細(xì)胞因子及抗體檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于細(xì)胞因子及抗體檢測(cè)技術(shù)背景知識(shí)研究細(xì)胞因子對(duì)闡明機(jī)體免疫應(yīng)答及其調(diào)節(jié)機(jī)制、免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和指導(dǎo)臨床治療均具有重要意義抗體具有高特異性、高親和力等特點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域第2頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞因子的檢測(cè)方法：

1)生物學(xué)方法①依賴性細(xì)胞株：生物分析法②功能檢測(cè)：生物分析法

2)分子生物學(xué)方法①分子雜交技術(shù)：mRNA表達(dá)水平的測(cè)定②多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）：mRNA的測(cè)定

3）免疫學(xué)方法①免疫測(cè)定：免疫酶技術(shù)②功能測(cè)定與抗體抑制第3頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天抗體檢測(cè)技術(shù)免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)間接血凝試驗(yàn)放射免疫測(cè)定蛋白印跡免疫共沉淀親和力測(cè)定

第4頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)

(ELISA)

Enzymelinkedimmunosorbentassay

第5頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

基于NP30抗獨(dú)特型抗體可替代蟲源性抗原率先應(yīng)用生物技術(shù)制備抗原代替?zhèn)鹘y(tǒng)蟲源抗原血吸蟲抗體屬短程抗體，治療后陰轉(zhuǎn)較快，具有療效考核價(jià)值

該試劑盒的診斷效能多項(xiàng)指標(biāo)均已達(dá)到或超過(guò)經(jīng)典抗體檢測(cè)法，較以前病原學(xué)檢查和免疫學(xué)檢測(cè)方法，更為簡(jiǎn)便快速優(yōu)點(diǎn)：僅用一滴血，20分鐘即可判讀結(jié)果，不需其他儀器設(shè)備，便于在基層、現(xiàn)場(chǎng)使用本試劑盒已在血吸蟲流行區(qū)已應(yīng)用近120萬(wàn)人次

第6頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天管曉虹（1946-2012），女，漢族，江蘇丹陽(yáng)人，博士，教授，博士生導(dǎo)師。農(nóng)工民主黨員。農(nóng)工民主黨第十二、十三屆中央常委，第九、十屆全國(guó)人大代表，江蘇省婦聯(lián)副主席。1970年畢業(yè)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)；1981和1985年先后在原南京醫(yī)學(xué)院獲醫(yī)學(xué)碩士和醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；1988年在美國(guó)布朗大學(xué)作博士后研究。曾任寄生蟲學(xué)教研室副主任、江蘇省醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、衛(wèi)生部抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任。

承擔(dān)國(guó)家“七五”、“八五”、“九五”科技攻關(guān)項(xiàng)目各1項(xiàng)（血吸蟲病免疫診斷）；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目1項(xiàng)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目6項(xiàng)；發(fā)表論文100余篇；主編或參編衛(wèi)生部規(guī)劃教材6部；獲部省級(jí)科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)2項(xiàng)、三等獎(jiǎng)2項(xiàng)；獲國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)6項(xiàng)。獲“全國(guó)優(yōu)秀教師”、“國(guó)家級(jí)有突出貢獻(xiàn)的中青年專家”等榮譽(yù)稱號(hào)。享受國(guó)務(wù)院政府特殊津貼。

第7頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫技術(shù)此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問(wèn)世以來(lái),發(fā)展十分迅速優(yōu)點(diǎn)：微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便、安全等廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域第8頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理

ELISA利用了免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性檢測(cè)抗原或抗體使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步驟進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)加底物顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析第9頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天方法類型

ELISA既可測(cè)抗原又可測(cè)抗體，根據(jù)試劑來(lái)源、標(biāo)本性狀以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出不同類型的檢測(cè)方法：

1.直接法

2.間接法

3.雙抗體夾心法

4.雙夾心間接法第10頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、試劑及儀器準(zhǔn)備（一）免疫吸附劑1.固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)②能保持Ag或Ab活性③不參與化學(xué)反應(yīng)

第13頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑵載體性能比較

要求：載體材料+、-結(jié)果差別大

檢測(cè)方法：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)20孔的OD，要求CV<10%⑶常用載體：

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等

形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板第14頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：

包被：將Ag或Ab固相化的過(guò)程包被緩沖液、包被方法

封閉：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾第15頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天㈡酶結(jié)合物：1.要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來(lái)源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定2.常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等3.底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(492nm)；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：藍(lán)色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB：棕黃色α-萘酚：紅色3-氧基-9-乙基卡唑：紅色4-氯-1-萘酚：灰藍(lán)色AP可溶性底物及呈色：對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光AP不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色堅(jiān)固紅和萘酚ASMX混合液：紅色

?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光第16頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.酶結(jié)合物的制備：戊二醛交聯(lián)法過(guò)碘酸鹽氧化法第17頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）設(shè)備：酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀

指測(cè)讀ELISA光度計(jì)；針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)性能指標(biāo)：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%操作：室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30min，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀第18頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第19頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、操作步驟

（間接ELISA法）

樣本的收集包被抗原封閉加稀釋的待檢樣品加酶標(biāo)抗抗體加底物顯色終止反應(yīng)第20頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）樣品的收集和保存：

1.溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用于HRP的輔基)；

2.細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-”(破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白)；

3.反復(fù)凍融可使抗體效價(jià)下降而假“-”；

4.陳舊標(biāo)本可使IgG聚集，引起間接法本底增加；

5.標(biāo)本中含NaN3，可出現(xiàn)假“-”。第21頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）包被包被(coating)：將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)程

原理：物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用；這種物理吸附是非特異性的影響因素：受蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、濃度等

大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面第22頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

包被條件

pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2磷酸鹽緩沖液

pH7-8Tris-HCl緩沖液。

方法：加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜或37℃中保溫2小時(shí)。

濃度：隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml第23頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

最適工作濃度的選擇

可用棋盤滴定法在夾心ELISA法中選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度，即利用棋盤滴定，將包被抗體和酶標(biāo)抗體稀釋成一系列濃度，反應(yīng)后顯色。陽(yáng)性值在0.8左右，陰性值小于0.1為最適，可據(jù)此選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度第24頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天

方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進(jìn)行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對(duì)照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標(biāo)抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強(qiáng)陽(yáng)性參考血清A值；為0．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度

第25頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）封閉封閉(blocking)：是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。第26頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）加樣（抗原或抗體）純化抗原/抗體：天然但干擾多合成抗原/抗體：多肽分子較小，常有空間位阻基因抗原：與片段的選擇和制備水平有關(guān)第27頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)照設(shè)定陽(yáng)性對(duì)照品(positivecontrol)陰性對(duì)照品(negativecontrol)目的:

是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。要求：陽(yáng)性對(duì)照品：基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量陰性對(duì)照品：須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)第28頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）加酶標(biāo)抗體

酶標(biāo)記的抗體（原）：ELISA中關(guān)鍵的試劑要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等第29頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（六）顯色

顯色：酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。影響因素：溫度、時(shí)間

在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB：受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。第30頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（七）結(jié)果判定

操作方法：拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。

結(jié)果判定：光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是將吸收波長(zhǎng)寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。第31頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天定性測(cè)定

定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔第32頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.定量測(cè)定

ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。第33頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天第34頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、基本操作注意事項(xiàng)（一）加樣:一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。方法：加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。第35頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）孵育

ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的孵育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。第36頁(yè),共44頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）洗滌

洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。洗滌目的：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性