細胞增生和凋亡的分子

關(guān)于細胞增生和凋亡的分子20世紀70年代LelandHartwell提出了“細胞周期檢驗點”（cellcyclecheckpoint）概念。最先找到了用于研究真核細胞周期的合適模型——酵母細胞，通過研究他進一步提出了細胞分裂基因的概念，即cdc

(celldivisioncycle)基因。20世紀80年代TimHunt發(fā)現(xiàn)周期蛋白(cyclin)。1990年，PaulNurse發(fā)現(xiàn)周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependentkinase，CDK）。2001年10月8日美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而榮獲諾貝爾生理醫(yī)學獎。第2頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)生長因子信號轉(zhuǎn)導活化細胞周期進程是細胞增生的分子機制第二節(jié)細胞凋亡是一種自發(fā)的程序性死亡第3頁,共77頁，2024年2月25日，星期天細胞周期細胞周期:大多數(shù)真核細胞經(jīng)過一系列有序事件，使細胞體積增大，染色體復制，并且分裂成兩個各含有一套完整的染色體的子代細胞細胞周期分為四個時期：G1,S,G2,M期第4頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共77頁，2024年2月25日，星期天G1期：從有絲分裂完成到DNA復制之前這一階段，又叫復制前期。該期細胞內(nèi)各種RNA、蛋白質(zhì)合成增多。同時各種細胞群體之間細胞周期的差異取決于此期。S期：又稱為DNA的合成期或復制期。該期細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)從二倍體到四倍體。組蛋白的合成也同時進行。第6頁,共77頁，2024年2月25日，星期天G2期：指DNA合成完成到有絲分裂開始這段時間，又稱復制后期。該期DNA合成已終止，但仍然進行RNA和一定蛋白質(zhì)的合成。同時線粒體DNA在此期復制。M期：又稱為有絲分裂期。此期細胞呈球形，染色體在此期凝聚后分開，移向細胞兩端，解聚并在形成兩個完整的核，最后通過細胞質(zhì)分裂，結(jié)束M期。該期蛋白質(zhì)合成也顯著減少，細胞質(zhì)內(nèi)的多核糖體大部分解體。第7頁,共77頁，2024年2月25日，星期天G1-SCheckpoint細胞周期中的四個關(guān)卡（checkpoint）：G1晚期限制點、G1-S轉(zhuǎn)折和G2-M轉(zhuǎn)折的DNA損傷關(guān)卡、有絲分裂中期關(guān)卡IsthedamagedDNArepaired?第8頁,共77頁，2024年2月25日，星期天二、有許多蛋白質(zhì)參與調(diào)控細胞周期進程周期蛋白（Cyclin）周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）周期蛋白-周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI）RB及E2F-DP1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)Cdk磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶泛素（ubiquitin）和使蛋白質(zhì)泛素化（ubiquitination）的酶第9頁,共77頁，2024年2月25日，星期天1.細胞周期蛋白是一類含量隨著不同細胞周期升高和降低的蛋白質(zhì)，可分為A、B、D、E等。第10頁,共77頁，2024年2月25日，星期天細胞周期蛋白影響細胞內(nèi)的含量因素基因表達增加—生長因子誘導降解—泛素介導運輸—細胞核與細胞間質(zhì)間第11頁,共77頁，2024年2月25日，星期天2.細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependentkinase,Cdk）Cdk是組成型表達的核內(nèi)絲-蘇氨酸蛋白激酶第12頁,共77頁，2024年2月25日，星期天部分周期蛋白結(jié)構(gòu)分子特征周期蛋白盒介導周期蛋白與Cdk結(jié)合破壞框（Destructionbox,RXXLGXIXN）(X代表任意氨基酸)，破壞框之后為一段40個氨基酸組成的Lys富集區(qū)，破壞框主要參與由泛素介導的周期蛋白A和周期蛋白B的降解。PEST（脯、谷、絲、蘇）與G1期周期蛋白的更新有關(guān)第13頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共77頁，2024年2月25日，星期天某些CKD與周期蛋白的配對關(guān)系及執(zhí)行功能的時期第15頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3.CKI(cyclin-dependentkinaseinhibitor)抑制Cdk及周期蛋白-Cdk復合物的活性1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族有P15、P16、P18、P19等。抑制CyclinD與Cdk4/Cdk6結(jié)合，及其復合物的激酶活性。2.Cip/Kip家族Cytokine-inducibleprotein/kinaseinteractingprotein有P21、P27、P57等。是細胞接受到接觸抑制、DNA損傷、低氧及某些細胞因子等信號后的產(chǎn)物；與Cyclin-Cdk復合物結(jié)合，抑制它們的活性第16頁,共77頁，2024年2月25日，星期天1.Cdk4/Cdk6抑制因子家族2.Cip/Kip家族第17頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4.Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F-DP1的結(jié)合對G1期進展產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用Rb(retinoblastomaprotein)（視網(wǎng)膜母細胞瘤基因）RB基因產(chǎn)物是一個核內(nèi)蛋白，有兩種形式，磷酸化和去磷酸化。RB的表達和磷酸化水平與細胞周期有關(guān)第18頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共77頁，2024年2月25日，星期天5.使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也調(diào)節(jié)Cdk的活性CDK1的調(diào)節(jié)與活化;CAK=CDK1-ActivitingKinase第20頁,共77頁，2024年2月25日，星期天6.泛素-蛋白酶體介導蛋白質(zhì)降解也起調(diào)節(jié)細胞周期的作用短命蛋白通過多泛素化途徑降解，如Cyclin、P21、P27、E2F、Weel等。第21頁,共77頁，2024年2月25日，星期天參與細胞周期調(diào)控的泛素連接酶至少有兩類SCF（skp1-cullin-F-boxprotein，三個蛋白構(gòu)成的復合體）負責將泛素連接到G1/S期周期蛋白（D、E）和p21、p27、E2F、Weel上；APC(anaphasepromotingcomplex)負責將泛素連接到M期周期蛋白（A、B）上。

第22頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共77頁，2024年2月25日，星期天三，調(diào)節(jié)蛋白協(xié)同作用調(diào)控細胞周期Cdk4/6和Cdk2的活化是限制點處調(diào)控的關(guān)鍵因素Cdk1活化是G2M關(guān)卡處關(guān)鍵調(diào)控因素APC介導的多泛素化蛋白降解是細胞離開M期進入G1期的關(guān)鍵調(diào)控因素DNA損傷關(guān)卡與G1及G2期停滯相關(guān)第24頁,共77頁，2024年2月25日，星期天1.Cdk4/6和Cdk2的活化是限制點處調(diào)控的關(guān)鍵因素第25頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共77頁，2024年2月25日，星期天2.Cdk1活化是G2M關(guān)卡處關(guān)鍵調(diào)控因素第27頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3.APC介導的多泛素化蛋白降解是細胞離開M期進入G1期的關(guān)鍵調(diào)控因素后期促進因子(AnaphasePromotingComplexAPC）介導選擇性降解的靶蛋白與Ubiquitin結(jié)合(通過泛素依賴性途徑降解)。APC主要介導兩類蛋白降解:AnaphaseInhibitors和MitoticCyclin。前者維持姐妹染色單體粘連,抑制后期啟動；后者的降解意味著有絲分裂即將結(jié)束，即染色體開始去凝集，核膜重建。第29頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4.DNA損傷關(guān)卡與G1及G2期停滯相關(guān)G2期的停滯涉及一系列的磷酸化過程轉(zhuǎn)錄因子P53能使細胞停滯在G1期和G2期第31頁,共77頁，2024年2月25日，星期天G2期的停滯涉及一系列的磷酸化過程第32頁,共77頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)錄因子P53能使細胞停滯在G1期及G2期第33頁,共77頁，2024年2月25日，星期天四，生長因子等細胞外因素通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)控細胞周期細胞從G0期進入細胞周期依賴多種生長因子的協(xié)同促進作用第34頁,共77頁，2024年2月25日，星期天G1期的細胞也需要生長因子促進細胞周期的進程第35頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)細胞凋亡是一種自發(fā)的程序化細胞死亡細胞凋亡機制涉及胱天蛋白酶的級聯(lián)活化死亡受體途徑及線粒體途徑是兩種主要的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑第36頁,共77頁，2024年2月25日，星期天細胞死亡分為兩大類：1、由各種突發(fā)的，意外的事件所致的細胞死亡(病理性死亡)，形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞壞死(necrosis)。2、程序性細胞死亡，形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞凋亡(apoptosis)。凋亡是多細胞生物發(fā)育及成體中維持體內(nèi)平衡的一種正常事件第37頁,共77頁，2024年2月25日，星期天例如蝌蚪尾的消失脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育發(fā)育過程中手和足的成形過程第38頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共77頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡與細胞壞死的區(qū)別—————————————————————————————————————————————————————————壞死凋亡1.性質(zhì)2.誘導因素強烈刺激，隨機發(fā)生較弱刺激，非隨機發(fā)生3.生化特點4.形態(tài)變化6.DNA電泳5.炎癥反應7.凋亡小體8.基因調(diào)控被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成，耗能細胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細胞腫脹胞膜及細胞器相對完整細胞皺縮，核固縮彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀DNA片段化(180-200bp)，電泳呈“梯”狀條帶溶酶體破裂，局部炎癥反應溶酶體相對完整，局部無炎癥反應有病理性，非特異性生理性或病理性，特異性無有無第40頁,共77頁，2024年2月25日，星期天壞死凋亡第41頁,共77頁，2024年2月25日，星期天確保胚胎發(fā)生、器官發(fā)育，調(diào)節(jié)細胞群體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮積極的防御功能凋亡的生理意義凋亡的病理意義器官功能障礙凋亡的意義惡性腫瘤發(fā)生第42頁,共77頁，2024年2月25日，星期天二，凋亡途徑是由誘導產(chǎn)生的胱天蛋白酶級聯(lián)反應凋亡途徑最早在線蟲中被闡明秀麗隱桿線蟲（CaenorbabditisElegans)第43頁,共77頁，2024年2月25日，星期天麻省理工學院的RobertHorvitz領(lǐng)導的研究小組采用體細胞突變的方法發(fā)現(xiàn)共有14個基因在C.elegans細胞凋亡中起作用第44頁,共77頁，2024年2月25日，星期天TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine2002"fortheirdiscoveriesconcerning'geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath'"SydneyBrenner

H.RobertHorvitz

JohnE.Sulston

TheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USATheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdom第45頁,共77頁，2024年2月25日，星期天Duringdevelopment,1090cellsaregenerated,butprecisely131ofthesecellsareeliminatedbyprogrammedcelldeath.Thisresultsinanadultnematode(thehermaphrodite),composedof959somaticcells.第46頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共77頁，2024年2月25日，星期天2.哺乳動物細胞凋亡途徑與線蟲凋亡途徑相似但更為復雜Ced3---胱天蛋白酶（cysteinylaspartate-specificprotease,caspase）Ced4---凋亡蛋白酶活化因子1（apoptoticprotease-activatingfactor1,Apaf1）Ced9和Egl-1---Bcl-2家族第48頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3.哺乳動物中Caspase家族成員有相似的結(jié)構(gòu)與活化過程第49頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共77頁，2024年2月25日，星期天4.哺乳動物的Bcl-2家族是凋亡調(diào)節(jié)蛋白第51頁,共77頁，2024年2月25日，星期天二，死亡受體途徑及線粒體途徑是兩種主要的凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑第52頁,共77頁，2024年2月25日，星期天1.死亡受體途徑死亡受體：Fas、TNFR1、TNFR2、DR3、DR4、DR5、DcR1和DcR2等一類通過與相應配體結(jié)合，傳遞細胞凋亡信號的跨胞膜蛋白。通路：第53頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共77頁，2024年2月25日，星期天TNF受體途徑1、TNF和TNF受體TNF(tumornecrosisfactor)：稱為腫瘤壞死因子，是一種具有多種生物學效應的細胞因子，主要由激活的單核巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生。TNF受體：目前發(fā)現(xiàn)的有TNFR1和TNFR2。兩種都為跨膜蛋白。TNFR1能引起細胞凋亡，而TNFR2卻不能引起細胞凋亡。第55頁,共77頁，2024年2月25日，星期天2、TNF受體途徑的作用：促進細胞生長、分化、凋亡和誘發(fā)炎癥。3、TNF受體途徑:1）TNF－α與TNFR1胞外區(qū)結(jié)合，使TNFR1形成三聚體。（一個TNF－α與三個TNFR1分子結(jié)合）2）三聚體TNFR1通過其聚集的胞內(nèi)區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募下游信號傳導蛋白（TRADD、FADD、TRAF2、RIP）。3）下游信號傳導蛋白形成復合體，激活下游的caspase8以及各種效應分子caspases，產(chǎn)生級聯(lián)激活反應，最終引起靶細胞凋亡。4）TNF還可通過下游激活蛋白RIP，TRAF2等，分別激活NIK和MEKK，從而激活NF－KB和c－Jun，抑制細胞凋亡。第56頁,共77頁，2024年2月25日，星期天TNF受體途徑第57頁,共77頁，2024年2月25日，星期天2.內(nèi)源性線粒體途徑第58頁,共77頁，2024年2月25日，星期天3.細胞凋亡的檢測方法.一、細胞凋亡的形態(tài)學檢測.二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、線粒體膜勢能（

mt）的檢測四、DNA片斷化檢測

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的檢測

七、WB檢測第59頁,共77頁，2024年2月25日，星期天

細胞凋亡的形態(tài)學檢測

1光學顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月狀附在核膜周圍。2熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學改變來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。3電子顯微鏡觀察第60頁,共77頁，2024年2月25日，星期天NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm

400）第61頁,共77頁，2024年2月25日，星期天電鏡觀察凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。第62頁,共77頁，2024年2月25日，星期天磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，在凋亡早期，PS可從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35

36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、R-PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。第63頁,共77頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共77頁，2024年2月25日，星期天