。不需處理就可與后續(xù)提純步驟相銜接。第35頁,共116頁，2024年2月25日，星期天幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實(shí)例酶菌種相系統(tǒng)延胡索酸酶BrevibacteriumspPEG/鹽天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽

-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽亮氨酸脫氫酶BacillussphaericusPEG/Dex乙醇脫氫酶Baker’syeastPEG/鹽青霉素?；窫.coliPEG/鹽第36頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（三）脫色

酶的工業(yè)生產(chǎn)中，常用的脫色劑為活性炭，活性炭通過吸附色素而脫色；活性炭用量一般為0.1%-1.5%。第37頁,共116頁，2024年2月25日，星期天四、酶溶液的濃縮冷凍干燥法：先將酶溶液凍成固體，然后在真空狀態(tài)下使水分子從固體表面直接升華。蒸發(fā)法：目前工業(yè)上采用較多的是薄膜蒸發(fā)法，在高度真空狀態(tài)下使酶溶液轉(zhuǎn)變?yōu)闃O薄的液膜，通過加熱而迅速汽化，經(jīng)旋風(fēng)式汽液分離器達(dá)到濃縮的目的。第38頁,共116頁，2024年2月25日，星期天超過濾法：將酶溶液通過只允許小分子物質(zhì)通過的微孔濾膜，大分子的酶蛋白被截留而達(dá)到濃縮的目的。膠過濾法：利用SephadexG-250或G-50吸水膨脹，而酶蛋白被排阻在膠的外面。其它方法：吸水劑如用聚乙二醇(PEG)處理小量樣品。干燥：將固體、半固體或濃縮液中水分（或其他溶劑）除去一部分，以獲得含水量較少的固體過程。方法：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥第39頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分離工程概念及步驟分離與提純從生物反應(yīng)器中排出的反應(yīng)產(chǎn)物是一種混合物，里面除含有目的產(chǎn)品外，還含有未轉(zhuǎn)化的基質(zhì)、不能轉(zhuǎn)化的物質(zhì)、大量的水、微生物體及各種微量雜質(zhì)。為了獲得合格的生化產(chǎn)品，并且不浪費(fèi)其他有用的物質(zhì)，必須對(duì)需要的生化產(chǎn)品進(jìn)行分離或提純。這一過程稱之為“下游加工”，這樣可以使其他物質(zhì)循環(huán)使用或再進(jìn)行綜合利用，既降低了成本又保護(hù)了環(huán)境。第40頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分離工程概念及步驟1．固體物質(zhì)的去除分離生化反應(yīng)液的細(xì)胞或其他固體物質(zhì)，是提取生化產(chǎn)品的重要一步。分離過程是基于它們的粒度、密度、溶解度和擴(kuò)散度等的不同實(shí)現(xiàn)的，分離的粒度范圍為0.3~10μm。為了提高分離效率要進(jìn)行預(yù)處理，以促進(jìn)細(xì)胞的絮凝。常用的去除固體的分離方法是過濾、離心分離、沉降及傾析等。第41頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分離工程概念及步驟2．初步分離當(dāng)從反應(yīng)器出來的反應(yīng)液除去了不需要的固體顆粒后，一般要進(jìn)一步把溶液濃縮，以提高目的產(chǎn)品在溶液中的濃度。為了實(shí)現(xiàn)這一過程，可以使用蒸發(fā)、萃取、沉淀和膜分離等單元操作。如膜分離技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)，近年來發(fā)展很快。它是用一種半透明的薄膜，使溶液中的某些組分通過，其他組分被阻止或截留，從而達(dá)到分離的目的。它包括反滲透法和超濾法。膜分離法不同于萃取和沉淀法那樣，需要加入溶劑或鹽類等其他物質(zhì)，也不同于蒸發(fā)操作，需要加入熱量，膜分離法只是根據(jù)物質(zhì)粒度的大小這一幾何特性的差異，來分離物質(zhì)，因此產(chǎn)品的損失很少，產(chǎn)率和質(zhì)量較高。第42頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分離工程概念及步驟3．產(chǎn)品提純產(chǎn)品提純的目的主要是去除溶液中的各種微量雜質(zhì)，進(jìn)一步提高產(chǎn)物的純度。常用的方法有沉淀法、層析法和吸附法。但是生物產(chǎn)品的提純，更多用的是層析法。層析法有吸附層析法、離子交換層析法、分子篩層析法和親和層析法等，根據(jù)不同被分離物的特性，選擇不同的層析分離方法。第43頁,共116頁，2024年2月25日，星期天分離工程概念及步驟4．產(chǎn)品的最終分離最后一步必須使產(chǎn)品達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量指標(biāo)，以適合銷售市場的要求。主要的單元操作是先離心分離，然后進(jìn)行干燥或冷凍干燥等。干燥操作往往是生物產(chǎn)品的最后工序，其目的是除去物料中的水分，便于產(chǎn)品的保藏和運(yùn)輸。由于很多的生物產(chǎn)品，如味精、檸檬酸、酶制劑、抗生素及單細(xì)胞蛋白等均是固體產(chǎn)品，因此干燥操作在生物產(chǎn)品的最終分離方面十分重要。第44頁,共116頁，2024年2月25日，星期天我國在工業(yè)生物技術(shù)的上游領(lǐng)域（細(xì)胞工程、基因工程等領(lǐng)域）和世界先進(jìn)水平差距較小，在某些方面甚至處于領(lǐng)先水平，但在工業(yè)生物技術(shù)的過程科學(xué)基礎(chǔ)研究方面與國外有較大的差距，尤其是過程放大原理和方法。我國生物技術(shù)新產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化能力差，缺少有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品中試、放大技術(shù)平臺(tái)，不能迅速把實(shí)驗(yàn)室成果轉(zhuǎn)化為工業(yè)產(chǎn)品，致使我國許多工業(yè)生物過程與發(fā)達(dá)國家相比普遍存在能耗高、資源綜合利用率低、環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品質(zhì)量差、工業(yè)放大周期長等問題，例如：我國較國外先進(jìn)水平工業(yè)原料利用率低10-20％，產(chǎn)品回收率低5-15％，而能量消耗高20-30％，操作方式粗放，排污嚴(yán)重。至今我國的大型工業(yè)生物過程依然主要依賴國外技術(shù)。第45頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)酶分離純化的基本過程一、酶分離純化方法的選擇

目前酶的分離純化方法都是根據(jù)酶與雜蛋白的性質(zhì)差異而建立的。在選擇分離純化方法時(shí)，要考慮以下幾個(gè)方面：首先對(duì)待純化的酶的理化性質(zhì)有比較全面的了解；以酶活力和比活力為標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選擇的方法是否得當(dāng)；嚴(yán)格控制操作條件，防止酶的變性失活。第46頁,共116頁，2024年2月25日，星期天評(píng)價(jià)分離純化方法優(yōu)劣的3個(gè)指標(biāo)

回收率：純化后樣品的總酶活占純化前樣品總酶活的百分比；總活力；比活力提高的倍數(shù)及重現(xiàn)性：比活力：特定條件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力單位數(shù)。比活力提高的倍數(shù)：純化后/純化前樣品比活力第47頁,共116頁，2024年2月25日，星期天快速有效的檢測方法是前提酶活力：最重要，全程。蛋白質(zhì)純度；雜質(zhì)分析。第48頁,共116頁，2024年2月25日，星期天表d長春花中Strictosidine合成酶的提純

步驟總蛋白（毫克）比活性*nKat/毫克蛋白總活力單位（nKat）產(chǎn)率%提純倍數(shù)（Ⅰ）粗抽提液（Ⅱ）硫酸銨沉淀（Ⅲ）DEAE-纖維素柱（Ⅳ）羥基磷灰石柱（Ⅴ）SephadexG-75（Ⅵ）等電聚焦65446638．75．90．720．080．0080．0110．100．642．85．95．25．13．93．82．00．5100987573381011．312．580350737．5第49頁,共116頁，2024年2月25日，星期天思考題

1.

細(xì)胞破碎的目的、方法及原理。2.

酶抽提的目標(biāo)及方法。3.

相對(duì)離心力、沉降系數(shù)及三種離心方法的特點(diǎn)。4.

常用沉淀法的種類及原理。5.

常用沉淀法的種類及原理。鹽析法分離蛋白質(zhì)的原理、種類及鹽析常數(shù)的含義。第50頁,共116頁，2024年2月25日，星期天思考題6.

雙水相萃取、超臨界流體萃取、反膠團(tuán)萃取的原理。7.

膜分離的種類、原理及應(yīng)用。8.

比較吸附層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析在原理、層析介質(zhì)、操作及應(yīng)用方面的異同點(diǎn)。9.

HPLC的產(chǎn)生特點(diǎn)及反向色譜的含義及分離依據(jù)。10.

比較連續(xù)與非連續(xù)、變性與非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)別。第51頁,共116頁，2024年2月25日，星期天思考題11.

結(jié)晶與沉淀的區(qū)別及酶結(jié)晶的條件及操作。12.

蛋白質(zhì)濃度測定方法及酶活力測定方法。13.

比活力、提純倍數(shù)、回收率的含義及用途。14.

總結(jié)脫鹽、濃縮、分子量測定的方法及原理。15.

等電聚焦的原理與用途。16.

親和層析的原理是什么？如何根據(jù)目的產(chǎn)物的性質(zhì)選擇洗脫方式？17.

電泳的基本原理是什么？電泳的種類有哪些？18.

SDS和等電聚焦電泳的原理和操作的不同之處是什么？19.

影響凝膠過濾分辨率的因素有哪些？分配系數(shù)的含義及作用。第52頁,共116頁，2024年2月25日，星期天性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）對(duì)配體分子親和層析的生物親和力一、酶分離純化方法的選擇第53頁,共116頁，2024年2月25日，星期天性質(zhì)方法規(guī)模大小或質(zhì)量離心大/小凝膠過濾小膜分離（透析、超濾）小電荷離子交換色譜大/小電泳小等電聚焦小溶解度改變pH值大改變離子強(qiáng)度大/小降低介電常數(shù)大特殊結(jié)合位置親和色譜小親和洗脫大/小第54頁,共116頁，2024年2月25日，星期天二、根據(jù)溶解度建立的分離方法（層淀分離）1、鹽析(SaltingOut)法

最常用的是硫酸銨。鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100%。調(diào)整鹽濃度有兩種方法：加入飽和硫酸銨溶液（蛋白質(zhì)溶液體積不大時(shí)）和直接加入固體硫酸銨（蛋白質(zhì)溶液體積較大時(shí)）。加入飽和硫酸銨：100ml溶液中，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)V=V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加入固體硫酸銨可以直接查“調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表”。第55頁,共116頁，2024年2月25日，星期天⑴基本原理

有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)(酶),核酸,多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用,是較早使用的沉淀方法之一.其原理主要是:

①降低水溶液的介電常數(shù),導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀.（F=Q1Q2/εr2

）

②由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶,它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子,破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜,因而發(fā)生沉淀作用.2、有機(jī)溶劑沉淀法常用：乙醇,甲醇和丙酮.第56頁,共116頁，2024年2月25日，星期天①分辨能力比鹽析法高,即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀.

②沉淀不用脫鹽,過濾比較容易(如有必要,可用透析袋脫有機(jī)溶劑).因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用.

有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是:

有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)：對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活,操作需在低溫下進(jìn)行.第57頁,共116頁，2024年2月25日，星期天

1)溫度:酶在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感,溫度稍高就會(huì)引起變性,且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng),因此有機(jī)溶劑必須預(yù)冷,操作要在冰鹽浴中進(jìn)行.一般都要在低溫下進(jìn)行（0℃±1℃）2)樣品濃度:低濃度樣品回收率低,要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀.高濃度樣品,可以節(jié)省有機(jī)溶劑,減少變性的危險(xiǎn),但雜蛋白的共沉淀作用大.

選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度才能達(dá)到較好的分離效果。通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為宜.

有機(jī)溶劑沉淀的影響因素第58頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3)pH值:選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi),通常是選在等電點(diǎn)附近,從而提高此沉淀法的分辨能力.

4)離子強(qiáng)度:通常鹽濃度以不超過5%為宜,使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的2倍體積為宜,

中性鹽的加入能增加蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度，并能防止蛋白質(zhì)變性，一般采用0.05mol/L以下的稀鹽溶液。沉淀所得的固體樣品,如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離,則應(yīng)盡可能抽干沉淀,減少其中有機(jī)溶劑的含量,如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑,以免影響樣品的生物活性.

第59頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3、等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性,通過調(diào)節(jié)溶液的值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而實(shí)現(xiàn)酶與雜質(zhì)分離的方法.可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離.

第60頁,共116頁，2024年2月25日，星期天由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近,而且?guī)в兴さ拿傅壬锎蠓肿尤杂幸欢ǖ娜芙舛?不能完全沉淀析出,因此,單獨(dú)使用此法分辨率較低,因而此法常與鹽析法,有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用,以提高沉淀能力和分離效果.

此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白,而不用于沉淀目的物.

第61頁,共116頁，2024年2月25日，星期天4、復(fù)合沉淀法常用的復(fù)合沉淀劑有：聚乙二醇、聚丙烯酸、單寧如聚丙烯酸（PAA）可以與某些堿性酶蛋白，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分離過程如下：

PAA+酶PAA-酶

PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2++酶

PAA-Ca2++SO4

2-CaSO4+PAA第62頁,共116頁，2024年2月25日，星期天5、選擇性變性沉淀法熱變性、有機(jī)溶劑變性和pH變性α-淀粉酶——熱變性紅細(xì)胞酶——乙醇-氯仿第63頁,共116頁，2024年2月25日，星期天三、根據(jù)分子大小建立的分離純化方法這類方法包括透析，超過濾，離心以及凝膠過濾等。1、透析(Dialysis)法：原理：透析是利用蛋白質(zhì)等大分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽單糖等分開。第64頁,共116頁，2024年2月25日，星期天Matricesusedforchromatography第65頁,共116頁，2024年2月25日，星期天Proteinpurificationbychromatography第66頁,共116頁，2024年2月25日，星期天透析袋的預(yù)處理：(1)將透析管剪成適當(dāng)長度(10-20cm)的小段，即形成透析袋。(2)在大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10min。(3)將透析袋用蒸餾水徹底漂洗。(4)將透析袋置1mmol/LEDTA(pH8.0)中煮沸10min。(5)待透析袋冷卻，存放于4℃，應(yīng)確保透析袋始終浸沒在液體中。

注：從此步起用透析袋時(shí)一定要戴手套操作。(6)在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。第67頁,共116頁，2024年2月25日，星期天透析（dialysis）透析袋蛋白質(zhì)溶液透析液磁棒磁力攪拌器常用的透析袋類型：

再生纖維素膜透析袋纖維素酯透析袋。有多種型號(hào)和規(guī)格，主要參數(shù)是分子量截留值（

1102Da）；商品名為spectrapor等。過程：將酶溶液裝入透析袋中，放入蒸餾水或稀緩沖液中，小分子物質(zhì)通過透析袋進(jìn)入水或緩沖液中，而蛋白質(zhì)被截留在透析袋中；第68頁,共116頁，2024年2月25日，星期天原理：利用壓力、抽濾或離心力強(qiáng)行使溶質(zhì)按大小形狀的差異分開，強(qiáng)行使水和其它小分子溶質(zhì)通過膜，而所需的酶分子被濾膜截留，以達(dá)到濃縮和脫鹽目的。2、超過濾(Ultrafiltration)法抽氣濾膜離心加壓酶溶液超濾膜支持柵板超濾液濾膜第69頁,共116頁，2024年2月25日，星期天超過濾（ultrafiltration）為了避免被膜截留的蛋白質(zhì)在膜表面上堆積，現(xiàn)常用截向流過濾的方法，即液體在泵驅(qū)動(dòng)下沿著與膜表面相切方向流動(dòng)，在膜上形成壓力，使部分液體透過膜，而另一部分液體切向地流過表面將被膜截留的蛋白質(zhì)分子沖走。制備超濾膜的材料：多是高分子聚合物（如聚砜類，聚四氟乙烯等；目前有圓形和卷式等多種超濾膜類型；主要參數(shù)：截留分子量、耐受壓力、濾速和有效過濾面積等；主要商品型號(hào)有AmiconDiaflo系列等。

超濾器類型：有管式，中空纖維式，螺旋卷繞式和平板式四種類型。第70頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（1）離心機(jī)的選擇3、離心分離第71頁,共116頁，2024年2月25日，星期天Cellfractionationbycentrifugation

第72頁,共116頁，2024年2月25日，星期天1）常速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速：8000r/min相對(duì)離心力（顆粒所受的離心力與地心引力之比)：＜1×104g主要用途：分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锛按纸Y(jié)晶等較大的顆粒。RCF=1.12×10-5×r×n2

r=旋轉(zhuǎn)半徑（厘米）n=每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)第73頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2）高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：1×104－2.5×104r/min相對(duì)離心力（RCF）：1×104－10×105g主要用途：分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片、較大的細(xì)胞器等高速冷凍離心機(jī)第74頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共116頁，2024年2月25日，星期天3）超速離心機(jī)轉(zhuǎn)速：2.5×104－12×104r/min相對(duì)離心力：5×105g主要用途：分離DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化。超速離心機(jī)的精密相當(dāng)高。為了防止樣品液流出，一般附有離心帽；為了防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)。此外還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及指示儀表等。第76頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第77頁,共116頁，2024年2月25日，星期天原理：采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在大離心力的條件下進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”，如此，多次離心處理，即能把液體中的不同沉降速度的顆粒分批分離出來。常用于分離大小和密度相差較大的顆粒。1）差速離心法（2）離心方法的選用第78頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2）密度梯度離心（densitygradientcentrifugal）原理：樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶分離方法。滴加樣品離心管蔗糖密度梯度蔗糖濃度每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。第79頁,共116頁，2024年2月25日，星期天velocitysedimentationvs.equilibriumsedimentation第80頁,共116頁，2024年2月25日，星期天梯度介質(zhì)選擇標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)具有足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍；不與樣品中的組分發(fā)生反應(yīng)；不會(huì)引起樣品中組分的凝集、變性或失活。常用介質(zhì)：蔗糖、甘油蔗糖：濃度5%~60%，密度1.02~1.30g/cm2第81頁,共116頁，2024年2月25日，星期天4、凝膠過濾法原理：又稱分子篩層析，在層析柱中填充凝膠介質(zhì)，加入待分離的酶溶液，然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗脫，樣品自上而下擴(kuò)展，大于凝膠孔徑的分子不能進(jìn)入膠粒內(nèi)部而從膠粒間空隙擴(kuò)展，下移速度較快，而小于凝膠孔徑的分子進(jìn)入膠粒內(nèi)部，下移速度較慢，經(jīng)過一定時(shí)間后不同大小分子按先大后小的順序從層析柱中流出。第82頁,共116頁，2024年2月25日，星期天返回第83頁,共116頁，2024年2月25日，星期天返回第84頁,共116頁，2024年2月25日，星期天第85頁,共116頁，2024年2月25日，星期天葡聚糖凝膠SephadexG:是有SephadexG-10~G-200共8種型號(hào)；G后面的數(shù)字是表示不同的交聯(lián)度，數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，吸水量越大，其數(shù)值越為吸水量的10倍；pH穩(wěn)定范圍為2-11；分子量分級(jí)范圍為~8105；親水性強(qiáng)。凝膠的類型與選擇：Sephadex葡聚糖凝膠第86頁,共116頁，2024年2月25日，星期天Sephacryl凝膠聚丙烯酰胺葡聚糖SephacrylS：

有SephacrylS-100HR~S-100HR共6個(gè)型號(hào)；機(jī)械性能，分辨率，分離速度，化學(xué)穩(wěn)定性均高于葡聚糖凝膠；可用0.5mol/LNaOH在位清洗；中性時(shí)可以高壓滅菌；對(duì)所有常用的緩沖液均穩(wěn)定；pH穩(wěn)定范圍3-11；有效分子量分離范圍1103~2107或>108。第87頁,共116頁，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠Bio-GelP：有Bio-GelP2~Bio-GelP300共10個(gè)型號(hào)；P后面的數(shù)字乘以1000表示其分離的最大分子量（排阻分子量）；過酸或過堿時(shí)不穩(wěn)定；在pH5.5-6.5時(shí)可以高壓滅菌；在大多數(shù)緩沖液中都可使用；pH穩(wěn)定范圍為2-10；分級(jí)范圍為1102~6104。

瓊脂糖凝膠:有Sepharose,Superose和Bio-GelA三種，每種又有各種不同的型號(hào)；凝膠的孔徑大小是通過瓊脂糖濃度來控制的；分級(jí)范圍很寬；但對(duì)溫度要求嚴(yán)格（2-30℃），40℃以上時(shí)易融化，低于0℃時(shí)易堵塞。第88頁,共116頁，2024年2月25日，星期天Sepharose瓊脂糖凝膠第89頁,共116頁，2024年2月25日，星期天四、按蛋白質(zhì)電荷性質(zhì)設(shè)計(jì)的分離方法（一）吸附法（吸附交換分離法）根據(jù)吸附機(jī)制的不同可分為3種：物理吸附法，羥基磷灰石法和離子交換吸附法。是利用樣品中不同分子與吸附劑之間的吸附和解吸性質(zhì)不同而達(dá)到分離的目的；操作方式有靜態(tài)吸附和柱層析兩種方式。操作過程包括：吸附劑的平衡與活化，加樣吸附，洗滌和洗脫。第90頁,共116頁，2024年2月25日，星期天常用的吸附劑有硅藻土，活性氧化鋁，淀粉和活性炭等。預(yù)先洗滌和活化后，在低鹽，弱酸或近中性條件下加樣吸附，再在弱堿條件下進(jìn)行洗脫。常采用靜態(tài)方式進(jìn)行。1、物理吸附法：第91頁,共116頁，2024年2月25日，星期天羥基磷灰石是一種微晶型磷酸鈣；一般認(rèn)為其表面的鈣離子和磷酸根離子與蛋白質(zhì)帶相反電荷的基團(tuán)發(fā)生相互作用；也是在低鹽和弱酸或中性條件下進(jìn)行吸附；洗脫時(shí)提高離子強(qiáng)度；多采用柱層析方式進(jìn)行。2、羥基磷灰石法第92頁,共116頁，2024年2月25日，星期天利用帶電荷的離子交換劑為載體，將帶相反電荷的蛋白質(zhì)吸附，然后在一定條件下洗脫下來。離子交換劑：一般由高分子支持介質(zhì)（母體）和功能基團(tuán)（離子交換基）兩部分組成。根據(jù)高分子支持介質(zhì)的性質(zhì)可以將離子交換劑分為3種類型：離子交換樹脂，離子交換纖維素和離子交換球型多糖(如葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠等)。3、離子交換吸附法（離子交換色譜法）第93頁,共116頁，2024年2月25日，星期天返回第94頁,共116頁，2024年2月25日，星期天離子交換樹脂是一種特殊網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物，其母體原料是一些不溶性的交聯(lián)聚苯乙烯等，活性基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)連在母體上。離子交換纖維素是目前酶分離純化中應(yīng)用最廣泛的一種離子交換劑；是在纖維素母體上引入功能基團(tuán)組成的。離子交換球型多糖以交聯(lián)葡聚糖或交聯(lián)瓊脂糖為母體，引入功能基團(tuán)而成的。第95頁,共116頁，2024年2月25日，星期天強(qiáng)酸型(硝酸基)陽離子交換劑弱酸型(羧基)陽離子交換劑強(qiáng)堿型(季胺鹽)陰離子交換劑弱堿型(伯胺基)陰離子交換劑等。根據(jù)離子交換基所帶電荷性質(zhì)和解離狀況可以分為：第96頁,共116頁，2024年2月25日，星期天離子交換劑類型的選擇：應(yīng)考慮以下幾個(gè)因素：參考電泳結(jié)果：在中性或偏堿性條件下進(jìn)行電泳，向陽極移動(dòng)較快的酶，可選用陰離子交換劑；向陰極移動(dòng)較快的酶可被陽離子交換劑吸附。待分離酶的穩(wěn)定性：待分離酶如果在低于pI的條件下穩(wěn)定，則選用陽離子交換劑；待分離酶如果在高于pI的條件下穩(wěn)定，則選用陰離子交換劑。待分離酶的pI：pI<6時(shí)選用強(qiáng)堿型陰離子交換劑；pI>9時(shí)選用強(qiáng)酸型陽離子交換劑；pI在6-9之間選用強(qiáng)型弱型均可。（3）離子交換層析的操作過程：包括離子交換劑的預(yù)處理及平衡，裝柱，加樣吸附，洗脫，洗脫液收集及檢測，離子交換劑的再生。第97頁,共116頁，2024年2月25日，星期天（二）電泳法在直流電場中，由于各種蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同，移動(dòng)速度不同，形成各自的區(qū)帶，用顯色劑如CoomassieBlue染色后，可以在支持物上看到蛋白質(zhì)的顏色譜帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)。第98頁,共116頁，2024年2月25日，星期天膜電泳：以濾紙、聚酰胺薄膜，醋酸纖維薄膜等為支持物的一類電泳分離方法。粉末電泳：以淀粉、纖維素粉或硅膠粉等為支持物的分離方法。凝膠電泳：以聚丙烯酰胺為支持物，兼有分子篩效應(yīng)。1、區(qū)帶電泳：按支持物的物理性狀可分為3種類型：是在惰性支持物上進(jìn)行電泳時(shí)樣品中各組分遷移速度不同而分布成區(qū)帶的一類電泳分離方法。第99頁,共116頁，2024年2月25日，星期天2、等電點(diǎn)聚焦電泳利用兩性電解質(zhì)在直流電場中形成一個(gè)連續(xù)的pH梯度，樣品中各種蛋白質(zhì)在各自的等電點(diǎn)在相應(yīng)的pH區(qū)段聚集而達(dá)到分離的目的。3、高效毛細(xì)管電泳4、聚焦層析第100頁,共116頁，2024年2月25日，星期天聚焦層析聚焦效應(yīng)

Pr按pI在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程為聚焦效應(yīng)。

①Pr首先遷移至其pI位置。

②Pr