感染性疾病的分子診斷

感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。2通過閱讀報刊，我們能增長見識，擴大自己的知識面。感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷感染性疾病的分子診斷1感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀的疾病。病原體：病毒、細菌、原蟲、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲。

2感染性疾?。河赡撤N病原體所致，通過不同方式引起人體發(fā)生感染并常規(guī)檢測方法：免疫學方法微生物學方法受敏感性、特異性限制，不易早期診斷，并且不易提供病原體分型與耐藥性方面的信息。3常規(guī)檢測方法：3感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：＋雜交完整性策略：檢出病原體分型（分類）－亞型－耐藥性常用方法：雜交、、基因芯片、測序4感染性疾病的分子診斷策略一般性策略（檢出病原體）：4感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（）基因表達產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細胞免疫體液免疫TT致敏T細胞淋巴因子B漿細胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)5感染性疾病分子診斷標志物病原體核酸分子（）細體TT致敏T細胞二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據(jù)目的基因是否被放大，可分為雜交法和擴增法。信號放大技術(shù)檢測方法靶分子數(shù)目不變，而檢測的探針信號放大采用多酶、多探針或二者結(jié)合等方法來增加探針標志物的濃度使檢測信號得到放大。靶分子擴增技術(shù)檢測方法靶分子（、或探針）的擴增、替代擴增、等6二、感染性疾病分子診斷的常用方法根據(jù)目的基因是否被放大引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子

5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖原理示意圖引物’端帶有聚合酶結(jié)合位點，’端堿基與靶’端序列互補;引物的堿基序列與’端序列互補7引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'()8()8的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高,其擴增效率高于，特異性好。9的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由引物A

靶RNA

引物B

RNAcDNA

RT

3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNA

cDNA模板

5'5'3'3'5'3'引物B

RNAseH

RT

T7RNA聚合酶

100-1000RNA擴增子

5'3'5'3'3'5'3'5'引物A

3'5'5'RNAseH

RNA

RNA

cDNA

cDNA

圖原理示意圖引物’端帶有聚合酶結(jié)合位點，’端堿基與靶’端序列互補;引物的堿基序列與’端序列互補10引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'()11()11的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由三種酶控制，循環(huán)次數(shù)少，忠實性高,其擴增效率高于，特異性好。12的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環(huán)。整個反應(yīng)過程由三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適的標本種類、標本量、抗凝劑等與對標本進行合適的傳送、保存和預(yù)處理。13三、感染性疾病分子診斷的標本處理標本采集處理主要包括選擇合適四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋.陰性結(jié)果假陰性可能性方法的靈敏度太低方法失敗目標分子.陽性結(jié)果假陽性可能性方法的特異性受到污染14四、感染性疾病分子診斷的結(jié)果解釋.陰性結(jié)果假陰性可能性1.定性檢測結(jié)果有時不能提供病原體活力相關(guān)信息臨床治療病情緩解后一定時間內(nèi)，在患者樣本中仍可以檢測出相應(yīng)的病原體。有些病原體潛伏在進體內(nèi)，沒有臨床癥狀。.疾病狀況的判斷檢測出病原體的存在并不能說此病原體就是引起疾病的直接原因。該病原體可能是一種正常菌群

15.定性檢測結(jié)果有時不能提供病原體活力相關(guān)信息15五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用與評價用于感染性疾病治療的監(jiān)控和預(yù)測、病情發(fā)展過程的危險性評價與疾病預(yù)后等。耐藥性的檢測細菌的分型流行病調(diào)查16五、感染性疾病分子診斷的臨床應(yīng)用與評價用于感染性疾病治療的監(jiān)第一節(jié)病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、腦炎、流行性感冒等等，占人類傳染疾病的左右。多種不同病毒。病毒結(jié)構(gòu)：大?。汉诵膮^(qū)：核酸（或）外周衣殼：蛋白質(zhì)包膜：脂質(zhì)（鑲嵌有蛋白質(zhì)）17第一節(jié)病毒的基因檢測人類許多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝我國是高流行區(qū)，－的人受過感染，－是攜帶者，肝炎患者中是慢性肝炎患者，導(dǎo)致肝硬變，又與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)。外殼（):外殼蛋白成分為表面抗原核心（)：聚合酶

一、乙型肝炎病毒18我國是高流行區(qū)，－的人受過感染，－是攜帶者，肝炎患者顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣殼蛋白）完整的乙肝病毒顆粒直徑納米由雙層外殼和一個核心組成的，核心直徑為納米，內(nèi)含雙鏈和多聚酶19顆粒（完整的病毒）形態(tài)HBsAgHBcAgHBVDNADN（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)雙鏈病毒不完全雙連環(huán)狀長鏈為負鏈：有個開放閱讀框、、、區(qū)編碼外膜蛋白（）區(qū)編碼、區(qū)編碼聚合酶區(qū)位編碼蛋白，可能與病毒蛋白表達有關(guān)。短鏈為正鏈：長短不一20（一）病毒基因組結(jié)構(gòu)雙鏈病毒20

蛋白蛋白

基因組結(jié)構(gòu)21蛋白基因組基因分型基因序列差異的多少，可將劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)、、、、、、、共種基因型：型主要存在于白人，型和型主要存在于亞洲人群型主要存在于西非型僅見于中南美洲的土著人型和型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前區(qū)的不同。我國流行的主要是和基因型，長江以北以型為主，長江以南以型為主，另又少量的型、型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的型22基因分型基因序列差異的多少，可將劃分為不同的基因型，至今為在肝細胞內(nèi)的復(fù)制()包膜負鏈包裹后的前基因傳染性病毒顆粒傳染性病毒顆粒部分雙鏈逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶肝細胞23在肝細胞內(nèi)的復(fù)制()負鏈包裹后的前基因傳染性傳染性部分雙鏈（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期，不易早期診斷。

采用普通、、競爭性、免疫雜交，可提供直接、準確的病原學診斷證據(jù)。引物是根據(jù)、、、基因中高度保守序列設(shè)計，決定擴增的特異性和敏感度。24（二）分子診斷常用的免疫學檢測方法，即二對半的檢測存在窗口期擴增位置引物序列擴增片斷（)

、基因’’

’’

基因’’

’’

基因’’

’’

25擴增位置引物序列擴增片斷（)有時為了證實擴增產(chǎn)物的特異性，對擴增產(chǎn)物進行以下分析：

斑點雜交雜交

26有時為了證實擴增產(chǎn)物的特異性，對擴增產(chǎn)物進行以下分析：.支鏈信號放大技術(shù)(）原理:①捕獲探針檢測②靶探針體系③靶探針④分子主鏈上結(jié)合多個側(cè)鏈27.支鏈信號放大技術(shù)(）原理:27捕獲探針固化在微孔板上靶探針分別與捕獲探針與待測核酸雜交靶探針分別與待測核酸及雜交形成復(fù)合物：固相支持物捕獲探針靶探針待測核酸靶探針復(fù)合物28捕獲探針固化在微孔板上固相支持物捕獲探針靶探針待測核酸靶探分支鏈信號放大技術(shù)()29分支鏈信號放大技術(shù)()29信號檢測：可結(jié)合很多酶標探針，酶催化底物（二惡二酮，）發(fā)光，使核酸信號放大，且發(fā)光強度與量成正比。優(yōu)點：放大倍數(shù)確定陽性檢出率高穩(wěn)定性和可重復(fù)性好操作簡便，省時，易于普與30信號檢測：可結(jié)合很多酶標探針，酶催化底物（二惡二酮，）發(fā)光，.基因芯片技術(shù)標本經(jīng)擴增后與芯片上的特異探針進行雜交，可以檢測：是否有病毒感染感染病毒的種類與亞型病毒的耐藥情況特點：可同時進行大量標本的檢測31.基因芯片技術(shù)31近年來陸續(xù)上市的核苷(酸)類似物對的治療壓力集中在區(qū)。干擾素治療對的壓力主要集中在前區(qū)與前區(qū)。耐藥突變32近年來陸續(xù)上市的核苷(酸)類似物對的治療壓力集中在區(qū)。干擾素

(酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)對拉米夫定耐藥是聚合酶突變所致。耐藥基因位點()位于聚合酶的區(qū)(或)，分別是中的蛋氨酸()被異亮氨酸()或纈氨酸()所替代，形成或變異.拉米夫定作用靶位為聚合酶區(qū)。有研究表明，拉米夫定與逆轉(zhuǎn)錄酶的親和力與位于第位氨基酸側(cè)鏈長度有關(guān)，異亮氨酸和纈氨酸取代蛋氨酸，使側(cè)鏈氨基酸長度縮短，使逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合區(qū)增大，不適于拉米夫定結(jié)合，從而誘發(fā)耐藥性。33

(酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)對拉米夫定耐藥是聚合耐藥檢測（突變檢測方法）34耐藥檢測（突變檢測方法）34突變檢測方法.基因測序法.熒光定量方法基本原理確定探針特定的值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交

℃℃℃35突變檢測方法.基因測序法（三）臨床意義.早期診斷免疫學檢測敏感性：μ

核酸雜交檢測敏感性：檢測：因此，在感染早期即可通過檢測證實病毒的存在。36（三）臨床意義.早期診斷36.監(jiān)測治療效果:>拷貝提示病毒復(fù)制活躍；＜拷貝治療有一定療效；＜拷貝、陰轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)氨酶正常為乙型肝炎臨床治愈指標；.判斷病情，指導(dǎo)制定合理的治療方案37.監(jiān)測治療效果:37.病毒耐藥性的檢測乙肝病毒聚合酶處的突變是病毒產(chǎn)生耐藥性的重要原因，通過監(jiān)測的突變情況，可以獲得病毒耐藥性方面的信息，指導(dǎo)抗病毒治療。3838二、流行性感冒病毒流行性感冒病毒()，是引起流行性感冒的病原體;分為甲()、乙()和丙()個型別;根據(jù)病毒顆粒表面血凝素(，)和神經(jīng)氨酸酶(，)的抗原性，甲型流感病毒又可分為不同的亞型。甲型流感病毒易發(fā)生變異，致病力強，年發(fā)生在西方國家的大流感殺死了幾千萬人，即是由甲型流感病毒引起。

()().39二、流行性感冒病毒

()394040（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)單鏈病毒，為負鏈；有個片段或個片段；所有片段’末端和’末端高度保守；兩種不同亞型病毒感染宿主時，會生成基因重配的新病毒；基因在復(fù)制過程中常會發(fā)生點突變。

41（一）流感病毒基因組結(jié)構(gòu)41（二）分子診斷方法可采用、檢測流感病毒。引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因（）的序列進行設(shè)計。為證實擴增產(chǎn)物的特異性或提高檢測的靈敏度，可用限制性內(nèi)切酶分析法、斑點雜交法、印跡法進行擴增產(chǎn)物的分析。42（二）分子診斷方法42擴增位置引物序列擴增片段大小基因’’()’’基因’’()’’43擴增位置引物序列（三）臨床意義流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學血凝抑制試驗，這些方法比較費時，靈敏度低，難以作出早期診斷。法敏感、特異、簡便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病學調(diào)查。44（三）臨床意義44三.人類免疫缺陷病毒（)，，為艾滋病的病原體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起艾滋病的病毒有、、三種。年底艾滋病感染者和艾滋病患者總數(shù)為萬，已死亡萬，是全球十大主要死因之一。45三.人類免疫缺陷病毒（)，45最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的；其內(nèi)為核衣殼。46最外層為囊膜，雙層脂蛋白，是病毒識別攻擊宿主細胞所必不可少的4747.基因組結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄病毒，兩個拷貝的單股正鏈；每個長約，有’帽，’端有多聚尾；是一種高度變異的病毒；含有、和三個基因以與種調(diào)控基因,,,,,。

48.基因組結(jié)構(gòu)48①基因編碼病毒的核心蛋白；②基因編碼病毒復(fù)制所需要的酶類（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶）；③基因所編碼病毒包膜蛋白，是免疫學診斷的主要檢測抗原。④調(diào)控基因編碼輔助蛋白，調(diào)節(jié)病毒蛋白合成和復(fù)制。49①基因編碼病毒的核心蛋白；49（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯(lián)免疫吸附法（）和免疫熒光檢測法（）；感染周后才能逐漸產(chǎn)生病毒抗體；抗原的檢測：酶聯(lián)免疫吸附法（）檢測抗原，靈敏度低50（二）分子診斷方法抗體的檢測：酶聯(lián)免疫吸附法（）和免疫熒光檢.病毒載量檢測感染者體內(nèi)的定量檢測，對病情判斷和治療效果檢測極有價值。目前常用三種技術(shù)：最低檢測限拷貝最低價測限拷貝最低檢測限拷貝51.病毒載量檢測51

逆轉(zhuǎn)錄整合到宿主基因組中復(fù)制，以被感染細胞為模板擴增；為高變異病毒，不同患者體內(nèi)分離的病毒基因結(jié)構(gòu)有差異，引物設(shè)計應(yīng)根據(jù)各編碼區(qū)的保守序列設(shè)計；靈敏度高，特別是用于無癥狀感染者。5252擴增位置引物序列擴增片斷（)

基因’’

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基因’’

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基因‘’

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53擴增位置引物序列擴增片.病毒表型和耐藥檢測表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢測最常用的耐藥檢測方法是基因型檢測方法,即查找與病毒耐藥有關(guān)的基因突變。檢測病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（）和蛋白酶（）基因的序列，然后把這些結(jié)果與已知的沒有發(fā)生突變的（稱為野生株）基因序列進行比較，與之不同的基因序列就認為發(fā)生了突變。檢測出的任何突變都有可能導(dǎo)致形成耐藥性，但具體結(jié)果的解釋必須要有非常有經(jīng)驗的專家和醫(yī)師來進行。54.病毒表型和耐藥檢測表型主要依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶基因突變的檢（三）臨床意義.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；：可對無癥狀的感染者進行早期診斷；.病毒載量檢測：在臨床進展情況的判定與療效觀察上極有價值。55（三）臨床意義.原位雜交：可以顯示病毒感染的部位；55第九章：細菌感染的分子生物學檢驗概述正常菌群：存在于人體表與與外界相通部位的細菌；條件致病菌：正常菌群與人體平衡破壞，引起疾病的一類細菌；病原菌：具有毒性和侵襲力的細菌，造成人體感染；56第九章：細菌感染的分子生物學檢驗概述56病原菌的診斷方法：①直接涂片法②生化試驗③血清學試驗④分離培養(yǎng)⑤動物實驗⑥分子生物學：靈敏、特異，可進行早期診斷、分型、耐藥性檢測；不能確診或進行分型、耐藥性的檢測，或費時等57病原菌的診斷方法：不能確診或進行分型、耐藥性的檢測，或費時全世界人口感染，每年約萬死于結(jié)核，中國占，免疫低下個體特別是感染者更易于感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌為革蘭氏陽性菌，細長略帶彎曲，分枝狀，有莢膜，抗酸染色陽性，對多種抗生素有抵抗力。一.結(jié)核分枝桿菌58全世界人口感染，每年約萬死于結(jié)核，中國占，免疫低下形態(tài)

59形態(tài)59(一)基因組結(jié)構(gòu)株基因組是環(huán)狀雙鏈，共有;.共有基因，功能已知的有個,個可能為新基因;.基因組中有許多藥物抗性因子的編碼序列，包括水解酶或者藥物修飾酶。60(一)基因組結(jié)構(gòu)6061616262（二）分子診斷方法普通、、競爭性、免疫雜交擴增靶序列：抗原基因（細菌細胞壁上蛋白）蛋白基因（結(jié)核桿菌復(fù)合群特有）基因（種屬鑒定）插入序列63（二）分子診斷方法63靶序列引物序列擴增片斷（）

插入‘’

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重復(fù)序列’’

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64靶序列引物序列擴增片斷（）64耐藥檢測利福平耐藥聚合酶基因異煙肼耐藥基因鏈霉素耐藥的基因的基因喹諾酮的耐藥解旋酶的和基因水解酶或藥物修飾酶（β內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶和藥物外排系統(tǒng)等）65耐藥檢測利福平耐藥聚合酶基因65細菌耐藥基因的檢測細菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)、增加昂貴抗生素的使用。機理：由于細菌基因組的變異，導(dǎo)致.細菌細胞外膜通透性改變；.產(chǎn)生滅活酶和鈍化酶，如內(nèi)酰胺酶；.藥物作用靶位改變；.代謝途徑改變；66細菌耐藥基因的檢測細菌耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致治療失敗、感染復(fù)發(fā)（三）臨床意義.準確、快速、早期診斷.區(qū)分與其它分枝桿菌.疫情監(jiān)控和抗癆治療療效的評價67（三）臨床意義.準確、快速、早期診斷67二、淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我國性傳播疾病種中，發(fā)病率居首位。淋球菌耐藥菌株的出現(xiàn)和流行對淋病的控制帶來很大困難。傳播途徑：.直接性接觸感染.間接接觸感染68二、淋球菌淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌6969（一）基因組結(jié)構(gòu).染色體分子量，可編碼約個基因，含量為；.無操縱子結(jié)構(gòu).含有至數(shù)個質(zhì)粒（，），通過質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥性在不同菌株間的轉(zhuǎn)移；

70（一）基因組結(jié)構(gòu)707171（二）分子診斷:擴增的靶序列：編碼外膜蛋白Ⅲ的結(jié)構(gòu)基因，或基因、基因（同時存在于染色體與質(zhì)粒上）72（二）分子診斷:72靶序列引物序列擴增片斷（）

基因’’

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外膜蛋白Ⅲ’’

’’

’’

73靶序列引物序列擴增片斷（）7（）連接酶鏈反應(yīng)(，)，是一種新的體外擴增和檢測技術(shù)，主要用于點突變的研究與靶基因的擴增.74（）74原理：在反應(yīng)體系中加入二對引物，加熱(～℃)使變性，雙鏈打開，然后降溫退火(℃)，引物與模板結(jié)合并留下一缺口，如果引物與模板完全互補，連接酶即連接封閉缺口，反應(yīng)接著進行，擴增出大量的目標.若有點突變，引物不能與模板精確結(jié)合，缺口附近核苷酸的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，連接酶不能封閉缺口，反應(yīng)不能進行，無擴增產(chǎn)物生成，據(jù)此可判斷模板中有無突變.75原理：在反應(yīng)體系中加入二對引物，加熱(～℃)使變性，雙鏈打7676（三）臨床意義.分子診斷技術(shù)具有靈敏性高、快速、特異性好的優(yōu)點，可檢測極微量的淋球菌。.應(yīng)用于以下幾方面：對菌株進行分型和耐藥性分析?？股刂委熜Ч挠^察。進行流行病學分析。對疑似病例的診斷和鑒別診斷。77（三）臨床意義77衣原體的基因檢測衣原體是介于立克次氏體與病毒之間，能通過細菌濾器，專性活細胞內(nèi)寄生的一類原核生物。沙眼衣原體是一種在人體內(nèi)長期生存并又廣泛傳播的病原體，常導(dǎo)致人泌尿生殖道疾病與眼病，有種血清型。78衣原體的