二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的制備及其體外質(zhì)量評價

二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的制備及其體外質(zhì)量評價【摘要】目的：二棕櫚酰羥脯氨酸的相對分子質(zhì)量大，水溶性較差，在皮下局部給藥時幾乎無法透過角質(zhì)層，藥物利用率低，因此其在皮膚外用制劑上的應(yīng)用受到了限制[[]余楚欽,湯文靜,張碧婷等.二棕櫚酰羥基脯氨酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凝膠的制備與體外透皮研究[J].中國藥學(xué)雜志,2022,57(24):2108-2117.]。故本課題采用自微乳化法制備出DPHP納米乳，顯著提高DPHP的溶解度，為DPHP更好的應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和化妝品行業(yè)做了基礎(chǔ)性研究。方法：根據(jù)DPHP在不同油相、助表面活性劑和表面活性劑中的溶解度測定結(jié)果[[]王佰靈,郝新才,王玲芝等.白藜蘆醇納米乳制備與體外質(zhì)量評價[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2022,39(02):127-133.]，運(yùn)用Origin軟件繪制偽三元相圖篩選出DPHP納米乳的最佳處方，再通過HPLC法對其進(jìn)行方法學(xué)考察和含量測定，并對其進(jìn)行體外質(zhì)量評價。結(jié)果：DPHP納米乳最佳處方中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：DPHP：0.96%、聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：14.13%、聚甘油油酸酯：6.06%、中鏈甘油三酯：11.54%、PEG400：6.73%、純化水：61.54%。該配方下制備出的水包油型納米乳外觀澄清透明，帶有微藍(lán)色乳光，粘度低，流動性和穩(wěn)定性良好。結(jié)論：通過該實(shí)驗(yàn)制備的DPHP納米乳溶解度增大，穩(wěn)定性良好且制備工藝簡單，可用HPLC檢測。[]余楚欽,湯文靜,張碧婷等.二棕櫚酰羥基脯氨酸納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凝膠的制備與體外透皮研究[J].中國藥學(xué)雜志,2022,57(24):2108-2117.[]王佰靈,郝新才,王玲芝等.白藜蘆醇納米乳制備與體外質(zhì)量評價[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2022,39(02):127-133.【關(guān)鍵詞】二棕櫚酰羥脯氨酸；納米乳；偽三元相圖；高效液相色譜法Preparationofdipalmitoylhydroxyprolinenanoemulsionanditsinvitroqualityevaluation[Abstract]Objective:Dipalmitoylhydroxyprolinehaslargerelativemolecularmass,poorwatersolubility,almostcannotpassthroughthecuticlewhensubcutaneouslocaladministration,andthedrugutilizationrateislow,soitsapplicationintopicalskinpreparationsislimited.Therefore,thistopicusesself-microemulsion,whichsignificantlyimprovesthesolubilityofDPHPanddoesbasicresearchforthebetterapplicationofDPHPinthepharmaceuticalindustryandcosmeticsindustry.Methods:BasedonthesolubilityresultsofDPHPindifferentoilphases,surfactantsandsurfactants,thebestprescriptionofDPHPwasscreenedbyOriginsoftware,andthemethodwasinvestigatedanddeterminedbyHPLCandevaluatedinvitro.Results:ThequalityfractionofeachcomponentinthebestprescriptionofDPHPnanoemulsionwas:DPHP:0.96%,polyoxyethylenehydrogenatedcastoroil-40:14.13%,polyglyceroleate:6.06%,mediumchaintriglycerides:11.54%,PEG400:6.73%,andpurifiedwater:61.54%.Thewater-in-oilnanoemulsionpreparedunderthisformulahasaclearandtransparentappearance,withlightblueemulsion,lowviscosity,andgoodfluidityandstability.Conclusion:TheDPHPnanoemulsionpreparedbythisexperimenthasincreasedsolubility,goodstabilityandsimplepreparationprocess,whichcanbedetectedbyHPLC.[Keywords]:DipalmitoylhydroxyprolineNanoemulsionPseudoternaryphasediagramHighperformanceliquidchromatography目錄TOC\o"1-3"\h\u1.前言 前言每個人都有一顆愛美之心，崇尚美麗也是人類的天性。隨著過去幾十年中國經(jīng)濟(jì)的高速增長，群眾生活條件的日益改善、居民消費(fèi)能力也在日益提高，中國百姓更加關(guān)注生活品質(zhì)的提升，中國化妝品行業(yè)保持高速發(fā)展的態(tài)勢。在現(xiàn)代社會，人們越來越在意自己的“面子”問題，對于化妝以及皮膚保養(yǎng)的問題也越來越重視。時間一直是愛美人士的“公敵”，但生而為人，最避免不了的問題便是衰老，近年來隨著各種環(huán)境變化，越來越多的外因加速了皮膚衰老的速度，如戶外運(yùn)動時暴露于紫外輻射、寒冷、干燥等。愛美之心人皆有之，人們都希望“永葆青春”，于是，人們開始考慮抗衰除皺，加快人體的新陳代謝，從而來恢復(fù)面部的膠原蛋白。人們對化妝品的要求越來越高，更喜歡追求功能性更強(qiáng)的化妝品，如美白、抗衰老、祛斑除皺等，因此防衰老去除皺紋類化妝品受到了廣大消費(fèi)者的普遍關(guān)注[[]蔣惠亮,俞曉峰,方銀軍.1,4-二棕櫚酰羥脯氨酸的合成[J].化學(xué)世界,2008(09):546-548+552.[]蔣惠亮,俞曉峰,方銀軍.1,4-二棕櫚酰羥脯氨酸的合成[J].化學(xué)世界,2008(09):546-548+552.1.1納米乳的研究進(jìn)展1.1.1納米乳的處方組成表1納米乳的處方組成及其功能組成功能/作用代表性原料水相溶解水溶性藥物去離子水、蒸餾水、純化水、超純水油相溶解脂溶性藥物（常選擇短鏈和中長鏈的藥用一級植物油）中鏈甘油三酯、肉豆蔻酸脂、大豆油、油酸、油酸乙酯、橄欖油、蓖麻油表面活性劑降低油水界面張力，形成牢固的乳化膜，從而促進(jìn)藥物吸收，達(dá)到對難溶性藥物增溶的作用聚山梨酯、司盤20、聚氧乙烯氫化蓖麻油助表面活性劑可插入界面膜，增加界面膜的柔順性，提高膜的牢固性，增大乳化劑溶解度，降低表面張力，有利于納米乳穩(wěn)定[[][]廖艷梅,李小芳,劉羅娜,仲粒.納米乳液在中藥制劑領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].中藥與臨床,2019,10(Z1):50-56.PEG400、1,2-丙二醇、乙醇、單雙烷基酸甘油酯、甘油、聚氧乙烯脂肪酸酯1.1.2納米乳的分類表2納米乳的分類分類親水親油平衡值HLB適用于主要功能水包油型(O/W型)8-18多用于親脂性藥物增加藥物溶解度、提高制劑的載藥量油包水型(W/O型)3-8多用于水溶性藥物穩(wěn)定性高、增加藥物溶解度，具有緩釋作用雙連續(xù)型(W/O/W型或O/W/O型)3-18可用于親脂性和水溶性藥物增加藥物溶解度，提升藥物在體內(nèi)的生物利用度1.1.3納米乳的制備方法及其特點(diǎn)表3納米乳的制備方法和特點(diǎn)技術(shù)分類制備技術(shù)方法特點(diǎn)高能乳化法高壓均質(zhì)化采用高壓均質(zhì)儀生產(chǎn)納米乳，通過在高壓條件下，油相和水相可以擠出小口，又由于內(nèi)部的特殊結(jié)構(gòu)物料發(fā)生一系列變化，從而產(chǎn)生了極小的顆粒[[][]Journal|[J]UltrasonicsSonochemistryVolume52,2019.PP88-105制備的納米乳具有很好的均一性，是制備納米乳的最常用方法微流化利用剪切、撞擊和空化等作用,以產(chǎn)生亞微米范圍的非常細(xì)的液滴[[][]JiangT,LiaoW,CharcossetC.Recentadvancesinencapsulationofcurc-umininnanoemulsions:Areviewofencapsulationtechnologies,bioacc-essibilityandapplications[J].FoodResearchInternational,2020(1):132.制備的納米乳具有很好的分散型和均一性[[][]BaiL,McClementsDJ.Developmentofmicrofluidizationmethodsforefficientprodu-ctionofconcentratednanoemulsions:Comparisonofsingle-anddual-channelmicrofluidizers[J].JournalofColloidandInterfaceScience,2016(466):206-212.超聲乳化通過探頭尖端產(chǎn)生強(qiáng)烈的擊穿力，從而導(dǎo)致液滴尺寸減小。依賴高頻聲波，制備的納米乳穩(wěn)定性較高低能乳化法反相法相轉(zhuǎn)變法主要通過改變界面上表面活性劑層的曲率來制備納米乳液低溫有利于水包油納米乳，而高溫有利于油包水納米乳自發(fā)乳化自發(fā)乳化是指在分散相與連續(xù)相混合過程中產(chǎn)生的化學(xué)能的驅(qū)動下自發(fā)乳化形成乳液的過程。操作方法較為簡單溶劑蒸發(fā)法在真空加熱或減壓條件下使有機(jī)溶劑蒸發(fā)逸出，以獲得載有藥物的微球能較好保留藥物本身良好的功能組分1.1.4納米乳的特點(diǎn)表4納米乳的特點(diǎn)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)①減少藥物的副作用，降低藥物的毒性。②可以掩蓋難聞性藥物的味道③增加藥物的溶解度④提高藥物的生物利用度⑤具有靶向性以及緩釋作用⑥制備工藝簡單、操作方便⑦消耗能量少，便于工業(yè)化生產(chǎn)缺點(diǎn)①化學(xué)穩(wěn)定性較差，部分納米乳制劑在強(qiáng)光下易分解，影響療效②納米乳中許多溶劑不是食品級限制了其應(yīng)用③納米乳相行為易受溫度影響1.1.5納米乳的應(yīng)用表5納米乳的應(yīng)用應(yīng)用概念功能/作用相關(guān)研究報道納米乳凝膠納米乳凝膠劑是將載藥的納米乳液加入凝膠基質(zhì)中形成的透明、穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)膠體具有良好的透皮性和穩(wěn)定性，其黏附性和涂展性，延長藥物滯留時間，發(fā)揮緩釋長效和靶向作用彭倩等研制的積雪草苷納米乳凝膠[[][]彭倩,謝文利,陳靜怡等.積雪草苷納米乳和納米乳凝膠的透皮特性及機(jī)制研究[J].中國中藥雜志,2018,43(09):1857-1863.納米乳軟膠囊納米乳軟膠囊是將藥物做成自乳化納米乳或W/O納米乳，通過壓制法或滴制法密封于球形或橢圓形軟質(zhì)囊材中制成的膠囊劑使液體藥物固體化，便于儲存運(yùn)輸，提高了藥物制劑的穩(wěn)定性陸繼好等研制的環(huán)孢素Ａ自微乳軟膠囊[[][]陸繼好,農(nóng)偉虎.環(huán)孢素A自微乳軟膠囊的制備及質(zhì)量控制[J].藥學(xué)與臨床研究,2013,21(03):247-250.納米乳顆粒納米乳顆粒是將自乳化納米乳用惰性固體輔料吸附或制成固體分散體，成為合適的軟材，再進(jìn)行擠壓制?；蛉廴谝徊街屏３蔀轭w粒劑增加溶解度，解決口服吸收緩慢，生物利用度不高的問題李苑等研制的絞股藍(lán)總皂苷納米乳顆粒納米乳粉霧劑納米乳粉霧劑是將載藥納米乳加入適當(dāng)?shù)妮o料，經(jīng)低溫冷凍干燥或噴霧干燥使藥物微粉化，裝填于特殊的給藥裝置，以干粉形式將藥物噴霧于給藥部位，發(fā)揮全身或局部治療作用提高藥物制劑的穩(wěn)定性，與普通的氣霧劑相比，綠色、環(huán)保、無污染ZhuLifei等人研制的二甲基硅油納米乳粉霧劑1.2二棕櫚酰羥脯氨酸的理化性質(zhì)和研究現(xiàn)狀表6二棕櫚酰羥脯氨酸的理化性質(zhì)二棕櫚酰羥脯氨酸的理化性質(zhì)密度1.0±0.1g/cm3沸點(diǎn)696.6±55.0°Cat760mmHg分子式C37H69NO5分子量607.948閃點(diǎn)375.1±31.5°C精確質(zhì)量607.517578PAS83.91000LogP13.73蒸汽壓0.0±4.7mmHgat25°C折射率1.494DPHP作為一種有效的抗皺抗衰老的抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)，已有研究表明DPHP對皮膚具有多重抗衰老功效，能使膠原纖維發(fā)生收縮，刺激膠原蛋白的重排，具有良好緊膚作用，在抗衰老類化妝品中具有良好的應(yīng)用前景和開發(fā)價值。但DPHP相對分子質(zhì)量為607.95，難溶于水，在皮下局部給藥時幾乎不能透過角質(zhì)層，藥物利用率較低，限制了其在皮膚外用制劑上的應(yīng)用，且目前國內(nèi)外關(guān)于二棕櫚酰羥脯氨酸用于抗衰老產(chǎn)品的相關(guān)研究不多，暫無二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的相關(guān)報道。1.3本課題的研究意義通過該實(shí)驗(yàn)制備的二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳溶解度增大，穩(wěn)定性良好且制備工藝簡單，適用于高效液相色譜法檢測。納米乳作為新型藥物遞送系統(tǒng)，不僅可以克服傳統(tǒng)藥物遞送系統(tǒng)具有的缺點(diǎn)，而且具有較長的儲藏期，提高藥物的生物利用度以及溶解度和降低藥物毒性等優(yōu)點(diǎn)，有著良好的應(yīng)用前景[[]李艷萍,張志榮.納米乳的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(04):485-488[]李艷萍,張志榮.納米乳的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].華西藥學(xué)雜志,2010,25(04):485-4882儀器與試藥2.1儀器表7儀器的型號規(guī)格與制造公司儀器型號/規(guī)格制造公司優(yōu)普系列超純水機(jī)UPH-I-20成都超純科技有限公司高效液相色譜儀AcouityArc美國Waters公司萬分之一分析天平Sartorius賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司超聲波強(qiáng)力清洗器KQ-300DATHZ-82昆山市超聲儀器有限公司冰箱BCD-290W青島海爾股份有限公司磁力攪拌器IKABasic德國IKA公司超濾離心管2mLMerckMillipore公司針筒式濾膜0.45μm天津津騰科技有限公司納米粒度Zeta電位分析儀-美國貝克曼庫爾特科技儀器有限公司電子分析天平SQP北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司智能磁力加熱鍋ZNCL-G-C上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司高速離心機(jī)Centrifuge-5424EppendorfAG,德國數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠2.2藥品與試劑表8藥品、試劑及其生產(chǎn)公司藥品/試劑生產(chǎn)公司二棕櫚酰羥脯氨酸原料藥賽比克公司聚氧乙烯氫化蓖麻油-40德國BAS公司聚氧乙烯蓖麻油德國BASF公司吐溫20阿拉丁中鏈甘油三酯上海麥克林司盤80田徑志遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司蓖麻油上海阿拉丁化工有限公司橄欖油上海阿拉丁化工有限公司大豆油上海阿拉丁化工有限公司無水乙醇（分析純）天津市天力化學(xué)試劑有限公司1.2-丙二醇（分析純）上海阿拉丁化工有限公司甲醇（分析純）武漢市中天化工有限責(zé)任公司乙腈（色譜純）上海阿拉丁化工有限公司蘇丹紅阿拉丁甲基藍(lán)阿拉丁純化水實(shí)驗(yàn)室3實(shí)驗(yàn)方法3.1二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳分析方法的建立3.1.1色譜條件表9色譜條件色譜條件色譜柱AccucoreXLC18（250mm×4.6mm，5μm，Lithuania）流動相乙腈:磷酸水溶液=(80:20,v/v)，其中磷酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為0.05%流速1.0ml/min柱溫30℃檢測波長210nm進(jìn)樣量10μL檢測器紫外吸收光檢測器3.1.2溶液的制備及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)表10溶液的制備配制溶液操作方法對照品溶液精密稱取二棕櫚酰羥脯氨酸10.05mg置于10mL的量瓶中，加入無水乙醇，超聲20min，以使其完全溶解，放涼后加無水乙醇定容至刻度線，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，制得對照品溶液。供試品溶液精密吸取1.00mL二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳，置10mL的容量瓶中，加入無水乙醇，超聲20min,以使其完全破乳至澄清透明，放涼后加無水乙醇定容至刻度線，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，制得供試品溶液。空白納米乳溶液按照篩選所得二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳處方及制備方法，不加二棕櫚酰羥脯氨酸原料藥，制備空白納米乳。精密吸取1.00mL納米乳乳液，置10mL容量瓶中，加入無水乙醇適量，超聲20min,使其完全破乳至澄清透明，放涼后加無水乙醇定容至刻度線，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，制得空白納米乳溶液。分別取上述溶液10μL進(jìn)樣檢測，并記錄峰面積。3.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密移取對照品儲備液適量，用無水乙醇將上述貯備液分別稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度溶液(10、50、100、200、500、和1000、2000μg·mL-1)至10ml容量瓶中，再進(jìn)行進(jìn)樣測定，記錄峰面積，再進(jìn)行回歸計算，求得回歸方程。3.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一二棕櫚酰羥脯氨酸供試品溶液，于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10、12小時后進(jìn)樣10μL，記錄峰面積，并計算RSD%。3.1.5精密度實(shí)驗(yàn)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中選取中間濃度的對照品溶液，經(jīng)處理后連續(xù)6次進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，并計算精密度RSD%。3.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密吸取1.00ml二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳各6份，置10mL的容量瓶中，加入無水乙醇適量進(jìn)行稀釋，置超聲波清洗器中超聲20min,以使其完全破乳至澄清透明，再定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，并計算RSD%。3.1.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密移取對照品溶液適量，加入等量的空白納米乳，用無水乙醇定容至刻度，超聲破乳，得到低濃度（0.8mg/mL）中濃度（1.0mg/mL）高濃度（1.2mg/mL）納米乳溶液，進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，計算方法的回收率。3.2二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的處方工藝研究3.2.1油相的篩選精密稱取5mL肉豆蔻酸異丙酯、中鏈甘油三酯、大豆油、蓖麻油、橄欖油于西林瓶中，少量多次加入過量的二棕櫚酰羥脯氨酸，超聲溶解1h后，25℃置于磁力攪拌器上攪拌1h，使藥物在油相中過飽和后離心15min，精密稱取上清液1g置于10mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至10mL，混勻，在特定的色譜條件下進(jìn)樣檢測，記錄相應(yīng)的峰面積，從而測定二棕櫚酰羥脯氨酸在各油相中的溶解度并結(jié)合油相自身的性質(zhì)，篩選出合適的油相。3.2.2表面活性劑的篩選表面活性劑的選擇是獲得最優(yōu)配方的關(guān)鍵，根據(jù)表面活性劑的乳化能力篩選最佳的乳化劑體系。與陰離子型表面活性劑和陽離子型表面活性劑相比，非離子型表面活性劑的毒性和刺激性更小[[]劉建雄.微乳液法制備超細(xì)陶瓷顏料[D].華南理工大學(xué),2013.[]劉建雄.微乳液法制備超細(xì)陶瓷顏料[D].華南理工大學(xué),2013.實(shí)驗(yàn)中以備選的表面活性劑有TW-80、Span80、CC497、RH40、HS15等。故根據(jù)HLB值初步選用RH-40和CC497，HS15和CC497復(fù)配作為表面活性劑，再按照表面活性劑與油相質(zhì)量比為9∶1～1∶9制備納米乳[[]時菲菲,丁寧,周芳等.獸用口服地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其性質(zhì)考察[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,48(06):145-151.[]時菲菲,丁寧,周芳等.獸用口服地克珠利納米乳遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其性質(zhì)考察[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,48(06):145-助表面活性劑的篩選助表面活性劑主要起助乳化作用，可以提高納米乳的穩(wěn)定性并促進(jìn)其在實(shí)際中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選用無水乙醇、PEG400、丙三醇與已經(jīng)篩選出來的乳化劑（聚氧乙烯氫化蓖麻油-40和聚甘油油酸酯）混合，按照乳化劑與油相質(zhì)量比為9∶1～1∶9制備納米乳，運(yùn)用Origin2022軟件繪制偽三元相圖篩選最佳乳化劑。3.2.4Km的篩選和處方優(yōu)化根據(jù)選定的乳化劑和助乳化劑（PEG400）分別按照Km=1∶9～9∶1混合后，將混合乳化劑和油相按照質(zhì)量比為1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、2:8、9:1的比例加入中鏈甘油三酯，記錄能形成澄清透明納米乳時純化水的加入量，并計算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使用Origin2022軟件繪制偽三元相圖，以篩選出最佳Km值并確定最終處方。3.2.5二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的制備室溫下，先將二棕櫚酰羥脯氨酸溶于中鏈甘油三酯中，按處方量加入復(fù)配表面活性劑、助表面活性劑，逐滴加入純化水，使用磁力攪拌器不斷攪拌，直至形成透明或半透明帶有淡藍(lán)色乳光的納米乳的體系，即制得二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳。3.3二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的質(zhì)量評價3.3.1外觀考察將制備好的二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳黑色背景的試驗(yàn)臺上，用肉眼看納米乳的外觀形態(tài)，觀察是否出現(xiàn)分層、破乳、絮凝等現(xiàn)象。3.3.2結(jié)構(gòu)類型鑒別納米乳的結(jié)構(gòu)類型可通過染色法來鑒別：將已制備的納米乳均分成兩等份，分別在離心管中加入亞甲基藍(lán)染料（水溶性）和蘇丹紅染料（油溶性），觀察不同染料在納米乳中的擴(kuò)散速度。3.3.3粒徑和Zata電位的測定取1mL二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳用純水稀釋至10mL的離心管中，用納米粒度Zata電位分析儀測定粒徑大小、PDI和Zata電位。3.3.4粘度測定取一支入口內(nèi)徑為2.7mm，出口內(nèi)徑為1.2mm的1mL玻璃吸管，在室溫條件下，吸取二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳1mL，用計時器記錄納米乳從玻璃吸管中流出0.4ml時所使用的時間,以表示其粘度。3.3.5二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的穩(wěn)定性試驗(yàn)稀釋法精密吸取二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳100μl置于5、10、50、100ml的棕色容量瓶中，加入制備納米乳時所用的純化水，定容至刻度線，輕輕振搖，觀察是否有分層、破乳現(xiàn)象出現(xiàn)。離心法取自制二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳1ml置于2ml的離心管中，用天平配平后放入高速離心機(jī)中，在室溫條件下，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min后，觀察納米乳的外觀變化并記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。3.3.6穩(wěn)定性參數(shù)KE的考察將三組（記為A、B、C組）不同濃度的二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳，用無水乙醇稀釋一定的倍數(shù)后，按照2.1.1項下的色譜條件進(jìn)樣，測得峰面積記為A0；再分別從A、B、C三組中移取2ml,置于高速離心機(jī)中以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，離心后吸取上清液按照上述方法稀釋相同的倍數(shù)，進(jìn)樣后測得的峰面積記為A，按照穩(wěn)定性參數(shù)KE公式：KE（%）=|A0—A|/A0×100%，計算出穩(wěn)定性參數(shù)值，若KE值越小，說明二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的穩(wěn)定性越高。3.3.7含量測定取自制二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳6份，經(jīng)處理后進(jìn)樣檢測，記錄峰面積并計算二棕櫚酰羥脯氨酸的含量。3.3.8包封率的測定取DPHP納米乳稀釋液400uL,置于超管內(nèi)室，7000r/min離心20min，精密吸取外室的濾液100μL至1mL容量瓶，加入無水乙醇，超聲后定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液10μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算含量為W游離。精密吸取DPHP納米乳稀釋液100μL至1mL容量瓶中，加入無水乙醇，超聲破乳10min，靜置后用無水乙醇定容至刻度，經(jīng)0.45um微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液10μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算含量為W總。計算包封率如下:包封率%=(W總-W游離)/W總x100%4結(jié)果與分析4.1二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳分析方法的建立結(jié)果4.1.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對三者的色譜圖進(jìn)行比較，可以看出供試品溶液和對照品溶液兩者的色譜圖峰形、峰高、峰面積和保留時間等基本一致，且空白納米乳溶液在保留時間為5.8min左右時并未出現(xiàn)雜質(zhì)峰；結(jié)果表明輔料對二棕櫚酰羥脯氨酸的測定沒有干擾，此方法專屬性良好，適用于二棕櫚酰羥脯氨酸的定量分析。AABBCC圖1二棕櫚酰羥脯氨酸HPLC譜圖CCA：對照品溶液；B：供試品溶液；C：空白納米乳溶液4.1.2二棕櫚酰羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：A=1865.2C＋24128，R2為0.9995，結(jié)果表明二棕櫚酰羥脯氨酸在0.01~2.0mg/ml線性范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。二棕櫚酰羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖2。圖2二棕櫚酰羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線4.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出二棕櫚酰羥脯氨酸室溫下放置12h內(nèi),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為1.49%（RSD＜2%），實(shí)驗(yàn)證明二棕櫚酰羥脯氨酸在12h內(nèi)分解緩慢，穩(wěn)定性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表11。表11穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）時間（h）峰面積（A）濃度（μg/mL）含量（μg/g）RSD(%)019490411032.0110273.911.4921885785998.109936.2941878183994.029895.7261876151992.949884.87819051541008.4810039.67101864307986.599821.661218901301000.439959.484.1.4精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果計算得二棕櫚酰羥脯氨酸的精密度的RSD為0.60（RSD＜2%）。實(shí)驗(yàn)證明該方法的精密度良好，符合分析要求，精密度結(jié)果如下表12。表12精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）濃度（）測得平均濃度（）RSD(%)2020.02±0.060.604.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，6次重復(fù)進(jìn)樣的RSD為1.45%（RSD＜2%）。實(shí)驗(yàn)表明該方法重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表13表13穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號峰面積（A）濃度（μg/mL）含量（μg/g）RSD(%)11878183994.029895.720.8321851394979.669775.1231842880975.109698.6041871278990.329860.8351828898967.609715.8561839679973.389733.814.1.6加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低、中、高三個濃度的回收率均大于98%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值為1.86%，實(shí)驗(yàn)表明該分析方法符合方法學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表14。表14回收率測定結(jié)構(gòu)（n=3）濃度（）對照加樣濃度水平回收率（%）平均回收率（%）RSD(%)0.8低濃度101.25101.88781.86101.33101.511.0中濃度104.40104.27104.151.2高濃度100.4899.7499.864.2二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的處方工藝研究結(jié)果4.2.1油相的篩選結(jié)果觀察可見，二棕櫚酰羥脯氨酸在中鏈甘油三酯和肉豆蔻酸酯中無分層，在大豆油中有少許分層，在蓖麻油和橄欖油中有明顯分層。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二棕櫚酰羥脯氨酸在各油相中的溶解度大小依次為中鏈甘油三酯(3.27mg/ml)>肉豆蔻酸酯(3.26mg/ml)>大豆油(1.59mg/ml)＞蓖麻油(1.07mg/ml)＞橄欖油（0.99mg/mL），因此選擇溶解度大而載藥量大的中鏈甘油三酯作為處方中的油相。表15油相的篩選結(jié)果油相離心后分層情況峰面積A溶解度（mg/mL）中鏈甘油三酯無分層61233323.27肉豆蔻酸酯無分層61046803.26大豆油少許分層29897961.59蓖麻油有分層20198921.07橄欖油有分層18706760.994.2.2表面活性劑的篩選結(jié)果以聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯、聚甘油油酸酯為表面活性劑時，篩選出的合適處方有以下兩組：第一組：當(dāng)HLB=12.6，聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯：聚甘油油酸酯為8:2，混合表面活性劑:油相為8:2、7:3時，可形成具有藍(lán)乳光、澄清透明、流動性好的納米乳；第二組：當(dāng)HLB=11.4，聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯：聚甘油油酸酯為7:3，混合表面活性劑：油相為7:3、6:4時，可形成具有藍(lán)乳光、澄清透明、流動性好的納米乳;以聚氧乙烯氫化蓖麻油-40、聚甘油油酸酯為表面活性劑時，篩選出的合適處方有以下兩組：第一組：當(dāng)HLB=11，聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：聚甘油油酸酯為8:2，混合表面活性劑:油相為9:1、8:2、7:3時，可形成具有藍(lán)乳光、澄清透明、流動性好的納米乳；第二組：當(dāng)HLB=10，聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：聚甘油油酸酯為7:3，混合表面活性劑：油相為7:3、6：4時，可形成具有藍(lán)乳光、澄清透明，流動性好的納米乳;使用Origin9.0繪制三元相圖的乳區(qū)面積大小有以下排序：RH-40+CC497＞HS15+CC497＞RH-40>CC497（如下圖），因此選用RH-40和CC497復(fù)配作為表面活性劑。結(jié)果如下表：表16表面活性劑的篩選結(jié)果復(fù)配表面活性劑親水親油平衡值觀察現(xiàn)象乳化面積Area聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯：聚甘油油酸酯=8:212.6制備的納米乳澄清透明、具有淡藍(lán)色乳光，流動性好0.011聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯：聚甘油油酸酯=7:311.4制備的納米乳澄清透明、具有淡藍(lán)色乳光，流動性好0.004聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：聚甘油油酸酯=8:211制備的納米乳澄清透明、具有淡藍(lán)色乳光，流動性好0.017聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：聚甘油油酸酯=7:310制備的納米乳澄清透明、具有淡藍(lán)色乳光，流動性好0.014圖3表面活性劑的篩選結(jié)果圖4.2.3助表面活性劑的篩選結(jié)果和Km的確定以RH-40、CC497為表面活性劑，PEG400、1,2-丙二醇為助表面活性劑，且Km=3:1時，繪制的偽三元相圖乳區(qū)面積：PEG400（Area=0.02248）>1,2-丙二醇（Area=0.01555）(如下圖所示），因此經(jīng)過篩選，以RH-40、CC497為表面活性劑，PEG400為助乳化劑，確定二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的處方為：二棕櫚酰羥脯氨酸：0.96%、聚氧乙烯氫化蓖麻油-40：14.13%、聚甘油油酸酯：6.06%、中鏈甘油三酯：11.54%、PEG400：6.73%、純化水：61.54%。該處方下制備的納米乳外觀澄清透明，流動性良好。圖4助乳化劑和Km值的篩選結(jié)果4.3二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的質(zhì)量評價結(jié)果4.3.1外觀考察結(jié)果經(jīng)觀察二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳外觀澄清透明、帶有淡藍(lán)色乳光，無絮凝、分層、破乳等現(xiàn)象出現(xiàn)；圖5納米乳的外觀考察結(jié)果4.3.2結(jié)構(gòu)類型鑒定結(jié)果實(shí)驗(yàn)中可明顯觀察到甲基藍(lán)染料在二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳中迅速溶解擴(kuò)散，而蘇丹紅在二棕櫚酰羥脯氨酸中幾乎不溶解，其在甲基藍(lán)染料中的擴(kuò)散速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在蘇丹紅染料的擴(kuò)散速度[[]武敏.分蘗蔥頭總黃酮納米乳載藥系統(tǒng)經(jīng)皮靶向吸收研究[D].吉林大學(xué),2013[]武敏.分蘗蔥頭總黃酮納米乳載藥系統(tǒng)經(jīng)皮靶向吸收研究[D].吉林大學(xué),2013。圖6結(jié)構(gòu)類型測定結(jié)果4.3.3粒徑和Zata電位的測定結(jié)果實(shí)驗(yàn)測得二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的平均粒徑為18.3nm、多分散系數(shù)為0.062、Zata電位為-2.91mv，Zata電位絕對值大，較大的納米乳負(fù)電位對于提高其穩(wěn)定性是必要的。結(jié)果如圖。圖6粒徑分布圖圖7Zata電位分布圖4.3.4粘度測定結(jié)果 室溫條件下測得二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的粘度為：3.01s，符合粘度允許的范圍（＜8s）要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳的粘度小，流動性好。4.3.5納米乳的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）稀釋法納米乳在稀釋10、50、100、500、1000倍后并未出現(xiàn)分層、破乳等現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)證明了二棕櫚酰羥脯氨酸納米乳可被無限