病毒基因工程

關(guān)于病毒基因工程病毒基因工程疫苗

病毒基因工程疫苗：基因缺失減毒活疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗、合成肽疫苗和抗獨特性疫苗第2頁,共23頁，2024年2月25日，星期天基因工程疫苗的優(yōu)點生產(chǎn)成本降低可以生產(chǎn)目前尚無敏感細(xì)胞的病毒疫苗如：乙型肝炎病毒表面抗原疫苗采用重組病毒系統(tǒng)如痘病毒（易于制備同一載體的多價病毒疫苗）可以完全去除病毒基因中具有潛在危害性的部分（某些病毒的致癌基因）可以制備單一成分病毒疫苗，也可制備同一病毒多成分的病毒疫苗第3頁,共23頁，2024年2月25日，星期天抗病毒藥物和制劑很多抗病毒感染的藥物是一種生物藥物（干擾素、轉(zhuǎn)移因子、活性多肽等），生物藥物有的來源于病毒，有的來源于病毒感染細(xì)胞時宿主的反應(yīng)產(chǎn)物，它們都是有相應(yīng)的細(xì)胞中產(chǎn)生的，在組織細(xì)胞內(nèi)含量極微，而基因工程可以大量生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)第4頁,共23頁，2024年2月25日，星期天病毒載體病毒載體優(yōu)點（1）病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單，遺傳背景比較清楚，易于改造和操作，適合于大規(guī)模的商業(yè)應(yīng)用（2）病毒增殖速度快外源基因在很短時間就可大量積累（3）病毒自身具有感染特定受體細(xì)胞的能力，外源基因的導(dǎo)入效率較高（4）病毒具有特異的宿主范圍和組織嗜性，外源基因的導(dǎo)入具有一定的靶向性，對基因的治療有益第5頁,共23頁，2024年2月25日，星期天（5）病毒種類繁多，且各具不同的特性，構(gòu)建的病毒載體也具有不同的特點，可以用于不同類宿主的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)，以滿足不同的需要，擴(kuò)大基因工程的適用范圍第6頁,共23頁，2024年2月25日，星期天病毒載體的應(yīng)用高水平表達(dá)特定基因產(chǎn)物真核細(xì)胞基因的分子生物學(xué)研究病毒載體可被用作基因遞送系統(tǒng)第7頁,共23頁，2024年2月25日，星期天病毒載體的主要類型一噬菌體載體二桿狀病毒載體三動物病毒載體四植物病毒載體第8頁,共23頁，2024年2月25日，星期天入噬菌體基因組結(jié)構(gòu)：可分為左臂、中段和右臂三個部分。左臂從A到J,長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)建頭部、尾部、尾絲等組裝完整噬菌體所需的蛋白質(zhì)。中段長約20kb，是入噬菌體DNA整合和切出、溶原性生長所需的序列。右臂長8~10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的基因調(diào)控序列以及入噬菌體DNA的復(fù)制起始區(qū)。第9頁,共23頁，2024年2月25日，星期天入噬菌體載體構(gòu)建利用入噬菌作載體，主要是將外源DNA替代或插入中段序列，使其隨左臂和右臂一起包裝成噬菌體，再去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。第10頁,共23頁，2024年2月25日，星期天M13噬菌體基因組結(jié)構(gòu)核心部分是一單鏈環(huán)狀DNA分子，長6407個核苷酸，有10個基因組成，90%以上基因組序列編碼蛋白質(zhì)，除了在基因Ⅱ于基因Ⅳ以及基因Ⅲ與基因Ⅷ之間有較長的基因間隔區(qū)（IR）外，其它基因之間的間隔僅有幾個核苷酸。第11頁,共23頁，2024年2月25日，星期天M13噬菌體載體構(gòu)建利用M13基因組中一段507個核苷酸的基因間隔序列（IS），該區(qū)可接受外源DNA的插入而不影響M13噬菌體的活力，通過常構(gòu)建M13載體都是在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，然后在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點，以便于外源片段的插入。第12頁,共23頁，2024年2月25日，星期天M13絲狀噬菌體載體的特點M13的感染與釋放不會殺死宿主菌，僅導(dǎo)致宿主細(xì)胞生長緩慢M13DNA在宿主細(xì)胞中既可以是單鏈也可以是雙鏈，通過感染或轉(zhuǎn)化的方法能將M13DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中M13的包裝不受DNA大小的限制，噬菌體顆粒大小可隨DNA的大小而改變，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能進(jìn)行包裝可用于制備大量純化的單鏈DNA分子第13頁,共23頁，2024年2月25日，星期天二桿狀病毒表達(dá)載體A基本原理目的基因插入轉(zhuǎn)移載體。目的基因轉(zhuǎn)移到病毒基因組靶位點，空斑純化獲得重組病毒。重組病毒感染宿主培養(yǎng)細(xì)胞或幼蟲。第14頁,共23頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共23頁，2024年2月25日，星期天桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體通常由三部分組成：E.coli質(zhì)粒的復(fù)制原點和抗生素抗性基因（如Ampr），保證轉(zhuǎn)移載體能在大腸桿菌中擴(kuò)增。含有一個桿狀病毒高效表達(dá)基因的啟動子，在該啟動子下插入要表達(dá)的外源基因。啟動子上游和外源基因下游則分別含有一段桿狀病毒DNA序列，用于與野生病毒DNA同源重組。第16頁,共23頁，2024年2月25日，星期天桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點優(yōu)點對外源基因容量大適合表達(dá)細(xì)胞毒性蛋白安全性表達(dá)產(chǎn)量高后加工過程完全可以同時表達(dá)多個外源基因體內(nèi)表達(dá)缺點瞬時表達(dá)糖基化簡單第17頁,共23頁，2024年2月25日，星期天動物病毒載體分類整合型載體病毒載體整合入宿主細(xì)胞染色體，并隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，可持續(xù)表達(dá)外源基因，但存在插入誘變的危險，主要包括SV40載體和反轉(zhuǎn)錄病毒載體。游離型載體病毒載體不整合入宿主細(xì)胞染色體，以病毒顆粒的形式獨立復(fù)制，或在輔助病毒的協(xié)助下復(fù)制，沒有插入誘變的危險，一般為瞬時表達(dá)，主要包括腺病毒和痘病毒。第18頁,共23頁，2024年2月25日，星期天植物病毒郁金香碎色花病毒造成第19頁,共23頁，2024年2月25日，星期天植物病毒載體類型置換型載體插入型載體互補(bǔ)型載體抗原展示型載體融合/釋放型載體第20頁,共23頁，2024年2月25日，星期天植物病毒載體表達(dá)優(yōu)點*部分植物病毒對寄主的感染時系統(tǒng)性的，它能夠?qū)⒒蚪M擴(kuò)散到被感染植株的所有細(xì)胞。*植物病毒載體有可能解決將外源基因?qū)胂裼衩走@樣的單子葉植物問題。*被感染的植株能夠繁殖出大量的病毒顆粒，因此有可能通過重組病毒載體利用植物來生產(chǎn)大量的外源蛋白質(zhì)。第21頁,共23頁，2024年2月25日，星期天缺點穩(wěn)定性：較差，常由于病毒基因的重組而導(dǎo)致丟失外源基因外源基因大小限制：表達(dá)外源基