生物可降解塑料

關(guān)于生物可降解塑料12第一節(jié)塑料廢物污染和可降解塑料二十世紀(jì)七十年代以來塑料工業(yè)得到迅猛的發(fā)展，無論是工業(yè)、農(nóng)業(yè)、建筑業(yè)，還是人們的日常生活無不與塑料密切相關(guān)。化學(xué)合成塑料在自然環(huán)境中很難分解，亦不會(huì)被腐蝕，燃燒處理又會(huì)產(chǎn)生有害氣體，塑料垃圾對(duì)環(huán)境造成了巨大的危害。第2頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天3普通塑料對(duì)環(huán)境污染的特點(diǎn)成分為合成樹脂(1)污染范圍廣(2)污染物增長(zhǎng)量快。全世界每年對(duì)塑料的需求量為1億噸。美國(guó)專家估計(jì)每10年產(chǎn)量將增加1倍。1995年我國(guó)的塑料需求量為600萬噸，其中對(duì)環(huán)境有威脅的地膜為88萬噸，包裝用品為150-200萬噸。美國(guó)、日本的塑料垃圾占垃圾總量的7%。第3頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天4普通塑料對(duì)環(huán)境污染的特點(diǎn)-續(xù)(3)處理難。塑料具有耐酸堿、抗氧化、難腐蝕、難降解的特性，埋地處理百年不爛；燃燒時(shí)產(chǎn)生大量有毒氣體，如HCl、SOx、CO等。第4頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天5普通塑料對(duì)環(huán)境污染的特點(diǎn)(4)回收利用難。塑料制品種類多，填料、顏料多樣，難以分揀回收再利用。(5)生態(tài)環(huán)境危害大。地膜降低耕地質(zhì)量，農(nóng)作物植株矮小，抗病力差。第5頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天6研究和開發(fā)生物可降解塑料已迫在眉捷用可生物降解塑料代替部分石油化工合成塑料，禁用某些塑料制品如意大利已立法規(guī)定自1991年起所有包裝用塑料都必須生物可降解，我國(guó)也已開始考慮禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。生物可降解塑料第6頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天7國(guó)內(nèi)外出現(xiàn)的生物可降解塑料PCL-聚已內(nèi)酰胺;PVA-聚乙烯醇;PE-聚乙烯第7頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天8生物可降解塑料的特點(diǎn)工藝簡(jiǎn)單生產(chǎn)過程污染輕生物可降解性和生物可相容性可進(jìn)行高分子材料的結(jié)構(gòu)調(diào)整：控制營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境條件第8頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天9第二節(jié)、PHAs的生物合成與應(yīng)用采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的聚-β-羥基烷酸(簡(jiǎn)稱PHAs)，成為應(yīng)用環(huán)境生物學(xué)方面的一個(gè)研究的熱點(diǎn)聚-β-羥基丁酸——PHB3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物——P(3HB-co-3HV)或PHBV第9頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天10PHAs除具有高分子化合物的基本特性，如質(zhì)輕、彈性、可塑性、耐磨性、抗射線等外，還具有生物可降解性和生物可相容性。PHAs香波瓶100年９個(gè)月合成塑料PHAs原料降解第10頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天11一、PHAs的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用多種微生物在一定條件下能在胞內(nèi)積累PHAs作為碳源和能源的貯存物。由于PHAs具有低溶解性和高分子量，它在胞內(nèi)的積累不會(huì)引起滲透壓的增加，是理想的胞內(nèi)貯藏物，比糖原、多聚磷酸或脂肪更加普遍地存在于微生物中。PHAs的通式可寫成：?jiǎn)误w數(shù)目第11頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天12R為甲基時(shí)，單體為β--羥基丁酸(HB)；R為乙基時(shí)，單體為β--羥基戊酸(HV)；R為丙基時(shí)，單體為β--羥基已酸(HC)；R為丁基時(shí)，單體為β--羥基庚酸(HH)；R為戊基時(shí)，單體為β--羥基辛酸(HO)；R為已基時(shí)，單體為β--羥基壬酸(HN)；R為庚基時(shí)，單體為β--羥基癸酸(HD)；R為辛基時(shí)，單體為β--羥基十一酸(HUD)；R為壬基時(shí)，單體為β--羥基十二酸(HDD)；R多為不同鏈長(zhǎng)正烷基，也可以是支鏈的、不飽和的或帶取代基的烷基第12頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天13聚合物命名R為甲基時(shí)，其聚合物為聚β--羥基丁酸(PHB)R為乙基時(shí)，其聚合物為聚β--羥基戊酸(PHV)在一定條件下兩種或兩種以上的單體還能形成共聚物，其典型代表是3HB和3HV組成的共聚物P(3HB-co-3HV)。第13頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天14每個(gè)PHAs顆粒含有數(shù)千條多聚體鏈。這些多聚物的物理化學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性能如韌度、脆性、溶點(diǎn)、玻璃態(tài)溫度和抗溶劑性等與單體的組成有極大的關(guān)系。例如PHBV共聚物中β－羥基戊酸組分的增加可使熔點(diǎn)從180℃(PHB均聚物)降至75℃(PHBV共聚物中HV組分的摩爾分?jǐn)?shù)為30~40%)。PHAs的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)HV-β--羥基戊酸第14頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天15大多數(shù)有關(guān)細(xì)菌PHAs的物化性質(zhì)的研究是針對(duì)PHB和PHBV兩種聚合物進(jìn)行的。PHB是高度結(jié)晶的晶體，結(jié)晶度的范圍在55－80%，其在物理性質(zhì)甚至分子結(jié)構(gòu)上與聚丙烯(PP)很相似，例如熔點(diǎn)、玻璃態(tài)溫度、結(jié)晶度、抗張強(qiáng)度等，而比重大、透氧率低和抗紫外線照射以及具有光學(xué)活性、阻濕性等則是PHB的優(yōu)點(diǎn)，見表7-2-1。PHAs的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)-續(xù)第15頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天16第16頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天17PHB較脆和發(fā)硬，但可通過與適量HV共聚而補(bǔ)償。隨著PHBV中HV組分的增加，聚合物的勁度降低而韌性增加，且共聚物的熔點(diǎn)隨著HV組分的增加而降低，使得較易對(duì)其進(jìn)行熱加工處理。單體4HB的聚合物或3HB與4HB的共聚物P(3HB-co-4HB)則是高彈體，且其生物降解的速度比均聚PHB或PHBV更快。PHAs的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)-續(xù)HV-β--羥基戊酸HB-β--羥基丁酸第17頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天18PHB的工業(yè)化應(yīng)用主要存在兩個(gè)缺點(diǎn)PHB較差的熔化穩(wěn)定性，其分解溫度約為200℃，該溫度與其熔點(diǎn)相近(約175℃)；可通過在發(fā)酵過程中加入3HV的前體合成PHBV共聚體或?qū)HB與其它多聚物相混合使用來解決；在環(huán)境條件下貯存數(shù)日后，PHB易發(fā)脆。PHB的老化問題可通過簡(jiǎn)單的淬火處理來較大程度地解決。第18頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天19思考題含有PHAs的微生物能通過什么染料鑒別？能利用糖蜜生產(chǎn)PHB的最有效菌株是什么？工業(yè)生產(chǎn)PHAs的微生物菌種需要考慮哪些因素？目前報(bào)道利用葡萄糖基質(zhì)生產(chǎn)PHB的最高記錄是多少？一般發(fā)酵過程分為哪兩個(gè)階段？第19頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天20PHAs的應(yīng)用shampoobottlesbicyclehelmet

第20頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天21二、PHAs的生物合成合成PHAs的主要微生物合成PHAs的主要基質(zhì)PHAs的代謝途徑與調(diào)控第21頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天22PHAs的生物合成一合成PHAs的主要微生物1PHAs的發(fā)現(xiàn)及形成機(jī)制

PHB最初由Lemoigne于1925年首先發(fā)現(xiàn)。從巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium)分離鑒定。闡明該菌形成芽孢時(shí)產(chǎn)生PHB。

20世紀(jì)50年代，發(fā)現(xiàn)PHB的生成量隨培養(yǎng)基中碳氮比的增加而增加第22頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天23

能產(chǎn)生PHAs的微生物分布極廣，包括光能和化能自養(yǎng)及異養(yǎng)菌計(jì)65個(gè)屬中的近300種微生物。目前研究的較多的微生物：產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligeneseurophus,現(xiàn)在更名為Ralstoniaeutropha)假單胞菌屬(Pseudonomas)甲基營(yíng)養(yǎng)菌(Methylotrophs)固氮菌屬(Azotobacter)紅螺菌屬(Rhodospirilum)（一）合成PHAs的主要微生物第23頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天24活性污泥中微生物產(chǎn)生的PHB第24頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天25表7-4各種微生物利用不同碳源合成PHVs的情況及水平比較

第25頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天26選擇工業(yè)生產(chǎn)PHAs的菌種考慮的因素：能利用廉價(jià)碳源的能力生長(zhǎng)速率問題多聚物合成速率在細(xì)胞內(nèi)最大量積累多聚物的能力第26頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天27英國(guó)ICI公司進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)：固氮菌：產(chǎn)生多糖，PHB的比產(chǎn)率降低，技術(shù)問題。甲基營(yíng)養(yǎng)菌：PHB產(chǎn)率中等。真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌：生長(zhǎng)快，易培養(yǎng)、胞內(nèi)PHB含量高、聚合物分子量大并能利用各種較經(jīng)濟(jì)的能源。最終選擇了——

真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌（A.eutrophus）ICI——ImperialChemicalIndustries帝國(guó)化學(xué)工業(yè)公司第27頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天28真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Ralstoniaeutropha)為革蘭氏陰性的兼性化能自養(yǎng)型細(xì)菌積累PHB可達(dá)細(xì)胞干重的90%以上能利用糖加丙酸或戊酸產(chǎn)生P(3HB-co-3HV)改變基質(zhì)該菌還能將4HB和5HV結(jié)合到3HB的結(jié)構(gòu)中去，形成4HB或5HV單體與3HB的共聚物。采用帶有真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌PHB合成基因的重組大腸桿菌(E.coli)。工業(yè)化生產(chǎn)PHAs的微生物第28頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天29帶有A.eutrophusPHB合成基因的重組E.coli成為新的選擇??！A.eutrophus重組E.coli1生長(zhǎng)快，容易培養(yǎng)（培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單）2胞內(nèi)聚合物含量高3聚合物分子量大4提取相對(duì)較困難5生產(chǎn)共聚物較容易，易調(diào)節(jié)共聚比6分子量分布控制較難7已有工業(yè)化產(chǎn)品1發(fā)酵周期短2胞內(nèi)聚合物積累量大3胞內(nèi)無聚合物降解酶，分子量大4易于提取5胞內(nèi)聚合物顆粒大、結(jié)晶度高6能利用多種碳源7在復(fù)雜培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)聚合物才能高積累。8有較成熟的高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)PHB(V)的A.eutrophus

和重組E.coli特點(diǎn)第29頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天30二合成PHAs的主要基質(zhì)1糖質(zhì)碳源2甲醇3氣體（H2、CO2、O2

）4烷烴及其衍生物第30頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天311糖質(zhì)碳源

葡萄糖A.eutrophus的變異株利用葡萄糖已用于工業(yè)生產(chǎn)PHB。Kim等人采用細(xì)胞密度培養(yǎng)的方法，50h細(xì)胞濃度達(dá)164g/L，干細(xì)胞中PHB含76％，PHB生產(chǎn)強(qiáng)度為2.42g/(L.h)是目前世界上已報(bào)道的最高記錄.第31頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天32重組E.coli

利用豐富酵母膏、蛋白胨的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，42h細(xì)胞濃度達(dá)117g/L，PHB占細(xì)胞干重76％，PHB生產(chǎn)強(qiáng)度2.11g/(L.h)降低成本，用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)35h，細(xì)胞濃度為71.4g/L，PHB干重22.8％。即在合成培養(yǎng)基上不能大量積累PHB（乙酰CoA不足）。在合成培養(yǎng)基上加有機(jī)氮源，改進(jìn)方法，細(xì)胞濃度達(dá)116g/L，PHB干重達(dá)62.2％。第32頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天33

蔗糖和糖蜜帶有穩(wěn)定高拷貝數(shù)的pSYL104質(zhì)粒的重組E.coli

能利用蔗糖生產(chǎn)PHB。在含蔗糖的合成培養(yǎng)基中采用恒定pH的分批補(bǔ)料方式培養(yǎng)48h，細(xì)胞濃度達(dá)124.6g/L,PHB濃度34.3g/L。加有機(jī)氮可以改善。利用糖蜜原料有困難：雜質(zhì)多，PHB難積累。需精制后使用。第33頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天342、甲醇甲醇是最便宜的基質(zhì)之一，ICI擁有生產(chǎn)甲醇單細(xì)胞蛋白的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，曾考慮用甲醇作基質(zhì)生產(chǎn)PHB。甲醇菌積累PHB含量不高，PHB回收成本大，獲得的PHB的分子量較小，故放棄該路線。但可以作為尋求新的菌種和開發(fā)更有效的培養(yǎng)方法的途徑。第34頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天35第35頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天363、氣體H2/CO2/O2真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌等一些爆鳴氣細(xì)菌能利用H2/CO2/O2產(chǎn)生PHB，其中H2作為能源，CO2是碳源。以H2作為基質(zhì)按其價(jià)格和產(chǎn)率而言(見表1)在經(jīng)濟(jì)上是劃算的，且H2又是一種干凈的可再生資源?？梢酝瑫r(shí)解決兩個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境污染問題：溫室效應(yīng)及廢棄的非降解塑料對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害。安全性問題：解決混合氣體爆鳴的安全問題和氣體的循環(huán)利用問題?？刂苹|(zhì)氣相中氧的濃度低于氣體爆炸的下限(6.9%)是安全的。第36頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天374、烷烴及其衍生物假單胞菌能利用中等鏈長(zhǎng)的烷烴或其衍生物醇、酸等產(chǎn)生中等鏈長(zhǎng)羥基烷酸的共聚物(PHAMCL)，共聚物中單體的組成與基質(zhì)碳架的長(zhǎng)度有關(guān)。以辛烷作基質(zhì)連續(xù)培養(yǎng)食油假單胞菌(P.oleovorans)，穩(wěn)定態(tài)細(xì)胞濃度11.6g/l，PHA的生產(chǎn)強(qiáng)度為0.58g/L·h，第37頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天38（三）PHAs的代謝途徑與調(diào)控PHAs的產(chǎn)生機(jī)理微生物在碳源過量而其他營(yíng)養(yǎng)如氮、磷、鎂或氧不足時(shí)，積累大量PHAs作為碳源和能源的貯存物，或作為胞內(nèi)還原性物質(zhì)還原能力的一種儲(chǔ)備。當(dāng)限制性營(yíng)養(yǎng)物再次被提供時(shí)，PHAs能被胞內(nèi)酶降解后作為碳源和能源利用。第38頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天39

胞中積累的PHAs存在形式以單個(gè)粒子的形態(tài)存在，每個(gè)細(xì)胞含有的顆粒數(shù)量的大小隨微生物種類而不同，在Ralstoniaeutropha中，每個(gè)細(xì)胞含有8-10個(gè)顆粒，每個(gè)顆粒直徑大小為0.2-0.5μm；以非晶體形式存在。具有高度的折光性，顆粒外面包裹著一層膜，沒有生物膜那樣的典型雙層結(jié)構(gòu)，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系統(tǒng)。第39頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天40ScanningelectronmicroscopeofPHBgranulesinRalstoniaeutropha第40頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天41補(bǔ)料分批培養(yǎng)45h收獲的菌體

細(xì)胞的電鏡照相第41頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天42PHAs的代謝途徑

不同微生物合成PHAs的途徑不同，基質(zhì)不同其合成途徑也有差異(圖7-2)。①真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌及多數(shù)細(xì)菌從糖合成PHB；②深紅紅螺菌從糖合成PHB；③食油假單孢菌等從鏈烴、醇及酸合成具有與基質(zhì)鏈長(zhǎng)有關(guān)的HA單位的PHAs；④一株產(chǎn)堿桿菌從長(zhǎng)鏈偶碳脂肪酸合成PHB；⑤銅綠假單孢菌等從糖質(zhì)碳源(如葡萄糖酸)合成具中鏈HA單位的PHAs；⑥真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌等利用糖加丙酸合成PHBV。HA-羥基烷酸第42頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天43A第43頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天44PHAs的生物合成和降解同時(shí)存在的丁酰CoA第44頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天45基因重組細(xì)菌20世紀(jì)80年代后期開始將重組DNA技術(shù)應(yīng)用于生物合成PHB，來自于多種細(xì)菌的PHA生物合成酶——PHA生物合成途徑的關(guān)鍵酶，已被在分子水平進(jìn)行了詳細(xì)的研究，PHA生物合成酶基因已被克隆成功。3個(gè)實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立地將真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16的PHB生物合成基因phbA、phbB和phbC克隆并在大腸桿菌中表達(dá)。第45頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天46基因重組細(xì)菌研究發(fā)現(xiàn)，在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中，PHA合成酶的結(jié)構(gòu)基因排列在稱為phbC-A-B的一個(gè)操縱子上，分別編碼PHA合成酶、β-酮基硫酯酶和依賴于NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶(見圖7-4)。第46頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天47三、PHAs的發(fā)酵生產(chǎn)PHAs實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要障礙是生產(chǎn)成本。英國(guó)帝國(guó)化學(xué)公司(ICI)認(rèn)為影響PHAs生產(chǎn)成本的主要因素有菌種原料操作方式提取方法第47頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天48因而降低PHAs的生產(chǎn)成本主要措施(1)采用廉價(jià)基質(zhì)(如CO2、H2和O2，甲醇，乙醇，葡萄糖及來自農(nóng)業(yè)廢物的有機(jī)酸等)和提高產(chǎn)物對(duì)基質(zhì)的產(chǎn)率系數(shù)，降低發(fā)酵原材料的成本；(2)提高生產(chǎn)強(qiáng)度(如選育高產(chǎn)菌株、采用合適的發(fā)酵生產(chǎn)方式等)，以降低操作成本；(3)改進(jìn)提取、純化技術(shù)(如不采用價(jià)格昂貴的有機(jī)溶劑、簡(jiǎn)化操作等)，以降低提取成本。第48頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天49PHAs的流加發(fā)酵選定了較適宜的菌種、基質(zhì)和提取方法后，要進(jìn)一步降低PHAs的生產(chǎn)成本，最主要的關(guān)鍵在于采取適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵方式，以獲得高的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率、高的產(chǎn)物濃度。采取適宜的發(fā)酵生產(chǎn)方式是提高聚合物的生產(chǎn)率和改進(jìn)其質(zhì)量的關(guān)鍵。第49頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天50PHAs的流加發(fā)酵

在PHAs的生產(chǎn)中，通常采用分批發(fā)酵法和流加發(fā)酵法，有時(shí)用連續(xù)培養(yǎng)法來獲得高的生產(chǎn)強(qiáng)度。由于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌只有在某種營(yíng)養(yǎng)成份氮、磷或氧等缺乏而碳源過量的不平衡生長(zhǎng)條件下才能大量積累PHAs，一般可將發(fā)酵過程分成兩個(gè)階段來進(jìn)行控制：第一階段為菌體細(xì)胞的形成階段，在此階段微生物利用基質(zhì)形成大量菌體，而多聚體PHAs的積累量很少；第二階段為多聚體形成階段，當(dāng)培養(yǎng)基中某種營(yíng)養(yǎng)耗盡時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入PHAs形成階段，在此階段PHAs大量形成而菌體細(xì)胞基本上不繁殖。第50頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天51采用流加發(fā)酵法進(jìn)行PHAs的生產(chǎn)時(shí)，可以在某些必須的營(yíng)養(yǎng)成分成為生長(zhǎng)限制性因素之前，對(duì)其進(jìn)行定量流加，延長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而可以獲得較高的菌體濃度。第51頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天52減少菌體細(xì)胞在生長(zhǎng)階段積累多聚體，也需通過流加法來控制，培養(yǎng)液中氨離子濃度不小于200mg/L，否則會(huì)降低共聚體的最終產(chǎn)率。在多聚體形成階段，限制氮源能刺激細(xì)胞積累PHAs，但氮源的完全缺乏會(huì)極大地?fù)p害微生物細(xì)胞的合成活性，所以將在PHAs合成階段以較低的速率限量流加氮源。與分批發(fā)酵中氮源完全缺乏相比，流加發(fā)酵細(xì)胞中的PHAs含量增加更快。PHAs的流加發(fā)酵第52頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天53此外，與傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，流加發(fā)酵通常具有染菌和退化的幾率小，可以獲得較高的轉(zhuǎn)化率，對(duì)發(fā)酵易實(shí)現(xiàn)優(yōu)化控制等優(yōu)點(diǎn)。第53頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天541、采用流加培養(yǎng)法生產(chǎn)PHB（1）選擇限制培養(yǎng)基中的氮源作為流加控制的手段，可以提高PHB產(chǎn)率；（2）控制碳氮比相當(dāng)重要。第54頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天552、采用流加培養(yǎng)法生產(chǎn)共聚物P(HB-CO-HV)

聚羥基烷酸（PHAs）是一類具有廣泛工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的耐熱塑料，某些共聚物PHA比均聚物PHB具有更有用的熱機(jī)械性能，如PHB較脆和發(fā)硬，而HB和HV形成的共聚物PHA比PHB的硬度降低而韌度增加。第55頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天56在共聚物P(HB-CO-HV)的生產(chǎn)過程當(dāng)中，流加發(fā)酵比分批發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢(shì)。丙酸和戊酸是生產(chǎn)共聚物P(HB-CO-HV)所必需的基質(zhì)，由于這些有機(jī)酸對(duì)菌體細(xì)胞具有一定的毒性，故采用簡(jiǎn)單的分批發(fā)酵不可能獲得高產(chǎn)，采用流加培養(yǎng)法，可以避免由于培養(yǎng)基中有機(jī)酸的積累而使細(xì)胞活力受到損害，從而達(dá)到提高P(HB-CO-HV)產(chǎn)率的目的。第56頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天57另外為了減少菌體細(xì)胞在生長(zhǎng)階段積累多聚體，也需通過流加的方法來控制培養(yǎng)液中銨離子濃度不小于200mg/L，否則會(huì)降低共聚體的產(chǎn)率。第57頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天58（三）流加培養(yǎng)條件對(duì)多聚體相對(duì)分子量的影響多聚體的相對(duì)分子量常常影響其質(zhì)量和生物降解的速度。不同用途對(duì)生物可降解多聚體的平均相對(duì)分子質(zhì)量大小要求不同，一般來說平均相對(duì)分子質(zhì)量大且相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍窄的多聚體具有更廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，并且提取也較為方便。第58頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天59

多聚體的平均相對(duì)分子量大小受流加培養(yǎng)條件的影響。當(dāng)培養(yǎng)條件恒定時(shí)，其平均相對(duì)分子量也保持相對(duì)恒定，因而只要控制適宜的流加培養(yǎng)條件，就可以將相對(duì)分子量控制在所需的范圍之內(nèi)。第59頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天60

對(duì)于共聚物P(HB-CO-HV)而言，由于大多數(shù)微生物即使在氮源和磷等因素不受限制的細(xì)胞生長(zhǎng)階段也能在胞內(nèi)積累少量的PHB，因而在加入任何能激發(fā)其形成共聚體的基質(zhì)時(shí)，菌體胞內(nèi)已含有一些均聚物PHB，因而得到的是各種HV單體含量的共聚體的混合物。第60頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天61

為了得到更均質(zhì)的共聚體，在共聚物P(HB-CO-HV)的積累階段開始時(shí)，應(yīng)先使培養(yǎng)物處于碳源饑餓狀態(tài)，這樣使細(xì)胞內(nèi)源PHB的量大大降低，得到的共聚物也就較為均一。第61頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天62另外，共聚體中HB/HV單體比例依賴于流加過程中糖/丙酸或者丁酸/戊酸的比例，且基質(zhì)流加速率應(yīng)小于其最大可能的利用速率，以避免對(duì)細(xì)胞有毒性的基質(zhì)的積累，確保產(chǎn)生的共聚物具有恒定的HB/HV比例。第62頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天63第四節(jié)PHAs的提取PHB的提取涉及到兩個(gè)方面的問題：一是方法的合理性，主要表現(xiàn)在提取率、產(chǎn)物的純度，提取過程是否對(duì)PHB的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，以及是否方便操作，預(yù)后處理是否復(fù)雜、環(huán)境是否污染等方面。二是過程的經(jīng)濟(jì)性，表現(xiàn)在提取的材料的費(fèi)用、能量的消耗和設(shè)備的投資等。第63頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天64四、PHAs的提取技術(shù)有機(jī)溶劑法次氯酸鈉提取法酶法表面活性劑-次氯酸鈉法其他方法第64頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天651.有機(jī)溶劑法對(duì)于由真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Ralstoniaeutropha)生產(chǎn)PHB，研究初期通常采用的提取方法是有機(jī)溶劑法。包括:氯仿、二氯乙烷、1,1,2—三氯乙烷、乙酸酐、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。原理：有機(jī)溶劑一方面能改變細(xì)胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHB溶解到溶劑中，而非PHB的細(xì)胞物質(zhì)(NPCM)不能溶解，從而將PHB與其它物質(zhì)分離開來。具體操作步驟如圖7-5所示。第65頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天66圖7-5有機(jī)溶劑提取PHB的過程示意圖第66頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天67(1)當(dāng)溶劑中含有超過5%(w/v)的PHB時(shí)，溶液變得很粘，要去掉細(xì)胞的殘余物就變得很困難；(2)提取率難以達(dá)到很高；(3)使用大量的有機(jī)溶劑；(4)造成嚴(yán)重環(huán)境污染，操作不便。優(yōu)點(diǎn)：引起PHB的降解非常小，得到PHB的純度非常高。因此，用有機(jī)溶劑提取PHB通常作為一種實(shí)驗(yàn)室方法。有機(jī)溶劑的方法的缺點(diǎn)第67頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天682次氯酸鈉提取法次氯酸鈉能夠破胞且對(duì)細(xì)胞中的非PHB的細(xì)胞物質(zhì)的消化很有效，因而用該方法破胞所得產(chǎn)品的純度較高、提取速度快，避免了有機(jī)溶劑提取過程中繁瑣的前、后處理工作。但是PHB分子量只有原來的一半。具體操作過程見圖2。第68頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天69圖2次氯酸鈉提取PHB過程示意圖第69頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天70次氯酸鈉提取法優(yōu)點(diǎn)：不使用大量的有機(jī)溶劑。缺點(diǎn)：次氯酸鈉對(duì)PHB分子有嚴(yán)重的降解作用，因而所獲得的PHB的分子量較小。第70頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天71次氯酸鈉/氯仿提取法

改進(jìn)：根據(jù)氯仿提取時(shí)PHB純度高且被降解程度小，而次氯酸鈉對(duì)非PHB細(xì)胞物質(zhì)消化很有效的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合PHB疏水親油物質(zhì)，而細(xì)胞膜具有親水性的特點(diǎn)的原理，發(fā)明了用分散的次氯酸鈉/氯仿提取PHB的方法。第71頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天72

冷凍干燥的菌體+次氯酸鈉+氯仿破壁離心分離氯仿相中加入非溶劑物質(zhì)使PHB沉淀離心過濾分離烘干成品第72頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天73在該方法中次氯酸鈉主要起破胞作用，而氯仿則對(duì)破胞產(chǎn)生的PHB起保護(hù)作用，因而不但可得到較高純度的PHB，而且PHB被次氯酸鈉降解的程度大大降低。同時(shí)由于破胞較完全，因而可以獲得較好的提取收率。第73頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天74優(yōu)點(diǎn)：提取率較高，得到的PHB的分子量較大。缺點(diǎn)：需要大量的有機(jī)溶劑，并且操作復(fù)雜，限制了工業(yè)化生產(chǎn)。第74頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天75三、酶法基本原理與次氯酸鈉法相似，即讓大量的NPCM溶解而PHB不溶解，從而達(dá)到分離提純的目的。但是由于NPCM通常包括核酸、類脂物、磷脂、肽聚糖以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，因此實(shí)際上是通過多種酶的多步或協(xié)同作用來達(dá)到消化NPCM的目的。第75頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天76

單獨(dú)的使用酶來消化細(xì)胞中的雜質(zhì)物質(zhì)，所得到的PHB的純度不高，往往要結(jié)合其他的方法，例如再用表面活性劑處理，才能得到較高純度的PHB。該法包括細(xì)胞的熱處理、酶處理和陰離子表面活性劑處理等步驟，因此操作十分復(fù)雜。第76頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天77

由于細(xì)胞雜質(zhì)成分比較復(fù)雜，特別是酶作用的條件比較苛刻，需要處理的步驟較多、操作較為復(fù)雜，因此酶法的應(yīng)用在提取成本、過程放大方面受到了很大的限制。第77頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天78四、表面活性劑/次氯酸鈉法

基本原理：當(dāng)表面活性劑濃度較低時(shí)，其單個(gè)分子進(jìn)入到細(xì)胞膜的磷脂雙層中；隨著表面活性劑濃度的增加，更多的表面活性劑分子結(jié)合到磷脂雙層中，細(xì)胞膜的體積就會(huì)不斷的增大；一旦磷脂雙層中的表面活性劑飽和，再增加表面活性劑就會(huì)使細(xì)胞膜收到破壞，表面活性劑與磷脂形成大量的膠團(tuán)，胞內(nèi)PHB物質(zhì)釋放出來。第78頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天79

冷凍干燥菌體表面活性劑破胞離心過濾分離次氯酸鈉洗滌離心過濾分離水洗離心過濾分離烘干產(chǎn)品第79頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天80

該方法能夠比較方便的實(shí)現(xiàn)在水相中提取PHB，這是它的突出優(yōu)點(diǎn)，但要使用大量的表面活性劑，而且次氯酸鈉的使用不可避免的造成了PHB的降解。第80頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天81五、其他方法

基因工程技術(shù)重組大腸桿菌生產(chǎn)PHB的方法，用氨水從這類細(xì)胞中提取PHB就是其中的一種方法。第81頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天82各種提取PHB的方法比較第82頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天83（一）降解機(jī)制1胞內(nèi)降解胞內(nèi)PHB的代謝是個(gè)循環(huán)過程。圖7-9中第四步到第七步是降解過程。首先(第四步)胞內(nèi)無定形PHB顆粒在解聚酶作用下降解，形成單體和二聚體的混合物。二聚體隨之在二聚體水解酶作用下形成單體。五、PHAs的生物降解

第83頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天84圖7-9PHB的代謝過程第84頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天852胞外降解

聚—羥基丁酸(PHB)的胞外降解有兩種機(jī)制，在無菌條件下通過水解進(jìn)行。這種機(jī)制對(duì)于PHB在醫(yī)療方面的應(yīng)用(如作為藥物的緩適載體、手術(shù)縫線等)特別重要。在自然環(huán)境中，是酶降解機(jī)制。許多細(xì)菌和真菌可分泌外解聚酶，有些甚至可以利用PHB作為唯一碳源生長(zhǎng)。第85頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天86（二）PHB在環(huán)境中的降解影響PHB降解速度的因素較多包括環(huán)境類型：微生物種群及活力，水份，溫度塑料制品性質(zhì)：厚度，表面組織形態(tài)，孔隙度，制品中的第二組分,如填充料、顏料在自然環(huán)境中，能降解PHB的微生物包括細(xì)菌、放線菌、和霉菌等。J.Mergaertd等在土壤中發(fā)現(xiàn)有295種微生物可降解PHB，包括105種革蘭氏陰性菌，36種革蘭氏陽(yáng)性菌，68種放線菌和86種霉菌。第86頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天87

研究表明，在一定的范圍之內(nèi)，PHB的降解速度與溫度呈正相關(guān)，其降解可以分為兩個(gè)階段。第一階段相對(duì)分子量下降；第二階段是相對(duì)分子量下降到13000后開始腐蝕。第87頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天88

環(huán)境中有許多微生物能降解PHB，但每種的數(shù)量不一定很多，活力不一定很高。當(dāng)PHB出現(xiàn)在環(huán)境中后，經(jīng)過一定的遲滯期，能降解的PHB的微生物會(huì)逐漸增多，活力升高，降解的速度增快。第88頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天89表7-10PHB在環(huán)境中的降解第89頁(yè),共99頁(yè)，2024年2月25日，星期天90通常情況下，PHB厭氧降解比有氧降解快真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌在厭氧條件下，主要代謝產(chǎn)物是乙酸和R—3—羥基丁酸，乙酰CoA轉(zhuǎn)變成乙酸的同時(shí)生成ATP。而在有氧情況下，乙酰CoA完全分解成CO2和H2O，產(chǎn)生12個(gè)ATP。與PHB相比較，有較長(zhǎng)側(cè)鏈的PHA在環(huán)境中降解速度較慢，因?yàn)榈头?/p>