非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的合成+最終稿

非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的合成【摘要】目的：本論文的研究?jī)?nèi)容包括非核苷類DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的合成，并利用核磁共振波譜儀和高分辨質(zhì)譜對(duì)合成的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，為后續(xù)抗腫瘤活性的評(píng)價(jià)做了一定基礎(chǔ)性工作。方法：本文以咔唑?yàn)槠瘘c(diǎn)，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)選擇合適的反應(yīng)物，經(jīng)N-烷基化、開環(huán)、酰胺縮合等步驟合成目標(biāo)產(chǎn)物，根據(jù)化合物的物理化學(xué)性質(zhì)選擇合適的催化劑、溶劑等，采用TLC薄層色譜法判斷反應(yīng)是否完成，采用液-液萃取法將脂溶性化合物與水溶性雜質(zhì)、中間體、副產(chǎn)物、催化劑和溶劑分離，采用柱層析法或PTLC薄層色譜法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最后采用核磁共振波譜法和質(zhì)譜法對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。結(jié)果：成功合成14.5mg淡黃色固體H，產(chǎn)率59.8%，經(jīng)結(jié)構(gòu)確證所合成的化合物H為N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。結(jié)論：成功制備了結(jié)構(gòu)正確的N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺?！娟P(guān)鍵詞】雙靶點(diǎn)藥物，抗腫瘤，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，組蛋白去乙酰酶

Synthesisofnon-nucleosideDNMT1andHDACdualtargetinhibitors[Abstract]Objective:Theresearchinthisthesisincludedthesynthesisofnon-nucleosideDNMT1andHDACdualtargetinhibitors,andthestructuralconfirmationofthesynthesizedcompoundsusingNMRspectroscopyandhigh-resolutionmassspectrometry,whichmadesomebasicworkforthesubsequentevaluationoftheantitumoractivity.Methods:Inthispaper,carbazolewasusedasthestartingpointtoselectsuitablereactantsaccordingtothestructureofthetargetproducts,andthetargetproductsweresynthesizedbyN-alkylation,ringopeningandamidecondensationsteps,etc.Suitablecatalystsandsolventswereselectedaccordingtothephysicochemicalpropertiesofthecompounds,andTLCthin-layerchromatographywasusedtodeterminewhetherthereactionwascompleted,andliquid-liquidextractionwasusedtoseparatethefat-solublecompoundsfromthewater-solubleimpurities,intermediates,by-products,theThetargetproductswereseparatedandpurifiedbycolumnchromatographyorPTLCthin-layerchromatography,andfinallythetargetproductswerestructurallyconfirmedbyNMRspectroscopyandmassspectrometry.Results:14.5mgoflightyellowsolidHwassynthesizedsuccessfullywithayieldof59.8%.ThecompoundHsynthesizedwasN1-(4-(2-((3-(9H-carbazol-9-yl)-2-hydroxypropyl)amino)ethyl)phenyl)-N5-hydroxy-glutenediamine.Conclusion:N1-(4-(2-((3-(9H-carbazol-9-yl)-2-hydroxypropyl)amino)ethyl)phenyl)-N5-hydroxy-pentenediaminewaspreparedsuccessfully.[Keywords]DualtargetdrugsAntitumorDNAmethyltransferaseHistonedeacetylase

目錄1前言 1前言1.1表觀遺傳學(xué)惡性腫瘤（癌癥）已經(jīng)成為當(dāng)今社會(huì)影響人們健康和日常生活的重大因素，其發(fā)病可由多方面因素造成，包括基因?qū)用娴倪z傳學(xué)因素，以及與遺傳方面無關(guān)的飲食方面的因素。表觀遺傳學(xué)是與遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念。表觀遺傳學(xué)改變是基于對(duì)DNA堿基排列順序以外的基因調(diào)控，不影響DNA的堿基序列，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重組、非編碼RNA等。此外，表觀遺傳改變還可以通過以下途徑參與調(diào)控惡性腫瘤的多種生物學(xué)過程：（1）通過調(diào)控原癌基因或抑癌基因激活與沉默；（2）通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)與沉默；（3）通過調(diào)控DNA復(fù)制和修復(fù)；（4）通過調(diào)控端粒調(diào)節(jié)、有絲分裂期著絲粒的穩(wěn)定性和染色體分離等過程[1]。這些調(diào)控信息的改變，與人體許多疾病息息相關(guān)，如腫瘤、代謝性疾病和退行性疾病等[2]。由于這些疾病在某種程度上是可逆的，因此，對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)和調(diào)控，可以在一定程度上延緩甚至逆轉(zhuǎn)疾病發(fā)展的進(jìn)程。近年來，以表觀遺傳學(xué)上的改變作為抗腫瘤治療的切入點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)和調(diào)控機(jī)制的研究，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外抗腫瘤研究的熱點(diǎn)[3,4]。DNA甲基化和組蛋白去乙?；潜碛^遺傳學(xué)修飾的重要途徑，是表觀遺傳調(diào)控的主要方式，它們分別由多種亞型的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和組蛋白去乙酰酶（HDACs）催化調(diào)控，當(dāng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙酰酶在細(xì)胞中的表達(dá)水平升高時(shí)，會(huì)使得細(xì)胞中抑癌基因沉默，然后使其失活，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞的水平相對(duì)升高，最終促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[5-8]。DNMT和HDAC是具有極大研究意義和前景的抗腫瘤治療靶標(biāo)。對(duì)靶向作用于DNMTs和HDACs的小分子抑制劑進(jìn)行調(diào)控機(jī)制的研究，可為腫瘤等疾病的預(yù)防和治療提供新的方案和選擇。1.2DNA甲基化與癌癥DNA甲基化是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)催化，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體提供甲基，與CpG二核苷酸中5′端胞嘧啶共價(jià)結(jié)合，從而生成5-甲基胞嘧啶，這一過程稱為“DNA甲基化”[9-12]。目前發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有五種，包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，它們對(duì)于DNA甲基化的調(diào)控方式各有不同，在人體中的含量也各不相同[13]。在已發(fā)現(xiàn)的幾種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶中，DNMT1在人類的細(xì)胞中含量最高，其異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等[14-16]，例如在實(shí)體瘤中，DNMT1過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良，在前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中都存在DNMT1過表達(dá)的情況；在胰腺癌中，存在DNMTI和DNMT3A過度表達(dá)現(xiàn)象[17]；在三陰性乳腺癌（triple-negativebreastcancer,TNBC）中，也可以檢測(cè)到由于DNMT1高表達(dá)而導(dǎo)致的DNA高甲基化，產(chǎn)生了包括抑制雌激素受體（ER）的表達(dá)、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移所需的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和促進(jìn)TNBCs中癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)等作用，目前已被認(rèn)為是TNBC腫瘤發(fā)生的原因之一[18]。因此，對(duì)DNMT1進(jìn)行抑制可能對(duì)人體產(chǎn)生一定的抗腫瘤活性。1.3DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑現(xiàn)階段研究的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可以按照其結(jié)構(gòu)特征分為兩類：一類是核苷類似物，另一類是非核苷類似物。核苷類似物屬于抗代謝抗腫瘤藥物，其結(jié)構(gòu)與胞嘧啶相似，多是在胞嘧啶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)微的結(jié)構(gòu)改造所得。它可以通過模擬胞嘧啶結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合，進(jìn)而與DNMT形成共價(jià)復(fù)合物，抑制DNA甲基化，干擾腫瘤的形成[19-25]。其中，阿糖胞苷、阿扎胞苷和地西他濱是常見的核苷類抑制劑。當(dāng)抑制劑的劑量較低時(shí)，可以激活由于DNA甲基化而失活的細(xì)胞周期蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞分化；而當(dāng)劑量較高時(shí)，則可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[26-33]。然而，核苷類似物由于低選擇性和高副作用，且大多局限于實(shí)體瘤，在抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的同時(shí)，也會(huì)影響染色體的整體穩(wěn)定性。此外，此類藥物還常見骨髓抑制、免疫抑制和惡心等副作用。非核苷類似物化學(xué)結(jié)構(gòu)較多，但大多數(shù)的選擇性和活性都較低，其來源包括：（1）源自天然產(chǎn)物，如姜黃素（curcumin）等，雖然姜黃素抗癌作用具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，但有研究表明，由于其體內(nèi)代謝過快，因此難以在生物體內(nèi)達(dá)到有效的血藥濃度，無法發(fā)揮其藥理作用，從而限制其臨床應(yīng)用[34-37]。（2）老藥新用，如普魯卡因[38-43]、普魯卡因胺及其衍生物[44-47]。在表觀遺傳學(xué)方面，普魯卡因是一種DNA脫甲基劑，它可以降低DNA上的CpG位點(diǎn)的甲基化程度，使沉默的腫瘤抑制因子重新活化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。雖然，普魯卡因可以成為癌癥治療的候選藥物，但活性并不理想。（3）甲基供體SAM的類似物：這類分子對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的選擇性較低，而且對(duì)所有使用SAM作為甲基供體進(jìn)行催化的甲基化反應(yīng)都有影響。綜上所述，目前研究得到的DNMT抑制劑都各有缺點(diǎn)，如毒副作用較大、活性較低、對(duì)酶的亞型選擇性較差且大多數(shù)同時(shí)作用于多種亞型等。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展原理和過程相當(dāng)復(fù)雜，目前仍不清楚DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的哪種亞型是發(fā)揮抗腫瘤作用的最佳治療靶標(biāo)，然而，我們可以明確的一點(diǎn)是，無論是在抗腫瘤機(jī)制研究方面還是癌癥的靶向治療方面，設(shè)計(jì)具有亞型選擇性DNMT抑制劑并對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究都具有很大的意義。1.4組蛋白乙?；c癌癥組蛋白是真核細(xì)胞染色質(zhì)中帶正電荷的蛋白質(zhì)，由于其含有大量的堿性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸，因此整體上呈堿性。由于靜電效應(yīng)，組蛋白可以與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合并纏繞在一起，它們共同構(gòu)成了染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元。組蛋白上所帶正電荷的量與組蛋白乙酰化水平密切相關(guān)，可通過調(diào)節(jié)HDAC和HAT（組蛋白乙酰酶）之間的平衡來共同調(diào)節(jié)組蛋白乙?；絒48]。當(dāng)細(xì)胞中HDAC表達(dá)的水平升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致組蛋白乙酰化水平不平衡，影響原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，致使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[49,50]。由于HDAC的過度表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，HDAC被認(rèn)為是臨床上重要的抗癌靶標(biāo)之一。抑制組蛋白去乙酰酶的活性，可以使抑癌基因的表達(dá)水平升高，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。迄今為止，已有5種HDAC抑制劑(histonedeacety‐lasesinhibitors,HDACis)獲批上市，用于治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤并取得臨床成功，即Vorinostat、Romidepsin、Belinostat、Panobi‐nostat和Chidamide，這充分證明了HDAC作為抗癌靶標(biāo)的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。因此，合成對(duì)組蛋白去乙酰酶具有抑制作用的小分子抑制劑在抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域具有重大臨床意義。1.5組蛋白去乙酰酶抑制劑組蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一個(gè)非常龐大的表觀遺傳金屬酶家族，涉及基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、分化、遷移和死亡以及血管生成。根據(jù)序列同源性，可將研究人員目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的18種HDAC分為4種類型：Ⅰ型主要包括HDAC1、2、3和8，分子量42~55kDa，主要分布于細(xì)胞核中，與酵母Rpd3同源性較高；Ⅱ類包含HDAC4-7、9和10，分子量在120~130kDa之間，可分為Ⅱa型和Ⅱb型，其中Ⅱa型包括HDAC4、5、7、9，Ⅱb型主要包括HDAC6和10，它們主要分布于細(xì)胞質(zhì)，但是仍然可以在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間來回穿梭，與酵母的hda-1序列同源性較高；Ⅲ型包括SIRT1-7，其與酵母的Sir2有相似的序列；Ⅳ型包括HDAC11，其與酵母的Rpd3及hda-1序列相似[51]。組蛋白去乙酰酶（HDAC）抑制劑是一類細(xì)胞抑制劑，通過抑制其目標(biāo)組蛋白去乙酰酶來阻斷組蛋白去乙酰酶與底物的結(jié)合，從而阻止HDAC-底物復(fù)合物的形成，進(jìn)而誘導(dǎo)組蛋白賴氨酸殘基乙酰化，從而改變腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、分化和誘導(dǎo)凋亡[52]，發(fā)揮抗腫瘤活性。HDAC抑制劑是近幾十年發(fā)展起來的一種小分子抑制劑，迄今為止，全世界已經(jīng)開發(fā)了許多HDAC抑制劑（HDACis）（見表一），其中一些已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療癌癥，但由于亞型選擇性較低和脫靶毒性大等問題，其使用仍然受到限制。表一HDAC抑制劑分類類別代表藥物結(jié)構(gòu)式異羥肟酸類伏立諾他（SAHA）帕比司他曲古抑菌素A（TSA）貝利司他短鏈脂肪酸類丙戊酸環(huán)肽類羅米地辛Apicidin苯甲酰胺類西達(dá)苯胺恩替諾特1.5.1異羥肟酸類異羥肟酸類組蛋白去乙酰酶抑制劑是通過異羥肟酸螯合HDACs催化活性中心的Zn2+，從而抑制HDACs活性的一類抑制劑。異羥肟酸類抑制劑包括曲古抑菌素A（TSA），Vorinostat（SAHA），Panabinostat等。TSA(TrichostatinA，曲古抑菌素A)是從鏈霉菌株Streptomyceshygroscopicus分離得到的一種天然抗生素，具有抗真菌和抗炎活性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，TSA還具有抑制組蛋白去乙酰酶活性，是第一個(gè)被研究人員發(fā)現(xiàn)的具有抑制HDACs活性的小分子異羥肟酸類化合物[53]。SAHA可與HDAC的催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其異羥肟酸藥效團(tuán)能夠在HDAC的催化口袋中形成鋅離子環(huán)，從而抑制其脫乙?；饔肹54]。Panobinostat是一種非選擇性HDAC抑制劑，目前已完成Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗(yàn)，可單獨(dú)使用或與其他治療方法聯(lián)合使用，用于治療如非霍奇金淋巴瘤、白血病骨髓母細(xì)胞、急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤和其他在肺和乳腺組織中發(fā)現(xiàn)的晚期實(shí)體瘤。當(dāng)與其他化合物組合使用時(shí)，Panobinostat具有干擾DNA甲基化和抑制酪氨酸激酶的作用[55,56]。此外，Panobinostat還能激活抑制細(xì)胞分裂和癌細(xì)胞生長(zhǎng)的基因。Panobinostat已重新命名為Farydak，由諾華公司生產(chǎn)，以靜脈內(nèi)給藥的方式，與Bortezomib聯(lián)合用于治療多發(fā)性骨髓瘤[57]。1.5.2短鏈脂肪酸類丙戊酸（VPA）原本作為抗癲癇藥物，廣泛用于癲癇、雙相情感障礙、精神分裂癥以及偏頭痛、抑郁癥的極端病例的臨床治療。作為HDAC抑制劑，在Ⅰ和Ⅱ期臨床試驗(yàn)中用于治療各種類型的癌癥[58]。VPA的短鏈脂肪酸結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌的治療作用，此外，還有學(xué)者將VPA與其他藥物聯(lián)合使用，用于治療淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓性白血病、HIV感染和自身免疫性淋巴組織增生綜合癥等[59,60]。1.5.3環(huán)肽類環(huán)肽類化合物是一類結(jié)構(gòu)龐大且復(fù)雜的HDAC抑制劑，代表藥物有羅米地辛和Apicidin等。目前，羅米地辛可用于T淋巴細(xì)胞瘤的治療，是唯一一個(gè)獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的環(huán)肽類HDAC抑制劑，并于2011年批準(zhǔn)用于外周T淋巴細(xì)胞瘤的治療[61]。1.5.4苯甲酰胺類在目前已有的苯甲酰胺類化合物中，它們的活性通常低于異羥肟酸類和環(huán)肽類。其中，代表藥物西達(dá)苯胺在2014年被CFDA批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)及難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療[62]。1.6雙靶點(diǎn)抑制劑研究策略在過去，單靶點(diǎn)抑制劑一直是抗腫瘤藥物的研究熱點(diǎn)，但是，單靶點(diǎn)抑制劑可能會(huì)產(chǎn)生快速耐藥性，并且即使激活了相關(guān)靶標(biāo)后仍然不能產(chǎn)生理想的治療效果。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)、飲食和遺傳密切相關(guān)，大量的腫瘤生物學(xué)研究也表明與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)是一個(gè)極其復(fù)雜、多因素、多途徑的蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此針對(duì)某一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行治療，往往不足以抑制腫瘤的進(jìn)展，需要聯(lián)合不同作用途徑和機(jī)制的藥物多靶點(diǎn)聯(lián)合阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，本論文圍繞DNMT1和HDAC兩個(gè)表觀遺傳學(xué)相關(guān)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了一種雙靶點(diǎn)抑制劑，以期能同時(shí)抑制DNMT1和HDAC，在抑制腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡方面等方面發(fā)揮治療作用。

2DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的設(shè)計(jì)與合成路線2.1DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的設(shè)計(jì)基于團(tuán)隊(duì)前期研究工作與HDAC抑制劑結(jié)構(gòu)特征，DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)見圖一。DNMT1抑制劑DC_05的藥效團(tuán)[63]可分為陽離子-π相互作用區(qū)（常為咔唑基團(tuán)）和疏水區(qū)；咔唑是抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵基團(tuán)，因此在設(shè)計(jì)DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑時(shí)保留咔唑母核，發(fā)揮抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。HDAC抑制劑的藥效團(tuán)則可分為帽子區(qū)、連接部分和Zn2+絡(luò)合部分；其中，Zn2+絡(luò)合部分多為羥肟酸結(jié)構(gòu)和鄰苯二胺結(jié)構(gòu)，該部分為活性的必需結(jié)構(gòu)，在設(shè)計(jì)DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑時(shí)保留Zn2+絡(luò)合部分，發(fā)揮抑制組蛋白去乙酰酶的作用。圖一羥肟酸類雙靶點(diǎn)抑制劑結(jié)構(gòu)2.2化學(xué)合成路線圖二DNMT1和HDAC雙靶點(diǎn)抑制劑的合成路線反應(yīng)物及反應(yīng)條件：N,N-二甲基甲酰胺（DMF），氫氧化鉀（KOH），環(huán)氧氯丙烷，室溫，12h無水乙醇，對(duì)氨基苯乙胺，二碳酸二叔丁酯，冰浴10分鐘，室溫4h戊二酸單甲酯，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），三乙胺（TEA），2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），室溫，1h二氯甲烷，三氟乙酸（TFA），飽和碳酸氫鈉（NaHCO3）溶液，室溫，10h化合物B，化合物F，無水乙醇，70℃，6h甲醇，50%羥胺溶液，60℃，反應(yīng)過夜

3實(shí)驗(yàn)部分3.1實(shí)驗(yàn)儀器表二實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家三用紫外分析儀WFH-203B上海精科實(shí)業(yè)有限公司磁力攪拌器C-MAGHS7德國(guó)IKA集團(tuán)電子天平BT125D德國(guó)賽多利斯公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀B8德國(guó)BUTCH集團(tuán)核磁共振儀BrukerAscend600MAvanceIIIHD德國(guó)Bruker公司高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀LTQOrbitrapXL美國(guó)ThermoFisherScientific公司注：BrukerAscend600MAvanceIIIHD型核磁共振儀（溶劑為CDCl3,DMSO-d6，methanol-d4四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)位移(δ)采用ppm為單位，化學(xué)位移的表示格式：位移+多重態(tài)（s=singlet,d=doublet,t=triplet,q=quartet,m=multiplet,br=broad）+耦合場(chǎng)數(shù)(Hz)+氫數(shù)）3.2實(shí)驗(yàn)試劑表三化學(xué)合成所需試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家環(huán)氧氯丙烷安耐吉化學(xué)試劑氫氧化鉀安耐吉化學(xué)試劑N,N-二甲基甲酰胺（DMF）廣州化學(xué)試劑乙酸乙酯廣州化學(xué)試劑無水硫酸鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑石油醚廣州化學(xué)試劑乙醇（超干）安耐吉化學(xué)試劑甲醇廣州化學(xué)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家三乙胺（超干）安耐吉化學(xué)試劑羥胺（50%）Accela戊二酸單甲酯上海畢得醫(yī)藥對(duì)氨基苯乙胺安耐吉化學(xué)試劑二碳酸二叔丁酯安耐吉化學(xué)試劑3.3合成實(shí)驗(yàn)3.3.1N-烷基化反應(yīng)在100mL圓底燒瓶中加入咔唑5g（29.9mmol,1.0eq），20mLN,N-二甲基甲酰胺，室溫?cái)嚢?，加入KOH2g（35.9mmol,1.2eq），攪拌40分鐘，滴加環(huán)氧氯丙烷5.5g（59.8mmol,2.0eq），反應(yīng)12小時(shí)。TLC檢測(cè)，石油醚-乙酸乙酯（10:1）展開，原料點(diǎn)消失，加水200mL對(duì)反應(yīng)進(jìn)行淬滅處理。乙酸乙酯50mL萃取，萃取動(dòng)作平行重復(fù)3次，合并3次萃取所得的乙酸乙酯層（一共約150mL），依次用飽和NaCl溶液、無水Na2SO4除水干燥，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得咔唑環(huán)氧丙烷（即固體B）用于下一步反應(yīng)。1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.16(d,J=7.7Hz,2H),7.67(d,J=8.2Hz,2H),7.47–7.44(m,2H),7.22(t,J=7.4Hz,2H),4.84–4.77(m,1H),4.44(dd,J=15.9,5.7Hz,1H),2.80–2.73(m,1H),2.62–2.56(m,1H)13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ140.79,126.18,122.55,120.64,119.48,110.11,50.77,45.16,44.64.3.3.2氨基Boc保護(hù)在1000mL圓底燒瓶中加入對(duì)氨基苯乙胺10g(73.4mmol,1.0eq)，冰浴條件下加入200mL無水乙醇，攪拌10分鐘;滴液漏斗中加入160mL無水乙醇，二碳酸二叔丁酯16g(73.4mmol,1.0eq)，混合均勻后，邊攪拌邊緩慢滴加至圓底燒瓶中。滴加完畢后撤去冰浴，反應(yīng)4小時(shí)。TLC薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，展開劑石油醚-乙酸乙酯（5:1）展開，原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，得黃色油狀液體，置于通風(fēng)櫥中冷卻，析出黃色固體D。HRMSm/zcalculatedforC12H18N2O2[M+Na]+259.1426,found236.1525.3.3.3酰胺縮合20mL樣品瓶，加入3mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），邊攪拌邊加入177mg（1.21mmol,1.0eq）戊二酸單甲酯，483mg(1.27mmol,1.05eq)2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），337μL(2.42mmol,2.0eq）三乙胺（TEA），反應(yīng)10分鐘，加入300mg(1.27mmol,1.05eq)固體D，室溫?cái)嚢?0分鐘，TLC檢測(cè)，石油醚-乙酸乙酯(2:1)展開，TLC顯示原料點(diǎn)消失，并且出現(xiàn)新的產(chǎn)物點(diǎn)。將上述體系轉(zhuǎn)移至100mL圓底燒瓶，往其中加入30mL飽和食鹽水淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯20mL萃取，萃取動(dòng)作平行重復(fù)3次，合并三次萃取所得的乙酸乙酯層（一共約60mL），依次用飽和NaCl溶液、無水Na2SO4除水干燥，減壓除去溶劑，將所得粗產(chǎn)物進(jìn)行硅膠柱層析純化分離，石油醚-乙酸乙酯（2:1）洗脫純化，得到化合物E0.57g。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.46(d,J=8.4Hz,2H),7.12(d,J=8.2Hz,2H),4.64(s,1H),3.70-3.65(m,3H),3.34(d,J=6.1Hz,2H),2.75(t,J=6.7Hz,2H),2.43(dd,J=13.6,7.0Hz,4H),2.05(dd,J=14.4,7.2Hz,2H),1.43(s,9H).13CNMR(151MHz,CDCl3)δ173.83,170.71,165.77,155.95,136.52,134.74,129.20,120.15,79.20,51.65,41.79,38.61,36.23,35.53,33.02,28.40,20.79.3.3.4氨基脫Boc保護(hù)基在50mL圓底燒瓶中加入0.57g固體E(1.94mmol,1.0eq)和10mL二氯甲烷，攪拌使其溶解，冰浴條件下邊攪拌邊滴加2.2g(19.4mmol,10.0eq)三氟乙酸(TFA)，滴加完畢后撤去冰水混合物，室溫反應(yīng)10小時(shí)，TLC薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，展開劑二氯甲烷-甲醇(20:1)展開，TLC顯示原料點(diǎn)消失，出現(xiàn)新點(diǎn)，停止反應(yīng)。減壓蒸干溶劑，得粗品。重新加入5mL二氯甲烷，超聲至溶解，用飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)體系酸堿度至呈堿性，二氯甲烷5mL萃取，萃取動(dòng)作平行重復(fù)3次，合并三次萃取所得的二氯甲烷層，依次用飽和NaCl溶液干燥有機(jī)層，無水Na2SO4除水干燥，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干二氯甲烷，得化合物F485mg，產(chǎn)率100%。1HNMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.49–7.41(m,3H),7.14(d,J=8.1Hz,2H),4.54(s,1H),3.69(s,3H),3.39–3.29(m,2H),2.76(t,J=6.6Hz,2H),2.44(dt,J=13.4,7.2Hz,4H),1.67(s,3H),1.43(s,10H).13CNMR(151MHz,Chloroform-d)δ173.86,170.43,155.89,136.25,134.97,129.32,120.11,51.72,41.77,36.38,35.56,32.92,28.41,20.81.3.3.5環(huán)氧環(huán)開環(huán)反應(yīng)50mL圓底燒瓶，加入4mL無水乙醇，174mg(0.78mmol,1.0eq)化合物B，195mg(0.78mmol,1.0eq)化合物F。70℃條件下反應(yīng)6小時(shí)，TLC檢測(cè),二氯甲烷-甲醇(10:1)展開，原料點(diǎn)變小，出現(xiàn)新的反應(yīng)點(diǎn)，終止反應(yīng)。減壓除去溶劑，所得粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離，二氯甲烷-甲醇(100:1-20:1)洗脫純化，得化合物G45mg，產(chǎn)率11.8%。3.3.6羥肟酸化合物合成取24mg固體G，溶于1mL甲醇，加入0.5mL50%羥胺溶液，加熱至60℃，反應(yīng)過夜。TLC薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，二氯甲烷-甲醇(5:1)展開，原料點(diǎn)變小，出現(xiàn)其他新點(diǎn)，停止反應(yīng)。所得反應(yīng)液直接經(jīng)PTLC薄層色譜制備純化，展開劑二氯甲烷-甲醇(10:1-5:1)洗脫純化，選取合適的條帶刮下，混合溶劑二氯甲烷：甲醇=2：1浸泡過夜，取0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，取濾液減壓旋干，得14.5mg化合物H，產(chǎn)率59.8%。1HNMR(600MHz,methanol-d4)δ8.08(d,J=7.7Hz,2H),7.92(s,1H),7.61(d,J=8.2Hz,2H),7.50(dd,J=8.2,4.6Hz,2H),7.45(t,J=7.6Hz,2H),7.21(t,J=7.4Hz,2H),7.16(d,J=8.3Hz,2H),4.50–4.42(m,3H),3.35(s,1H),3.24–3.13(m,4H),2.98–2.88(m,2H),2.47–2.40(m,2H),2.33(t,J=7.3Hz,1H),2.21(q,J=7.8Hz,2H),2.04–1.93(m,2H),1.36–1.23(m,2H).13CNMR(151MHz,methanol-d4)δ172.31,140.72,137.45,132.01,128.71,125.54,122.92,120.32,119.71,118.96,108.98,78.13,65.86,50.45,48.56,46.70,35.47,31.34,31.08,21.39.HRMSm/zcalculatedforC28H33N4O4[M+H]+489.2502,found489.2508.3.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功合成14.5mg淡黃色固體H，產(chǎn)率59.8%，經(jīng)結(jié)構(gòu)確證所合成的化合物H為N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。3.5討論在羥肟酸化合物的合成中，由于一開始反應(yīng)條件選擇不當(dāng)（反應(yīng)條件為新鮮制備的羥胺甲醇溶液室溫反應(yīng)1小時(shí)）導(dǎo)致末端甲酯未能生成羥肟酸化合物而是生成了一系列羧酸副產(chǎn)物。在開題報(bào)告中，結(jié)合先前查閱的文獻(xiàn)資料，我們計(jì)劃將羧酸化合物與鄰苯二胺進(jìn)行酰胺縮合，合成鄰苯二胺類化合物作為另一種結(jié)構(gòu)的雙靶點(diǎn)抑制劑。但是經(jīng)結(jié)構(gòu)確證后發(fā)現(xiàn)所得化合物并非目標(biāo)化合物，由于所合成的羧酸副產(chǎn)物有限且時(shí)間限制而無法優(yōu)化反應(yīng)條件后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。后來我們更換了反應(yīng)條件（反應(yīng)條件為50%羥胺60℃反應(yīng)過夜）成功合成了羥肟酸類雙靶點(diǎn)抑制劑。羥肟酸化合物的合成中，不采用硅膠柱進(jìn)行分離純化，因?yàn)榱u胺的溶解性能佳，在硅膠柱中容易擴(kuò)散和溶解，因此采用PTLC進(jìn)行制備純化，既可以有效除去羥胺，又可以提高產(chǎn)物的純度。在酰胺縮合反應(yīng)中，選擇DMF作為溶劑，可以使反應(yīng)物在其中具有良好的溶解度，但DMF在后續(xù)的處理中較難除去，因此我們可以采用往反應(yīng)體系中加入10倍量的水，再用乙酸乙酯分3次萃取，后收集有機(jī)層進(jìn)行后續(xù)操作。經(jīng)過這一步驟可使DMF、水溶性良好的HATU留在水相中，而目標(biāo)產(chǎn)物則留在乙酸乙酯層，分離目標(biāo)產(chǎn)物與其他水溶性雜質(zhì)。在酰胺縮合反應(yīng)中，當(dāng)HATU在反應(yīng)體系中濃度不均勻時(shí)，會(huì)發(fā)生以下副反應(yīng)：所以在投反應(yīng)時(shí)，一般是先將酸、堿和HATU與選擇的溶劑充分混合，待羧基充分活化后再加入胺類化合物，以避免此類副產(chǎn)物的生成并降低產(chǎn)率。

4總結(jié)和展望本實(shí)驗(yàn)成功制備出N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺（即羥肟酸類雙靶點(diǎn)抑制劑）并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，確定所合成化合物H為結(jié)構(gòu)正確的N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺。未對(duì)以上化合物展開抗腫瘤活性的研究。課題組后續(xù)將對(duì)N1-（4-（2-（（3-（9H-咔唑-9-基）-2-羥丙基）氨基）乙基）苯基）-N5-羥基戊二胺開展分子水平和細(xì)胞水平活性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果；此外還將對(duì)化合物G的羧酸化合物的酰胺反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期能與鄰苯二胺進(jìn)行酰胺縮合反應(yīng)合成結(jié)構(gòu)正確的鄰苯二胺類雙靶點(diǎn)抑制劑，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證和抗腫瘤活性的研究。

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