任務(wù)3破傷風(fēng)疫苗（破傷風(fēng)類毒素）生產(chǎn)技術(shù)

學(xué)習(xí)情境一

預(yù)防性疫苗的生產(chǎn)

生物工程學(xué)院任務(wù)4破傷風(fēng)疫苗生產(chǎn)技術(shù)知識(shí)目標(biāo)（1）了解破傷風(fēng)桿菌及其毒素；（2）掌握種子菌夜的培養(yǎng)；（3）掌握產(chǎn)毒培養(yǎng)基的配置；（4）掌握吸附過程；（5）掌握濃縮和精制過程；（6）掌握破傷風(fēng)毒素生產(chǎn)工藝；能力目標(biāo)（1）培養(yǎng)學(xué)生對(duì)疫苗的認(rèn)知能力；（2）培養(yǎng)學(xué)生的觀察、分析、鑒別、總結(jié)歸納能力；（3）培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)結(jié)協(xié)作能力；（4）鍛煉學(xué)生的動(dòng)手能力。素質(zhì)目標(biāo)（1）培養(yǎng)良好學(xué)習(xí)態(tài)度，注重項(xiàng)目操作細(xì)節(jié)；（2）遵守操作規(guī)程，愛護(hù)儀器設(shè)備；（3）樹立安全意識(shí)，保護(hù)自身和同學(xué)人身安全?！绊?xiàng)目導(dǎo)向-任務(wù)驅(qū)動(dòng)”教學(xué)法?！敖虒W(xué)做一體”教學(xué)法?！把菔拘浴苯虒W(xué)法?！耙龑?dǎo)-自主學(xué)習(xí)”教學(xué)法。24教學(xué)方法13培養(yǎng)產(chǎn)毒和收獲毒素濃縮和精制重點(diǎn)難點(diǎn)

任務(wù)1：雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)抗體技術(shù)任務(wù)導(dǎo)入：1.大家聽說過破傷風(fēng)病嗎？2.破傷風(fēng)毒素是怎么回事？3.那么我們?nèi)绾蝸磉M(jìn)行破傷風(fēng)毒素的生產(chǎn)呢？1任務(wù)講解2學(xué)生利用已有的知識(shí)制定具體的生產(chǎn)方案3學(xué)生以小組為單位分析工作任務(wù)，并制定具體的方案，還要小組進(jìn)行具體的分工。教師示范和講解41、具體生產(chǎn)流程：

（1）菌種應(yīng)選用產(chǎn)毒散價(jià)高、免疫力強(qiáng)的破傷風(fēng)菌株。國(guó)內(nèi)使用的生產(chǎn)菌株為羅馬尼亞L58株，菌號(hào)64008株。（2）產(chǎn)毒培養(yǎng)基

現(xiàn)國(guó)內(nèi)多采用以蛋白質(zhì)水解液為基礎(chǔ)，再添加氨基酸及維生素等，在維持定的產(chǎn)毒水平下，適當(dāng)加深水解．同時(shí)加人少量的甘油及炭末．以增加厭氧環(huán)境、穩(wěn)定毒素和吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，從而提高產(chǎn)毒水平獲取高價(jià)毒素。2、技術(shù)操作要點(diǎn)：（3）培養(yǎng)產(chǎn)毒和收獲毒素

一般采用培養(yǎng)罐深層培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加炭末、甘油等以利破傷風(fēng)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒。在培養(yǎng)過程中利用平壓通氣的方法排出破傷風(fēng)菌生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的H2S和CO2氣體。培養(yǎng)溫度必須嚴(yán)格控制存34℃，高于35℃或低于32℃產(chǎn)毒水平都會(huì)大幅度下降。破傷風(fēng)毒素在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成產(chǎn)生，到培養(yǎng)后期才通過菌膜滲透或菌體裂解釋放到培養(yǎng)基中。所以經(jīng)培養(yǎng)5～6天后產(chǎn)毒達(dá)到高峰。利用除菌過濾的方法將培養(yǎng)物中菌體分離即可獲得含有破傷風(fēng)毒素的濾液。（4）脫毒收獲的毒素經(jīng)脫毒后即為類毒素。脫毒一般用0.3％～0.4％的甲醛液。此外，pH、溫度及脫毒時(shí)間等均影響脫毒效果。所以要選擇適當(dāng)條件，既能盡快脫毒，不發(fā)生毒素逆轉(zhuǎn)，叉能減少抗原性的損失?，F(xiàn)采用加入0.36％的甲醛、pH中性、37℃脫毒30天。（5）濃縮和精制一般采用超濾濃縮與硫酸銨沉淀相結(jié)合的方法精制破傷風(fēng)毒素。即超濾、硫酸銨沉淀、超濾三步法。可有效地提高破傷風(fēng)類毒素的制品質(zhì)量。第一步：超濾濃縮用50000MW中空纖維超濾器將原制類毒素濾液濃縮50～70倍。同時(shí)將濾液所含的大分子水解產(chǎn)物去除。第二步：硫酸銨分段沉淀第一階段沉淀，以0.16g／ml計(jì)算，將固體硫酸銨溶解于經(jīng)稀釋的濃縮液中，靜置過夜，以帆布過濾，濾清后將沉淀廢棄。第二階段沉淀，以上述濾過液按0.10g/ml左右加入硫酸銨，溶解后．靜置過夜．以帆布過濾，濾清后將濾液廢棄，沉淀用注射用水溶解并做澄清過濾。第三步：超濾透析將上述濾液用注射用水適當(dāng)稀釋，循環(huán)超濾除去溶液中的硫酸銨，以最終硫酸銨含量低于0.001g／ml為合格。（6）除菌過濾將精制類毒素稀釋、調(diào)整到適當(dāng)濃度(即萬分之一硫柳汞、085％NaCI)，用5％的NaOH調(diào)pH至6.8～7.2。使用0.22μm的微孔濾膜，除菌過濾分裝。（7）吸附精制破傷風(fēng)類毒素的制備將類毒素吸附于Al(OH)3以增強(qiáng)類毒素的免疫效果和減輕接種副反應(yīng)。精制類毒素的吸附：在無菌條件下，按7Lf/ml精制類毒素加入吸附劑中，補(bǔ)加1％的硫柳汞防腐劑，使其最終含量為1/10000。同時(shí)補(bǔ)加1/15mol/L，pH6.6磷酸鹽緩沖液，使其含量達(dá)到1/300mol/L,攪拌均勻后分裝。任務(wù)下達(dá)訓(xùn)練5分組操作：學(xué)生分組實(shí)踐破傷風(fēng)毒素這一工作任務(wù)，教師根據(jù)學(xué)生出現(xiàn)的問題進(jìn)行有側(cè)重點(diǎn)的示教操作，指出并解釋操作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。學(xué)生再練習(xí)，教師巡回指導(dǎo)，糾正學(xué)生操作上的錯(cuò)誤，并隨時(shí)解答學(xué)生的疑難問題。（隨堂打分：自我學(xué)習(xí)能力及操作技能。）

結(jié)果展示教師點(diǎn)評(píng)并