高液相色譜法

項目一生物產(chǎn)品分析與檢驗基礎(chǔ)生物產(chǎn)品分析與檢驗課程組任務(wù)高效液相色譜法高效液相色譜法

液相色譜法（第一部分）知識目標(biāo)了解液相色譜儀的結(jié)構(gòu)能認(rèn)識色譜圖理解氣相色譜與液相色譜的異同點。技能目標(biāo)學(xué)會液相色譜儀的調(diào)節(jié)學(xué)會液相色譜儀的使用1.了解色譜分析的相關(guān)概念2.能夠正確解釋色譜分離過程3.能夠根據(jù)組分性質(zhì)選擇合適的色譜類型知識目標(biāo)能力目標(biāo)1.能熟練進(jìn)行液相色譜儀使用前的準(zhǔn)備工作2.能正確使用液相色譜儀

液相色譜是如何完成混合物的分離？

混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同而得到分離石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱高效液相色譜法的分類液相色譜法的分離機理是基于混合物中各組分對兩相親和力的差別。根據(jù)固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應(yīng)用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質(zhì)的鍵合相色譜。根據(jù)固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。液固吸附色譜液液分配色譜鍵合相色譜離子交換色譜法凝膠色譜分離機理（分子排阻色譜法）幾種典型的色譜的分離機理液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。液固吸附色譜各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸吸附脫附再吸附再脫附

…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程。液固吸附色譜法分離機理液固吸附色譜分離機理液液分配色譜法固定相將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機鍵合層如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠固定相類型極性固定相：正相色譜以極性有機基團如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。液液分配色譜正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出液液分配色譜使用條件為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8）。太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。鍵合相色譜—固定相特點使用過程中不流失均一性和化學(xué)穩(wěn)定性好重現(xiàn)性好分離效率高適于梯度洗脫傳質(zhì)阻抗小反相色譜常見流動相流動相洗脫強度順序：水<甲醇<乙腈<乙醇<四氫呋喃<丙醇<二氯甲烷（與水不混溶）若采用含一定比例的甲醇或乙腈的水溶液作流動相，可用于分離極性化合物若采用水和無機鹽的緩沖液為流動相，則可分離一些易離解的樣品，如有機酸、有機堿、酚類等常見固定相反相色譜法最常用的固定相是C18、C8和苯基鍵合相的填料，在分離極性很大的化合物時，也可以采用氨基、氰基等極性基團鍵合固定相。鍵合相色譜—流動相疏溶劑理論：當(dāng)溶質(zhì)分子進(jìn)入極性流動相后,即占據(jù)流動相中相應(yīng)的空間，而排擠一部分溶劑分子；當(dāng)溶質(zhì)分子被流動相推動和固定相接觸時，溶質(zhì)分子的非極性部分或非極性分子）會將非極性固定相上附著的溶劑膜排擠開，直接和非極性固定相上的烷基官能團相結(jié)合（吸附）形成締合物，構(gòu)成單分子吸附層；當(dāng)流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降，會發(fā)生解締，并把溶質(zhì)分子釋放而被洗脫下來反相色譜法的分離機理1影響溶質(zhì)保留的三個主要因素：溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積溶質(zhì)和固定相接觸的總表面積愈大，保留值愈大，所以溶質(zhì)的極性愈弱，疏水性越強，保留值越大。鍵合相上的烷基總面積烷基鍵合固定相的作用在于提供非極性的作用表面。隨著碳鏈的加長，烷基的疏水特性增強，溶質(zhì)的保留值也隨烷基碳鏈長度的增加而增大。流動相的表面張力流動相的表面張力愈大，介電常數(shù)愈大，極性亦愈強；溶質(zhì)和烷基鍵合相的締合作用愈強，流動相的洗脫強度弱，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值大。反相鍵合相色譜法的分離機理2時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C181-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯例：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。分離機理實例離子交換色譜法固定相:離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基陽離子交換樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液離子交換色譜法ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－離子交換色譜法分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進(jìn)行可逆交換而分離。應(yīng)用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。分析物質(zhì)有機酸、氨基酸、多肽及核酸。

離子交換色譜法分離機理以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。小分子量的化合物可以進(jìn)入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進(jìn)入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物