細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的特性

培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)，如各種實(shí)體瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面，如各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適溫和豐富的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門(mén)技術(shù)。第2頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本概念原代培養(yǎng)

動(dòng)物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長(zhǎng)，在傳代之前稱(chēng)為原代培養(yǎng)。傳代細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后，被分開(kāi)接種到新的培養(yǎng)器皿中。細(xì)胞系

cellline原代培養(yǎng)物成功傳代后，則稱(chēng)之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱(chēng)之為有限細(xì)胞系（finitecellline）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（infinitecellline）。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。細(xì)胞株

cellstrain從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱(chēng)細(xì)胞株。通常將具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的細(xì)胞群稱(chēng)為細(xì)胞株。第3頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)或細(xì)胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細(xì)胞庫(kù)（HGMR）、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(kù)（CAR）等ATCC不僅是美國(guó)，也是世界最大的細(xì)胞庫(kù)，是世界衛(wèi)生組織WHO的國(guó)際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個(gè)已經(jīng)過(guò)鑒定的細(xì)胞系，接納來(lái)自世界各國(guó)已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存，同時(shí)也向世界各國(guó)的研究者或?qū)嶒?yàn)室免費(fèi)提供研究用細(xì)胞（做盈利性研究時(shí)收費(fèi)）武漢大學(xué)細(xì)胞典藏物中心細(xì)胞典藏物中心第4頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期（平臺(tái)期）第5頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱(chēng)懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)第6頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長(zhǎng)基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)（化學(xué)合成的功能基團(tuán)）第7頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。第9頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。第10頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天停止期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制：接觸抑制、密度依賴(lài)性第11頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)方式

群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，匯合后形成均勻的單細(xì)胞層克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱(chēng)為克隆（clone）。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

第12頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）

第13頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件無(wú)污染環(huán)境:生物安全柜，超凈工作臺(tái)基質(zhì):玻璃，塑料…營(yíng)養(yǎng)需要:氨基酸，碳水化合物，無(wú)機(jī)鹽，緩沖系統(tǒng)，維生素…(商業(yè)化合成培養(yǎng)基)

pH:7.2-7.4溫度:37℃，細(xì)胞培養(yǎng)箱氣體環(huán)境

O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-第14頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品：超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈，甲醛熏蒸器CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀、微孔板震蕩器液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動(dòng)移液器，培養(yǎng)板，凍存管。。。第15頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90℃，14h或者紫外殺菌)。③箱內(nèi)置4-6L蒸餾水，加入100ml飽和硫酸銅溶液，以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)，并抑制真菌污染。第16頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)物品準(zhǔn)備

常用玻璃器皿清洗浸泡（自來(lái)水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小時(shí)）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干第17頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天清潔液的配制第18頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml第19頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天消化液胰蛋白酶作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用第20頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。第21頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說(shuō)來(lái)，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死，但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10％血清。第22頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌第23頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗生素的使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定第24頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天完全培養(yǎng)基的組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升第25頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)基本方法（無(wú)菌原則）無(wú)菌工作臺(tái)用75%酒精擦拭干凈，紫外線(xiàn)照射40分鐘以上。清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用75%酒精擦拭。操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。整個(gè)操作過(guò)程盡量在無(wú)菌臺(tái)靠里面一點(diǎn)。手及物品不要在暴露的瓶口上方來(lái)往，嚴(yán)格注意無(wú)菌操作。第26頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種。懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第27頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液適量PBS洗凈殘留培養(yǎng)液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液吸取1/3細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)第28頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費(fèi)，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。第29頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。第30頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí)，1～2℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，5～10℃/min

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線(xiàn)繩，通過(guò)線(xiàn)繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第31頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天低溫保護(hù)劑的應(yīng)用在細(xì)胞凍存時(shí)加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在細(xì)胞外形成冰晶，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。第32頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞凍存方法預(yù)先配制凍存液：含20%血清培養(yǎng)基

10%DMSO取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量?jī)龃嬉?，用吸管吹打制成?xì)胞懸液（1×106～5×106細(xì)胞/ml)加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期第33頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞復(fù)蘇方法從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。低速離心10分鐘。去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。第34頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞計(jì)數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)儀Counter第35頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber

中細(xì)刻9

個(gè)1

mm2大正方形，其中4

個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16

個(gè)小格，深度均為0.1

mm。當(dāng)chamber

上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1

mm2

x

0.1

mm=1.0

x

10-4

ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml

中之細(xì)胞數(shù)目。

第36頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定臺(tái)盼藍(lán)法，trypan

blue，

利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞活力MTT法第37頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)染(Transfection)將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能常特指將質(zhì)粒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。

第38頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的區(qū)別轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。第39頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。一般來(lái)說(shuō)，在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)內(nèi)檢測(cè)和分析結(jié)果。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，也稱(chēng)永久轉(zhuǎn)染，外源DNA整合到宿主染色體中。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)選擇性標(biāo)記篩選，如抗生素篩選APH（新霉素抗性基因），HPH（潮霉素），TK（胸苷激酶）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。第40頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響轉(zhuǎn)染效率的因素細(xì)胞培養(yǎng)物健康的細(xì)胞低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔円欢ǖ募?xì)胞密度推薦在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)內(nèi)分細(xì)胞，這將提供正常細(xì)胞代謝，增加對(duì)外源DNA攝入的可能第41頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天血清血清是一種包含生長(zhǎng)因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對(duì)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。第42頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA質(zhì)量一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。核酸純化世界第一品牌德國(guó)QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達(dá)到兩倍2xCsCl梯度離心以上的純度效果，使DNA質(zhì)量得到保證。對(duì)一些內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞（如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和造血細(xì)胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)粒抽提過(guò)程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。第43頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天6孔板轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)染前18至24小時(shí)內(nèi)接種2×105細(xì)胞至每孔內(nèi)（細(xì)胞濃度1×105/ml，每孔接種2ml，全培養(yǎng)基培養(yǎng)，無(wú)抗生素），轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換培養(yǎng)基對(duì)每孔細(xì)胞，稀釋2ugDNA于250ulOptiMEM對(duì)每孔細(xì)胞，稀釋4ulLipofectamine2000于250ulOptiMEM，室溫孵育5min將步驟2和步驟3中的DNA懸液和Lipofectamine2000懸液均勻混勻，室溫孵育20min以使DNA-Lipofectamine2000復(fù)合物形成將DNA-Lipofectamine2000complexes(500ul)直接輕柔的滴加到每孔細(xì)胞中，輕柔搖勻第44頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天免疫熒光染色I(xiàn)F免疫熒光組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)，是采用熒光素標(biāo)記的已知抗體

（或抗原）作為探針，檢測(cè)待測(cè)組織、細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復(fù)合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)。

第45頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天直接法：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。間接法：特異性的一抗和熒光素標(biāo)記的二抗第46頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天F-actin直接染色中文名稱(chēng)：鬼筆環(huán)肽英文名稱(chēng)：phalloidin定義：由鬼筆鵝膏真菌（Amanitaphalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽?？膳cF肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使F肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定F肌動(dòng)蛋白的重要試劑。

第47頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天GFPTRITC-phalloidinDAPI07.23.1058,60,6162,64,6580,81,82第48頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天間接免疫熒光染色制片細(xì)胞接種固定破膜封閉染色封片和熒光顯微鏡觀察第49頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天制片Chamberslide：腔室玻璃系統(tǒng)Coverslip：蓋玻片（酒精，紫外照射滅菌）玻片包被：膠原，纖維蛋白fibronectin，整合素intergrin，vitronectin…

*有些基質(zhì)蛋白是與細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路相關(guān)的Chamberslide第50頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞接種根據(jù)不同的研究?jī)?nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇不同細(xì)胞密度進(jìn)行接種和生長(zhǎng)時(shí)間染色前用溫?zé)岬腜BS洗去培養(yǎng)基（含Ca2+、Mg2+

或者不含Ca2+、Mg2+的PBS的選擇）第51頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞，如4%多聚甲醛固定15分鐘多聚甲醛宜現(xiàn)用現(xiàn)配，或配好后分裝-20℃凍存，用之前37℃復(fù)溫固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月PBS洗滌3×5min第52頁(yè),共61頁(yè)，2024年2月25日，星期天破膜或通透在檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原表位的時(shí)候需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，因?yàn)榭贵w需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部去檢測(cè)蛋白如果待檢測(cè)的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透如果所檢測(cè)的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進(jìn)行通透。常用的通透劑是去垢劑，如Triton，NP-40，以及Tween20，Saponin，Digitonin和Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細(xì)胞核膜，因此非常適合核抗原檢測(cè)。但應(yīng)該注意的