高三生物第一輪復(fù)習(xí)PCR技術(shù)與電泳相關(guān)問題課件

微專題10PCR技術(shù)與電泳相關(guān)問題1.原理與條件一、PCR的原理

一定的緩沖液：提供最適酶的催化條件變性復(fù)性延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。2.PCR反應(yīng)過程控制溫度使DNA反復(fù)復(fù)制通過凝膠電泳來檢測擴增的產(chǎn)物5’5’2.PCR過程結(jié)論：①n次復(fù)制后含有引物A的_______個。含有引物B的_______個。同時含有引物A和B的_______個。②從第____次擴增開始能夠獲得單純的目的基因。2n-12n-12n-23隨著擴增次數(shù)增加，單純的目的基因比例逐漸增加；n代后，單純的目的基因數(shù)量為2n-2n5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’思考：PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？例1.利用PCR技術(shù)擴增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如下圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯誤的是

A.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時含有引物A和引

物B的DNA片段所占的比例為15/16B.設(shè)計引物時需要避免引物之間形成堿基互補配對而造成引物自連C.復(fù)性溫度過高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物D.用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列A(2020·江蘇卷)節(jié)選：若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，若想獲得圖示的序列，選用的PCR引物應(yīng)是______②④3.引物的基本要求：引物自身不能環(huán)化兩種引物之間不能互補配對引物長度不宜過短，防止引物隨機結(jié)合（1）凝膠電泳分離對擴增后的DNA染色處理后凝膠電泳分離。DNA電泳是根據(jù)DNA分子大小來分離和識別DNA片段的技術(shù)。較小的DNA片段在凝膠中的移動較快，較大的DNA片段移動較慢。當(dāng)電泳結(jié)束時，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置，這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。缺點：只能作定性分析，不能定量；易造成污染出現(xiàn)假陽性。4.PCR的結(jié)果檢測

（2）（實時）熒光定量PCR例2P345(2)如果要同時擴增兩種基因，則試劑盒中的引物應(yīng)該有________種。圖1為新冠病毒的“ORFlab”基因?qū)?yīng)的cDNA片段結(jié)構(gòu)示意圖，則與之對應(yīng)的引物結(jié)合的部位應(yīng)該是圖中的________(子鏈延伸方向為其自身的5′→3′，用圖中數(shù)字作答)。若已知該基因的一條引物，________(填“能”或“不能”)依據(jù)其堿基序列設(shè)計出另一條引物，理由是__________________。44、1不能兩種引物的堿基序列沒有相關(guān)性(3)在檢測過程中，隨著PCR的進行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷積累，熒光信號的強度也隨之增加。根據(jù)熒光強度的變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴增曲線(如圖2)。

試劑盒中的原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定的循環(huán)數(shù)后，熒光分子不再增加①出現(xiàn)“平臺期”最可能的原因是__________________________。②理論上，在檢測過程中，有熒光信號出現(xiàn)，則說明檢測結(jié)果呈________(填“陰”或“陽”)性，但為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般要達(dá)到或超過閾值時才確診。現(xiàn)有兩個待檢樣本，檢測時都出現(xiàn)了如圖2所示的曲線，但甲的A點比乙的A點明顯左移。請給這種結(jié)果作出科學(xué)合理的解釋(試劑盒合格且正常，操作過程規(guī)范且準(zhǔn)確)：______________。陽

甲樣本中的新冠病毒核酸含量更高，達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少rRT-PCR可以分兩部分來看，其中r代表實時（real-time），主要是通過熒光PCR連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序以及信號強弱的變化，即時分析目的基因的初始量，該技術(shù)的發(fā)明實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。；RT表示逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）。在RT-PCR中，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增cDNA（圖1）。2019-nCoV核酸檢測優(yōu)點：靈敏度和特異性高，判斷是否感染新冠病毒的直接接證據(jù)。（實時）熒光RT-PCRP345例3變式.(2022·揚州市高三期中)實時熒光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸檢測，其原理是：在PCR復(fù)性過程中探針和引物一起與模板結(jié)合，探針兩側(cè)分別帶有熒光基團和抑制熒光發(fā)出的淬滅基團，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會破壞探針，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團分離而發(fā)出熒光。利用RT－PCR進行核酸檢測的相關(guān)過程如圖所示。下列說法錯誤的是

（

）

（1）檢測是否被病毒感染下列說法錯誤的是（

）A.做RT－PCR之前，需要先根據(jù)cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B.RNA不能作為PCR擴增的模板，故需要將樣本中的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA后再進行擴增C.若檢測結(jié)果有強烈熒光信號發(fā)出，說明被檢測者沒有感染病毒D.病毒的檢測還可以檢測病毒表面的物質(zhì)或病毒引發(fā)產(chǎn)生的抗體，其原理都是抗原—抗體雜交C二.PCR的應(yīng)用（1）檢測是否被病毒感染（2）反向PCR擴增未知DNA區(qū)域（3）PCR定點突變技術(shù)—重疊延伸PCR

原理是：用限制性內(nèi)切核酸酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產(chǎn)物環(huán)化，這樣就獲得了已知序列兩側(cè)攜帶有未知序列的環(huán)狀DNA分子。以該已知序列為模板設(shè)計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。（2）反向PCR測定未知DNA區(qū)域請看圖理解反向PCR擴增未知區(qū)域的過程。該技術(shù)要使用四條引物。其中引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點，而這兩條引物有部分堿基是可以互補的。因此，分別利用引物1和2，引物3和4進行PCR后，得到的DNA片段可以通過引物2和3互補的堿基雜交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成為一條完整的DNA片段。最后，用引物1和4進行擴增得到含有突變位點的DNA片段。通過測序可以檢驗定點突變是否成功。PCR定點突變技術(shù)—重疊延伸PCR重疊延伸PCR技術(shù)是常規(guī)PCR技術(shù)的衍生，它依據(jù)需要連接的基因中核苷酸序列(或基因片段)設(shè)計出多對具有互補末端的引物，先分段對模板進行擴增，再將PCR產(chǎn)物混合，其中的重疊鏈將相互搭橋、互為模板而延伸，最終實現(xiàn)不同來源的擴增片段重疊拼接起來的目的，如下圖1所示。請分析并回答下列問題：看懂圖1引物2和引物3之間的關(guān)系利用重疊延伸PCR拼接兩段DNA(1)圖1中的過程②在______個反應(yīng)體系中進行，原因是_____________。經(jīng)過程②后，體系中存在不同長度的DNA片段，獲取所需DNA的方法是

。①中引物2和引物3的游離部分分別與_

的部分序列同源。外顯子B、外顯子A2

引物互補影響PCR結(jié)果

(瓊脂糖凝膠)電泳分離

(2)圖1中的過程⑥________(填“需要”或“不需要”)另加引物，原因是__________________。進行②⑥⑧⑩過程時，需要在一定的緩沖溶液中進行，⑩過程除圖示條件還需要加入______________________。

兩條DNA的交錯（配對）部分即可作為其延伸的引物

不需要

原料(四種脫氧核苷酸)、耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)(3)重疊延伸PCR技術(shù)可用于基因的定點突變。基因定點突變是根據(jù)目的基因(如圖2蛋白A基因)的序列，設(shè)計4條單鏈寡核苷酸片段為引物(圖2中的引物A→D)，原理是取引物A、B進行PCR1反應(yīng)，以及引物C、D進行PCR2反應(yīng)，然后將需要的兩個片段混合、延伸并大量擴增。圖2引物B和引物C中的“?”代表

，引物B和引物C堿基序列間存在的關(guān)系是__________。

突變的堿基

互補題后悟道：重疊延伸PCR技術(shù)獲得融合基因

PCR定點突變技術(shù)—大引物PCR大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規(guī)上游引物和常規(guī)下游引物。該技術(shù)的流程如圖所示。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進行擴增，得到不完整的含有突變位點的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴增得到完整的含有突變位點的DNA片段。

某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見圖。1.若擬突變位點的堿基對為A—T，則需要讓其突變?yōu)開______________才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(突起處)應(yīng)設(shè)計為__________(假設(shè)引物為單鏈DNA)。C—G或T—AG或A

某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理見圖。2.中引物2或引物3設(shè)計的要求是

.或引物2和引物3中必須具有互補配對的片段閱讀下面的材料，完成（1）~（4）題。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品已經(jīng)越來越多地進入了人們的生活。2020年7月，兩種國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物獲得生物安全證書。這是近十年來第二批獲得生物安全證書的國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物，一種是轉(zhuǎn)epsps和pat基因抗除草劑玉米（DBN9858），另一種是轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆。我國是農(nóng)業(yè)大國，對轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的管理非常嚴(yán)格。根據(jù)我國法規(guī)，除需對國產(chǎn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物進行檢測外，進出境的所有農(nóng)產(chǎn)品均需進行轉(zhuǎn)基因成分的檢測。對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測方法，目前主要有兩類：一類是以導(dǎo)入外源基因的特定DNA序列為檢測對象；另一類則是以外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)為檢測對象。通常被檢測的特定DNA序列包括兩類：一類是非目的基因序列，主要為載體上通常具有的各種組成元件；另一類被檢測的則是目的基因序列本身。基因芯片技術(shù)是一種能有效地對轉(zhuǎn)基因作物進行檢測的新技術(shù)。以對DBN9858的檢測為例，第一步，針對待測的特定DNA片段設(shè)計引物，擴增出的特定DNA片段帶上標(biāo)記制成探針，經(jīng)變性后通過芯片點樣儀固定到雜交膜上，再經(jīng)過一定的處理，便得到可用于檢測的DNA芯片（如圖1）；第二步，從待測植物中提取DNA作為模板，加入引物進行擴增；第三步，將擴增產(chǎn)物經(jīng)過變性處理后鋪于芯片表面，放入雜交盒中，在適宜條件下進行雜交；第四步，待反應(yīng)結(jié)束后，對芯片進行清洗等處理，用儀器檢測芯片上的雜交結(jié)果。利用基因芯片可以實現(xiàn)一次性高通量快速檢測，是一種具有良好發(fā)展前景的檢測手段。

（1）利用基因芯片可檢測特定DNA序列依據(jù)的是____________原則。對DBN9858進行檢測的基因芯片的陣列設(shè)計為：第1列為空白對照，第2列固定玉米植株的內(nèi)源基因作為陽性對照，第3列固定與玉米DNA序列高度________（填“同源”或“非同源”）的DNA片段作為陰性對照，第4~6列可分別固定____________、

____________、

____________進行檢測，每列重復(fù)多次以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。堿基互補配對

非同源

epsps基因pat基因

啟動子（或終止子、標(biāo)記基因）（2）制備探針可采用缺口平移法（如圖2），即先利用DNA酶使DNA分子上產(chǎn)生____________（填“單鏈”或“雙鏈”）缺口，再利用DNA聚合酶具有的核酸外切酶活性和聚合酶活性，在缺口處的5'末端每切除一個脫氧核苷酸，同時在3'末端添加一個_____________的脫氧核苷酸，最終制成所需探針。帶標(biāo)記

單鏈

（3）若該基因芯片準(zhǔn)備商品化，你認(rèn)為還應(yīng)該在哪些方面進一步改進?____________（至少一點）

“從使用方便、測試準(zhǔn)確率高”方向想提高檢測靈敏度、穩(wěn)定性；增加可檢測DNA序列種類，提高通用性；改進技術(shù)簡化檢測過程、提高自動化水平等

（4）除了基因檢測，還可以采用

方法檢測農(nóng)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)．對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行檢測時，常常會出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果，下列分析合理的是____________。A．某些檢測成分在植物中天然存在，導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果B．PCR引物設(shè)計復(fù)雜，若引物間發(fā)生結(jié)合，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果C．轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中被加工、修飾，難以檢測，出現(xiàn)假陰性結(jié)果D．轉(zhuǎn)基因作物中的外源成分含量低、在加工過程中易變性，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性結(jié)果ACD抗原-抗體雜交

3.向細(xì)菌中導(dǎo)入一些特殊DNA序列作為生物傳感器，可制備出在特定環(huán)境中優(yōu)先生長的工程菌，用于生物治療。(1)研究者利用圖1所示的原理分別設(shè)計氧氣傳感器和乳酸傳感器。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含氧傳感器的大腸桿菌工程菌時，需將含有______________和特定基因的DNA片段與載體連接，構(gòu)建表達(dá)載體，導(dǎo)入用____________處理的大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)。Ca2+啟動子A的DNA片段

(2)研究者用GFP（綠色熒光蛋白）基因作為特定基因制備出含乳酸傳感器的試驗性工程