植物組織培養(yǎng)的基本方法

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的基本方法目的要求1．一般掌握滅菌和消毒的區(qū)別2．掌握滅菌的方法和具體操作過程3．掌握無菌接種的步驟4．掌握外植體的選擇、培養(yǎng)方法和步驟5．一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法6．掌握試管苗馴化的基本程序7．一般掌握快速繁殖試管苗的計(jì)劃安排及增殖倍數(shù)計(jì)算方法第2頁,共37頁，2024年2月25日，星期天滅菌滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其它微生物。第3頁,共37頁，2024年2月25日，星期天滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。而通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺(tái)、等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行操作，就叫做無菌操作。第4頁,共37頁，2024年2月25日，星期天常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類。物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施?；瘜W(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。

第5頁,共37頁，2024年2月25日，星期天1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同（下表）。

容器的體積（ml）在121℃滅菌所需最少時(shí)間（min）２０～５０１５７５～１５０２０２５０～５００２５１０００３０第6頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2.用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。3.玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌干熱滅菌是利用烘箱加熱到160～180℃的溫度來殺死微生物。通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。4.不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌一些生長調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法-防細(xì)菌濾膜。第7頁,共37頁，2024年2月25日，星期天5.空間采用紫外線和熏蒸滅菌（1）紫外線滅菌在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌。細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200～300nm，其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，且要求距照射物以不超過1.2米為宜。（2）熏蒸滅菌

用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。升汞與高錳酸鉀，常用熏蒸劑是甲醛。第8頁,共37頁，2024年2月25日，星期天6.一些物體表面用藥劑噴霧滅菌物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手表面、植物材料表面等?？捎?0％的酒精反復(fù)涂擦滅菌，１％～２％的來蘇兒溶液以及0.25～１％的新潔爾滅也可以。第9頁,共37頁，2024年2月25日，星期天7.植物材料表面用消毒劑滅菌外植體的選擇:外植體部位：不同植物以及同一植物的不同器官對誘導(dǎo)條件的反應(yīng)不一樣；取材季節(jié)：大多數(shù)植物應(yīng)該在生長開始的時(shí)候采集；器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡：幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力；外植體大?。呵o尖培養(yǎng)中，外植體越小成活率越低。第10頁,共37頁，2024年2月25日，星期天外植體的滅菌方法:植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體。首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?，硬的材料用刮刀刮。第二步是對材料的表面浸潤滅菌。第三步是用滅菌劑處理。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3分鐘左右，視采用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。第11頁,共37頁，2024年2月25日，星期天常用的消毒劑：既要考慮具有良好的消毒、殺菌作用，同時(shí)又易被蒸餾水沖洗掉或分解掉；應(yīng)當(dāng)正確選擇消毒液的濃度和處理時(shí)間，應(yīng)盡量減少組織的死亡；一些表面消毒劑的消毒效果不相同。滅菌劑使用濃度持續(xù)時(shí)間(min)去除的難易效果次氯酸鈣90-100g/l5～30易很好次氯酸鈉5-20g/l5～30易很好漂白粉飽和溶液5～30易很好氯化汞0.1-10g/l2-10較難最好乙醇700-750ml/l0.2-2易好過氧化氫100-120ml/l5-15最易好溴水10-20ml/l2-10易很好抗菌素4～50mg/L30～60中較好第12頁,共37頁，2024年2月25日，星期天接種接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程。第13頁,共37頁，2024年2月25日，星期天接種前后的程序：A：接種室消毒：用酒精擦拭臺(tái)面，接種工具擺放好后用紫外燈照射表面滅菌15-20分鐘，然后通風(fēng)20分鐘；B：手要洗凈，用75%酒精擦手，在操作過程中要經(jīng)常用酒精擦手；C：將初步洗滌及切割的材料放入燒杯（燒杯用75%酒精擦杯壁），帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗．最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的４層紗布上或?yàn)V紙上。D：材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。E：用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。

第14頁,共37頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)培養(yǎng)：指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件）里，使之生長，分裂、分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。第15頁,共37頁，2024年2月25日，星期天（一）培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。該法設(shè)備簡單，易行。但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡。并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。2．液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50～100轉(zhuǎn)／分，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。靜止培養(yǎng)：濾紙橋培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)：磁力攪拌器、搖床、自旋式培養(yǎng)架第16頁,共37頁，2024年2月25日，星期天(二）培養(yǎng)步驟：1．初代培養(yǎng)：即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。第17頁,共37頁，2024年2月25日，星期天（1）頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其它如種子萌發(fā)后取枝條也可以。（2）不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽,通常首先要經(jīng)脫分化過程,形成愈傷組織的細(xì)胞。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。許多常規(guī)方法不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，如非洲菊、草莓等。（3）體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育第18頁,共37頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共37頁，2024年2月25日，星期天2．繼代培養(yǎng)：在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等,數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。第20頁,共37頁，2024年2月25日，星期天繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。第21頁,共37頁，2024年2月25日，星期天3．生根培養(yǎng)：生根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程。最后要使生出的不定根濃密而粗壯。生根可采用1/2或者1／4培養(yǎng)基，全部去掉或用低濃度的細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IAA等)。第22頁,共37頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)新梢高達(dá)3cm以上時(shí)切除基部的愈傷組織。用下列方法誘導(dǎo)生根（1）將新梢基部浸入50或100ppmIBA溶液中處理4～8小時(shí)。（2）在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6天。（3）直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根。但前二種方法對新生根的生長發(fā)育更有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。因?yàn)楫?dāng)根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。試管內(nèi)生根壯苗的階段，目的是為了成功地移植到試管外的環(huán)境中，使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境因子。不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20０℃為宜。溫度過高牽涉到蒸騰加強(qiáng)。以及菌類易滋生等問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活．春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線使基質(zhì)溫度略高于氣溫20～3０℃，這利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，有利于提前成活。光強(qiáng)應(yīng)比以前培養(yǎng)有所提高。以強(qiáng)度較高的漫射光為好，約4000Lx左右為宜，以維持光合作用所需光強(qiáng)。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，使水分平衡的矛盾更尖銳。第23頁,共37頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共37頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)物污染原因和預(yù)防措施1、污染：是指在組織培養(yǎng)過程中由于真菌、細(xì)菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)容器內(nèi)滋生大量的菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現(xiàn)象。污染物的長期存在會(huì)引起試管苗生活力下降，葉片缺綠，甚至死亡。2、原因：培養(yǎng)基及各種使用器具消毒不徹底，外植體滅菌時(shí)不徹底，操作時(shí)人為因素帶入，工作區(qū)域污染等。3、控制：器具在高溫滅菌后，在使用過程中需要不斷地在酒精燈上進(jìn)行灼燒消毒；所使用的外植體在常規(guī)的消毒后，可能還帶有一定量的菌，可以先在培養(yǎng)基上進(jìn)行幾天的預(yù)培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上，另外也可以通過在培養(yǎng)基中添加抗生素來抑菌。第25頁,共37頁，2024年2月25日，星期天初代培養(yǎng)外植體的褐變

外植體褐變是指在誘導(dǎo)脫分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以至培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體有變褐色而死亡的現(xiàn)象。原因：很多植物都含有較多的酚類化合物，其在完整的組織和細(xì)胞中與多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩(wěn)定。在細(xì)胞受到傷害時(shí)，分隔效應(yīng)被打破，酚類化合物外溢，與多酚氧化酶接觸而氧化成褐色的醌類物質(zhì)和水。醌類物質(zhì)在酶的作用下，與外植體中的蛋白質(zhì)聚合，從而使其它酶失活，組織代謝活動(dòng)紊亂，生長停滯。第26頁,共37頁，2024年2月25日，星期天影響因素1、植物種類和基因型：木本植物、單寧或色素含量高的植物易發(fā)生褐變；2、外植體的來源和生理狀況：幼齡材料一般比成齡材料褐變輕（含酚類物質(zhì)少）；同一植物冬春季取材褐變死亡率最低，其它季節(jié)不同程度增加；3、外植體的大?。盒〔牧细缀肿?，大材料切口越大，酚類氧化面越大，易褐變；消毒的化學(xué)試劑也會(huì)引起褐化；4、培養(yǎng)基：濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些花卉外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。5、培養(yǎng)條件不當(dāng)：例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。第27頁,共37頁，2024年2月25日，星期天控制褐變的措施1、外植體和培養(yǎng)材料進(jìn)行20-40天的遮光處理或暗培養(yǎng)，可減輕部分種類的褐化程度；2、在接種前用無菌水反復(fù)清洗外植體并對外植體進(jìn)行冷藏處理，洗盡切口處滲出的酚類物質(zhì)，可起到減輕褐化作用；3、控制溫度和光照，在不影響正常生長和分化的前提下，盡量降低溫度，減少光照；4、在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中加入0.5-1%左右的活性炭，用以吸附褐變產(chǎn)生的有害物質(zhì)，減輕褐變影響；5、連續(xù)轉(zhuǎn)移：對容易褐變的材料可間隔12～24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7～10天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。第28頁,共37頁，2024年2月25日，星期天繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化

定義：當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。玻璃苗的特點(diǎn)：葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔；體內(nèi)含水量高，但干物質(zhì)葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。第29頁,共37頁，2024年2月25日，星期天誘因（P40）1、激素濃度：當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；2、溫度3、濕度4、培養(yǎng)基的硬度5、光照時(shí)間6、培養(yǎng)基成分C/N第30頁,共37頁，2024年2月25日，星期天解決的方法

（1）增加瓊脂濃度，提高蔗糖含量，可增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；（2）減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；（3）增加光照；（4）增加容器通風(fēng)，降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相對濕度；（5）降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行晝夜變溫交替培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；（6）降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的含量，可以考慮加入適量脫落酸。第31頁,共37頁，2024年2月25日，星期天試管苗移栽馴化試管苗移栽是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會(huì)造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)該選擇適用合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個(gè)工作有條不紊地進(jìn)行。必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。第32頁,共37頁，2024年2月25日，星期天從葉片上看，試管苗葉片表面角質(zhì)層不發(fā)達(dá)或沒有，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛。葉片上甚至出現(xiàn)了大量的水孔，此外，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境，當(dāng)將它們移栽到正常環(huán)境中時(shí)，試管苗失水率很高，非常容易死亡。為了要改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須要經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理，通常采取的措施有：對外界要增加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。此外，對栽培馴化基質(zhì)要滅菌因?yàn)樵嚬苊缡窃跓o菌的環(huán)境中生長，對外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。為了提高成活率，可以在培養(yǎng)基質(zhì)中摻入75％的百菌清可濕性粉劑200～500倍液，以進(jìn)行滅菌處理。第33頁,