藥物制劑的微生物學檢查

關(guān)于藥物制劑的微生物學檢查微生物與藥學的關(guān)系密切1、許多抗生素是微生物的代謝產(chǎn)物,2、選用微生物來制造醫(yī)藥衛(wèi)生方面廣泛應用的藥物,如維生素,輔酶；3、藥品衛(wèi)生質(zhì)量的控制需要進行微生物學檢驗；4、藥品和生物制劑應用生物工程技術(shù)生產(chǎn)時，采用工程菌進行，如：胰島素、干擾素和生長因子等。第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3基本概念滅菌(sterilization)：應用物理或化學等方法將物體上或介質(zhì)中所有微生物繁殖體及其芽孢全部殺滅或除去的手段。無菌(sterility)：在任一指定的物體、介質(zhì)或環(huán)境中無任何活的微生物。無菌操作(aseptictechnique)：在整個操作中利用或控制一定的條件，使產(chǎn)品避免被微生物污染的一項操作方法和技術(shù)。第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天4空氣凈化技術(shù)是以創(chuàng)造潔凈的空氣為主要目的的空氣調(diào)節(jié)措施?？諝鈨艋止I(yè)凈化(塵埃粒子)和生物凈化(塵埃粒子和微生物)。藥物制劑行業(yè)中的空氣凈化需要生物凈化，即在除掉空氣中的各種塵埃的同時除掉各種微生物等?？諝鈨艋夹g(shù)是以創(chuàng)造潔凈的空氣為主要目的的空氣調(diào)節(jié)措施?？諝鈨艋止I(yè)凈化(塵埃粒子)和生物凈化(塵埃粒子和微生物)。藥物制劑行業(yè)中的空氣凈化需要生物凈化，即在除掉空氣中的各種塵埃的同時除掉各種微生物等。潔凈級別塵粒數(shù)(粒/升)粒徑

0.5

m塵粒數(shù)(粒/英尺3)粒徑

0.5

m溫度(℃)相鄰級別室間壓差濕度(%)菌落數(shù)100

3.5

10018-26正壓40-60<110000

350

10000<3100000

3500

100000<10＞100000

35000

1000000/第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1.掌握藥物的體外試菌試驗方法（瓊脂擴散法和系列稀釋法），了解藥物的體內(nèi)抗菌實驗。2.掌握一般滅菌制劑的無菌檢查方法和原理，熟悉特殊藥品的無菌檢查法。3.掌握非滅菌藥物的微生物總數(shù)測定方法，熟悉藥品的大腸桿菌檢查方法。4.了解一般藥品的沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和破傷風桿菌的檢查方法。第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)藥物的抗菌試驗第二節(jié)滅菌制劑的無菌檢查第三節(jié)藥物的微生物限度檢查第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天藥物的體外抗菌試驗包括用于區(qū)別藥物是抑菌或殺菌藥物的抑菌試驗；測定藥物殺菌活性的殺菌試驗；以及檢查兩種藥物聯(lián)合作用的聯(lián)合抗菌試驗等。一般抑菌藥物只能抑制微生物生長，不能殺死微生物，抑菌藥物被除去，微生物又可以恢復繼續(xù)生長。殺菌藥物能殺死微生物，殺菌藥物除去后，微生物仍然不能生長。第一節(jié)藥物的抗菌試驗第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天藥物的抑菌作用或殺菌作用是在一定條件下相對而言的。在我們檢測時，藥物的作用受到用藥時培養(yǎng)基的組成、溫度、PH值及所用的菌種、菌量等各個因素有關(guān)。一般我們在體外對藥物進行測試后，有效的藥再要進行體內(nèi)試驗，如果體內(nèi)試驗再次證實此藥有效的話，才能推薦應用到臨床。第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一、藥物的體外抑菌試驗（一）體外抑菌試驗藥物的體外抑菌試驗是常用抗菌試驗方法，其中最常用的方法用連續(xù)稀釋法和瓊脂擴散法。

1、連續(xù)稀釋法包括液體培養(yǎng)基稀釋法和固體培養(yǎng)基稀釋法兩種。均可以用來測定藥物的最小抑菌濃度(MIC)。

MIC:是指該藥物能抑制細菌生長的最低濃度，通常用μg/ml或U/ml表示。第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（1）液體培養(yǎng)基稀釋法在試管中用液體培養(yǎng)基進行2倍系列稀釋藥物，后在每一管中加入定量的試驗菌液，經(jīng)24~48h培養(yǎng)后觀察結(jié)果。以能抑制試驗菌生長的最低濃度為藥物的MIC。（2）固體培養(yǎng)基稀釋法平板法：測定多種細菌對同一藥物的MIC

斜面法：較長時間培養(yǎng)的試驗菌和霉菌。第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

2、瓊脂擴散法利用藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，并在一定濃度范圍內(nèi)抑制細菌生長的原理進行的。一般用于細菌和酵母菌的藥敏試驗。（1）濾紙片法（紙碟法）濾紙片法是最常用的方法，可在1個平板上測定多種藥物對同一試驗菌的抗菌作用；適用于新藥的初篩試驗（初步藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試驗（細菌藥物第三性試驗、以便選擇用藥）。第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天濾紙片分濕、干兩種，可以在試驗時用無菌紙片沾取藥物溶液放在含菌的平板表面，也以預先做成一定濃度的干燥紙片。一般來說預先做成的干燥紙片實用一些而且準確一些。一般藥敏試驗常采用濾紙片法，我們可以根據(jù)抑菌環(huán)的直徑的大小，來判斷菌種對藥物的敏感性，是敏感(S)，中介(I)還是耐藥(R)？國際標準采用K-B法：水解酪蛋白培養(yǎng)基和卡尺第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天世界衛(wèi)生組織規(guī)定了抗菌藥物的敏感性評定標準，在標準實驗條件下根據(jù)抑菌圈大小來判斷，比如：抗生素抑菌圈直徑（mm）耐藥中敏敏感氯霉素≤1213-17≥18紅霉素≤1314-17≥18四環(huán)素≤1415-18≥19卡那霉素≤1314-17≥18第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（2）挖溝法適用于測試一種藥物對幾種細菌的抗菌作用。方法是先制備普通瓊脂平板，并在平板上挖直溝，在溝內(nèi)滴加藥液，在溝側(cè)接種細菌。經(jīng)過培養(yǎng)以后觀察家細菌生長的情況。我們可以根據(jù)溝和細菌間的抑菌距離的長短，來判斷該藥物對這些細菌的抗菌能力。第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天(二)體外殺菌試驗殺菌試驗是用來評價藥物對微生物的致死活性的。1、最低殺菌濃度(MBC)(最小致死濃度MLC)

按液體培養(yǎng)基稀釋法的操作方法測了藥物的MIC。然后把未長出菌的各個試管培養(yǎng)液分別移種到無菌平板上，培養(yǎng)后凡是平板上無菌生長的藥物最低濃度就是MLC。如果是細菌的話可以稱為MBC。第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、

活菌計數(shù)法活菌計數(shù)一般是將定量的藥物與試驗菌作用后混合液稀釋后，混入瓊脂培養(yǎng)基做成平板，培養(yǎng)后數(shù)平板上形成的菌落數(shù)，由于一個菌落是由一個細菌繁殖而來的，所以可以用菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，計算出混合液中存活的細菌數(shù)。或者也可以用微孔濾膜過濾藥物與試驗菌的混合液，洗凈藥液，將濾膜放在平板上培養(yǎng)后數(shù)菌落數(shù)。第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、

酚系數(shù)測定（石炭酸系數(shù)測定）這種方法僅僅適用于酚類消毒劑殺菌效力的測定。酚系數(shù)是以酚為標準，將待測的化學消毒劑與殺菌效力相比較，所得的就是殺菌效力的比值。具體的測定方法是分別將酚及待測化學消毒劑按不同比例稀釋，各取5ml放到試管中，再加入經(jīng)24小時培養(yǎng)后的菌懸液各0.5ml，混勻后放入20℃水浴中，5、10、15分鐘分別取一接種環(huán)混合液移種到另一支5ml的肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時記錄生長情況。第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天（三）聯(lián)合抗菌試驗聯(lián)合抗菌試驗主要用于測定兩種或以上抗菌藥物聯(lián)合應用時的相互影響?？咕幝?lián)合應用時抗菌作用加強的稱為協(xié)同作用；等于兩藥單獨抗菌活性成為相加作用；抗菌作用減弱的稱為拮抗作用；相互無影響的稱為無關(guān)作用；常用的聯(lián)合抗菌試驗的方法有以下2種。第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1、棋盤格法棋盤稀釋法是常用的定量方法，首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。藥物最高濃度為MIC的2倍，對倍稀釋。兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。接種菌量為5×105CUF／ml，35℃孵育18h~24h后觀察結(jié)果。計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù)。第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天藥物及濃度青霉素G(IU／m1)

鏈霉素單藥對照

4210.50.25鏈霉素（μg／ml）

64------32------16-----

-8---+++4---+++青霉素G單藥對照

---++細菌對照-：無細菌生長+：有細菌生長

FIC指數(shù)=1／1+16／16=2——無關(guān)﹤0.5為協(xié)同作用；0.5－1為相加作用；1～2為無關(guān)作用；﹥2為拮抗作用。第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天[棋盤法的設(shè)計]棋盤法的主要優(yōu)點在于甲、乙兩藥的每個藥物濃度都有單獨的和與另一個藥物不同濃度的聯(lián)合，因此能精確測定兩種抗菌藥物在適當濃度的比例下所產(chǎn)生的相互作用。在進行棋盤法之前應先測定兩種抗菌藥物單獨對受試菌的MIC，然后以兩藥MIC的8倍、4倍、2倍、1倍以及MIC的1/2、1/4、1/8濃度（或4倍、2倍、1倍、1/2、1/4濃度）分別進行聯(lián)合?？梢娕e例，如表—1的青霉素G與鏈霉素聯(lián)合藥敏實驗和表2的TMP+SMZ的聯(lián)合作用。第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天聯(lián)合藥物敏感試驗和殺菌試驗的意義①治療混合性感染；②預防或推遲細菌抗生素耐藥性的發(fā)生；③聯(lián)合用藥可以減少劑量以避免達到毒性劑量；④聯(lián)合用藥比單一用藥時效果更好。

第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天2、瓊脂擴散紙條法將兩種含藥紙片貼于已涂布試驗菌的MH瓊脂平板表面，培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。培養(yǎng)后觀察兩藥形成的抑菌區(qū)的圖形來判斷兩藥聯(lián)合應用時，是無關(guān)、相加、協(xié)同還是拮抗作用（P148）。第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、藥物的體內(nèi)抗菌試驗藥物的體內(nèi)抗菌試驗又稱為動物試驗治療試驗或保護力試驗。當抗菌藥物進入機體后，其效力的發(fā)揮要受體內(nèi)各種因素的影響。因此在評定新藥的藥效時除做體外抗菌試驗外還需要做體內(nèi)的抗菌試驗。設(shè)立對照組第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、影響抗菌試驗的因素

1、試驗菌：常用細菌、霉菌和酵母菌的標準菌株；特殊情況下用分離株（傳代次數(shù)；對數(shù)期）2、培養(yǎng)基：按各試驗菌的營養(yǎng)要求進行配制，嚴格控制各種原料、成分的質(zhì)量及培養(yǎng)基的配制過程；不能含有降低藥物活性的成分或?qū)刮?。?5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天3、抗菌藥物：藥物的物理狀態(tài)、濃度、稀釋方法等都會直接影響抗菌試驗的結(jié)果，必需精確配制。（均質(zhì)；PH值為中性；中草藥）4、對照試驗：為確保試驗結(jié)果的科學性和準確性，試驗時應同時進行各種對照試驗。

試驗菌對照-在無藥情況下，應能在培養(yǎng)基內(nèi)正常生長。

溶劑及稀釋液對照-配制抗菌藥物時所用的溶劑及稀釋液均應無抗菌作用。

已知藥物對照-應使已知抗菌藥物對標準菌株出現(xiàn)抗菌效應。第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天滅菌和無菌制劑：直接注入體內(nèi)或直接接觸創(chuàng)傷面、粘膜等的一類制劑。滅菌制劑：采用某一物理或化學方法將殺滅或除去所有活的微生物繁殖體和芽孢的一類藥物制劑。無菌制劑：采用某一無菌操作方法或技術(shù)制備的不含任何活的微生物繁殖體和芽孢的一類藥物制劑。第二節(jié)滅菌制劑的無菌檢查法第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

需要進行無菌檢查的藥品、敷料、滅菌器具的范圍

各種注射劑：用于肌肉、皮下和靜脈的各種針劑，包括注射用的無菌水、輸液、注射劑原液等。眼用及外傷用制劑：用于眼科手術(shù)、角膜創(chuàng)傷及一般創(chuàng)傷、潰瘍和燒傷等外科用藥制劑。外科用的敷料、器材：如外科手術(shù)用的脫脂棉、紗布、縫合線及一次性注射器與一次性無菌手術(shù)刀片、輸血袋等。植入劑：用于包埋于人體內(nèi)的藥物制劑，如不溶于水的激素、免疫藥物及抗腫瘤藥物等無菌的制劑?？晌盏闹寡獎喝缒傅扔糜谥寡⒖杀唤M織吸收的各種藥物制劑。第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一、無菌檢查的基本原則1、嚴格的無菌操作：環(huán)境+操作2、建立方法的驗證：適合的檢查方法3、相關(guān)試劑及培養(yǎng)條件：供試品+三種培養(yǎng)基+

合適溫度4、正確的采樣：隨機+采樣量和比例5、結(jié)果判斷：任一不合格則不合格第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天二、無菌檢查方法驗證試驗

方法驗證可與供試品的無菌檢查同時進行（一）試驗菌株：代次+保藏技術(shù)（二）培養(yǎng)基：需氧菌+厭氧菌+真菌培養(yǎng)基（三）稀釋液與沖洗液：滅菌（四）驗證試驗方法：菌液制備薄膜過濾法直接接種法結(jié)果判斷第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天三、無菌檢查的基本方法（一）供試品的檢查數(shù)量與檢驗量每批產(chǎn)品數(shù)量每種培養(yǎng)基最低檢驗量注射劑＜10010%或最少4個100-50010瓶（支）＞5002%或最多30個眼用及其他非注射產(chǎn)品＜＝4每個容器＜2005%或最少2個＞＝20010個桶裝固體原料5-5020%或最少4個＞502%或最少10個第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天供試品檢查的接種量、培養(yǎng)基裝量和取供試品

中國藥典2000版

單位：ml供試品裝量每管接種量直接接種法培養(yǎng)基量薄膜過濾法接種培養(yǎng)基量取供試品數(shù)(瓶、支)1或1以下全量15112-5以下半量15115-20以下2151120-50以下5401150-100以下(靜脈)全量-1005100-500全量-1005500以上500-1005無菌粉針劑11無菌粉末原料6份各0.5g第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天陽性對照菌需氧菌陽性對照菌：金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003或藤黃八疊球菌CMCC(B)28001厭氧菌陽性對照菌：生孢梭狀芽胞桿菌CMCC(B)64941真菌陽性對照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天無菌檢查法直接接種法：適用于非抗菌作用藥物檢查薄膜過濾法：適用于有抗菌作用的或大容量的供試藥物檢查第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天各種培養(yǎng)基種類、數(shù)量及培養(yǎng)溫度和時間

《中國藥典》2000版培養(yǎng)基種類培養(yǎng)溫度（℃）培養(yǎng)時間d培養(yǎng)基數(shù)量試驗管（支）陽性對照（支）陰性對照（支）需氧菌30-355211厭氧菌30-365211真菌20-257511第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天無菌檢查結(jié)果分析供試品需氧菌厭氧菌真菌對照試驗結(jié)果判定備注陽性陰性4______+_合格2+－____+_不合格重新取樣復試2次仍有菌生長，判不合格3__+－__+_不合格4____+－+_不合格5________重做按特殊藥品檢查6+－+－__++培養(yǎng)基染菌或操作不嚴格更換培養(yǎng)基，重檢并嚴格無菌操作第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)非滅菌制劑的微生物限度檢查法微生物限度檢查項目內(nèi)容：染菌量的檢查細菌數(shù)霉菌數(shù)酵母菌數(shù)控制菌的檢查大腸埃希氏桿菌(大腸桿菌)金黃色葡萄球菌沙門氏菌銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)破傷風桿菌活螨的檢驗第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天中國藥典2000版二部微生物限度標準

(單位：個/g或個/ml)表1編號劑型細菌數(shù)霉菌·、酵母菌數(shù)大腸桿菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌1片劑1000100-2酊劑100100-3膠囊劑1000100-4軟膏劑100100--5一般眼膏劑100---6一般滴眼劑100---7丸劑(滴丸、糖丸等)1000100-8氣霧劑10010---9糖漿劑100100-第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

中國藥典2000版二部微生物限度標準

(單位：個/g或個/ml)表2編號劑型細菌數(shù)霉菌、酵母菌數(shù)大腸桿菌金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌10膜劑100/10cm2100/10cm2---11顆粒劑1000100-12口服溶液劑、混懸劑、乳劑100100-13散劑外用散劑1000100100---14滴耳劑10010--15滴鼻劑10010---16洗劑100100--17搽劑100100--18凝膠劑100100---第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一、染菌量的檢查目的細菌數(shù)測定我們是為了考察每克或每毫升供試品所污染的活細菌數(shù)，來判明供試品被細菌污染的程度。霉菌與酵母菌數(shù)的測定是考察每克或每毫升供試品所污染的活的霉菌和酵母菌數(shù)，以此來判明供試品被真菌污染的程度。測定的方法細菌總數(shù)的測定營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基

+0.001%三苯四唑氯化物（TTC）霉菌總數(shù)的測定玫瑰紅鈉（馬?。┡囵B(yǎng)基第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天

控制菌的檢查口服制劑中不能檢出大腸桿菌臟器口服制劑不得檢出沙門氏菌和大腸桿菌一般外用藥和眼科制劑不得檢出金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌用創(chuàng)傷、潰瘍、止血、深部組織的藥材藥粉制劑不得檢出破傷風桿菌。第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌的檢驗供試