液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用

關(guān)于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的原理及應(yīng)用簡介

色譜質(zhì)譜的在線聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來，實現(xiàn)對復雜混合物更準確的定量和定性分析。而且也簡化了樣品的前處理過程，使樣品分析更簡便。色譜質(zhì)譜聯(lián)用包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用互為補充，分析不同性質(zhì)的化合物。

第2頁,共122頁，2024年2月25日，星期天液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:

氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。

液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發(fā)性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。

第3頁,共122頁，2024年2月25日，星期天Neutral101102103104105MolecularWeightIonicAnalytePolarityIonSprayAPCIGC/MS第4頁,共122頁，2024年2月25日，星期天現(xiàn)代有機和生物質(zhì)譜進展

在20世紀80及90年代，質(zhì)譜法經(jīng)歷了兩次飛躍。在此之前，質(zhì)譜法通常只能測定分子量500Da以下的小分子化合物。20世紀70年代，出現(xiàn)了場解吸（FD）離子化技術(shù)，能夠測定分子量高達1500~2000Da的非揮發(fā)性化合物，但重復性差。20世紀80年代初發(fā)明了快原子質(zhì)譜法（FAB-MS），能夠分析分子量達數(shù)千的多肽。隨著生命科學的發(fā)展，欲分析的樣品更加復雜，分子量范圍也更大，因此，電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）應(yīng)運而生。第5頁,共122頁，2024年2月25日，星期天目前的有機質(zhì)譜和生物質(zhì)譜儀，除了GC-MS的EI和CI源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學電離APCI、大氣壓光電離APPI）與基質(zhì)輔助激光解吸電離。前者常采用四極桿或離子阱質(zhì)量分析器，統(tǒng)稱API-MS。后者常用飛行時間作為質(zhì)量分析器，所構(gòu)成的儀器稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特點是可以和液相色譜、毛細管電泳等分離手段聯(lián)用，擴展了應(yīng)用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫(yī)學、環(huán)境分析、食品檢驗、組合化學、有機化學的應(yīng)用等；MALDI-TOF-MS的特點是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。第6頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜原理簡介：

質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標，離子質(zhì)荷比為橫坐標所作的條狀圖就是我們常見的質(zhì)譜圖。

第7頁,共122頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共122頁，2024年2月25日，星期天常見術(shù)語:質(zhì)荷比:

離子質(zhì)量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.峰:

質(zhì)譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:

檢測器檢測到的離子信號強度.基峰:

在質(zhì)譜圖中，指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)強度最大的離子峰稱作基峰.總離子流圖；質(zhì)量色譜圖；準分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子第9頁,共122頁，2024年2月25日，星期天總離子流圖:在選定的質(zhì)量范圍內(nèi)，所有離子強度的總和對時間或掃描次數(shù)所作的圖,也稱TIC圖.第10頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量色譜圖指定某一質(zhì)量(或質(zhì)荷比)的離子其強度對時間所作的圖.利用質(zhì)量色譜圖來確定特征離子，在復雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據(jù)得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數(shù)值，觀察提取離子的質(zhì)量色譜圖，檢驗直接進樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進行MRM等其他掃描方式的測定時可作為參考。第11頁,共122頁，2024年2月25日，星期天1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質(zhì)量色譜圖總離子流圖第12頁,共122頁，2024年2月25日，星期天準分子離子:指與分子存在簡單關(guān)系的離子，通過它可以確定分子量.液質(zhì)中最常見的準分子離子峰是[M+H]+或[M-H]-.在ESI中,往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18......稱準分子離子,表示為:[M+H]+,[M+Na]+等第13頁,共122頁，2024年2月25日，星期天碎片離子：準分子離子經(jīng)過一級或多級裂解生成的產(chǎn)物離子.碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān),數(shù)目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。第14頁,共122頁，2024年2月25日，星期天Ephedrine,MW=165第15頁,共122頁，2024年2月25日，星期天多電荷離子：

指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質(zhì)或多肽等離子.有機質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.采用電噴霧的離子化技術(shù),

可產(chǎn)生帶很多電荷的離子,最后經(jīng)計算機自動換算成單質(zhì)/荷比離子。第16頁,共122頁，2024年2月25日，星期天同位素離子由元素的重同位素構(gòu)成的離子稱為同位素離子.各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,還可利用穩(wěn)定同位素合成標記化合物,如:氘等標記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等第17頁,共122頁，2024年2月25日，星期天如何看質(zhì)譜圖：(1)確定分子離子,即確定分子量氮規(guī)則：含偶數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù)，含奇數(shù)個氮原子的分子，其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差，凡質(zhì)量差在3~8和10~13，21~25之間均不可能，則說明是碎片或雜質(zhì)。第18頁,共122頁，2024年2月25日，星期天(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學式高分辨質(zhì)譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式低分辨質(zhì)譜利用元素的同位素豐度，例:第19頁,共122頁，2024年2月25日，星期天(3)峰強度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。第20頁,共122頁，2024年2月25日，星期天不同類型有機物有不同的裂解方式相同類型有機物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異需要經(jīng)驗記憶。第21頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜解析的一般步驟(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)是高分辨質(zhì)譜圖得到元素組成更好)(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當(2)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質(zhì)，樣品來源，光譜，波譜數(shù)據(jù)等.第22頁,共122頁，2024年2月25日，星期天(3)盡可能判斷出分子離子。(4)假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬：高質(zhì)量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假設(shè)一個分子結(jié)構(gòu)，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質(zhì)譜進行對比。第23頁,共122頁，2024年2月25日，星期天有機質(zhì)譜的特點優(yōu)點:(1)定分子量準確，其它技術(shù)無法比。(2)靈敏度高，常規(guī)10-7—10-8g,單離子檢測可達10-12g。(3)快速，幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效,其它技術(shù)無法勝任。(5)多功能，廣泛適用于各類化合物。第24頁,共122頁，2024年2月25日，星期天局限性:

(1)異構(gòu)體，立體化學方面區(qū)分能力差。(2)重復性稍差，要嚴格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。(3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng)，污染等問題。(4)價格稍顯昂貴，操作有點復雜。第25頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)譜儀器：

質(zhì)譜儀由以下幾部分組成

數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓進樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器檢測接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系統(tǒng)

第26頁,共122頁，2024年2月25日，星期天真空系統(tǒng)

質(zhì)譜儀的離子源、質(zhì)量分析器和檢測器必須在高真空狀態(tài)下工作，以減少本底的干擾，避免發(fā)生不必要的離子-分子反應(yīng)。所以質(zhì)譜反應(yīng)屬于單分子分解反應(yīng)。利用這個特點，我們用液質(zhì)聯(lián)用的軟電離方式可以得到化合物的準分子離子，從而得到分子量。由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。第27頁,共122頁，2024年2月25日，星期天進樣系統(tǒng)把分析樣品導入離子源的裝置，包括：直接進樣，GC，LC及接口，加熱進樣，參考物進樣等。第28頁,共122頁，2024年2月25日，星期天離子源使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進行加速使其進入分析器，根據(jù)離子化方式的不同，有機質(zhì)譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。第29頁,共122頁，2024年2月25日，星期天EI(ElectronImpactIonization):電子轟擊電離—硬電離。CI(ChemicalIonization):化學電離—核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移。FD(FieldDesorption):場解吸—目前基本被FAB取代。FAB(FastAtomBombardment):快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜)。

ESI(ElectrosprayIonization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質(zhì)分子多肽等)

APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大氣壓化學電離—同上，更適宜做弱極性小分子。APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。

MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合蛋白質(zhì)，多肽等大分子．第30頁,共122頁，2024年2月25日，星期天其中ESI，APCI，APPI統(tǒng)稱大氣壓電離(API)第31頁,共122頁，2024年2月25日，星期天實驗室現(xiàn)有的離子源:ESI電噴霧電離源APCI大氣壓化學電離源第32頁,共122頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共122頁，2024年2月25日，星期天電噴霧（ESI）的特點

通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子，由于質(zhì)譜儀測定質(zhì)/荷比，因此質(zhì)量范圍只有幾千質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜儀可測定質(zhì)量數(shù)十幾萬的生物大分子。電噴霧電離是最軟的電離技術(shù)，通常只產(chǎn)生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩(wěn)定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂（源內(nèi)CID）測定化合物結(jié)構(gòu)。第34頁,共122頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共122頁，2024年2月25日，星期天大氣壓化學電離（APCI）特點

大氣壓化學電離也是軟電離技術(shù)，只產(chǎn)生單電荷峰，適合測定質(zhì)量數(shù)小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應(yīng)高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相；通過調(diào)節(jié)離子源電壓控制離子的碎裂。第36頁,共122頁，2024年2月25日，星期天電噴霧與大氣壓化學電離的比較

電離機理：電噴霧采用離子蒸發(fā)，而APCI電離是高壓放電發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。樣品流速：APCI源可從0.2到2ml／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1ml／min.斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解.靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子第37頁,共122頁，2024年2月25日，星期天NanoSpray離子源專門設(shè)計的NanoSpray離子源特別適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從5nL／min到luL／min。一滴樣品就可做數(shù)小時的分析?？稍谧钚〉臉悠废牧肯芦@得最大靈敏度。靈敏度可高達fmole。并可直接與微孔HPLC聯(lián)用。第38頁,共122頁，2024年2月25日，星期天正負離子模式:一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負離子測定模式可供選擇。根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇，也可兩種模式同時進行第39頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量分析器:是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。第40頁,共122頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)量分析器的分類：雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector).四極質(zhì)譜儀(Q).飛行時間質(zhì)譜儀(TOF).離子阱質(zhì)譜儀（TRAP）付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS).┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質(zhì)譜儀┫三重四極（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF第41頁,共122頁，2024年2月25日，星期天進行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類第一類儀器利用質(zhì)譜在空間中的順序，是由兩臺質(zhì)譜儀串聯(lián)組裝而成。即前面列出的串列式多級質(zhì)譜儀。第二類利用了一個質(zhì)譜儀時間順序上的離子儲存能力，由具有存儲離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質(zhì)譜儀。但不能進行母離子掃描或中性丟失。第42頁,共122頁，2024年2月25日，星期天第43頁,共122頁，2024年2月25日，星期天實驗室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類型：串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS)

：

三重四極（QqQ）離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1MS2Q1q2Q3第44頁,共122頁，2024年2月25日，星期天QqQ儀器可以方便的改變離子的動能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺式進入常規(guī)實驗室，缺點是質(zhì)量范圍及分辨率有限，不能進行高分辨測定，只能做到單位質(zhì)量分辨。（通過高分辨能得到化合物的分子式）第45頁,共122頁，2024年2月25日，星期天在液質(zhì)聯(lián)機中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個能量足以使得處在能量亞穩(wěn)態(tài)分子中的某些化學鍵斷裂并使一些特定的分子發(fā)生結(jié)構(gòu)重排。第46頁,共122頁，2024年2月25日，星期天碰撞誘導解離CID質(zhì)譜：選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(碰撞氣體：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，發(fā)生離子—分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生‘子離子’，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜，一般稱做CID(collision-induceddissociation)譜第47頁,共122頁，2024年2月25日，星期天影響CID質(zhì)譜的因素：較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜，尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進行人工解析或自己建庫。第48頁,共122頁，2024年2月25日，星期天大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子，其主要的碎片應(yīng)由化學鍵的誘導斷裂和重排反應(yīng)來產(chǎn)生，所以在EI質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋。第49頁,共122頁，2024年2月25日，星期天檢測接收器：接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板第50頁,共122頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)及供電系統(tǒng)將接收來的電信號放大、處理并給出分析結(jié)果及控制質(zhì)譜儀個部分工作。從幾伏低壓到幾千伏高壓。第51頁,共122頁，2024年2月25日，星期天LC-MS分析條件的選擇和優(yōu)化1.接口的選擇：

ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預先形成離子的化合物和可以獲得多個質(zhì)子的大分子（如蛋白質(zhì)）

APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優(yōu)勢在于弱極性或中等極性的小分子的分析。第52頁,共122頁，2024年2月25日，星期天2.正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優(yōu)先考慮使用正離子模式。負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。第53頁,共122頁，2024年2月25日，星期天3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。LC／MS接口避免進入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。第54頁,共122頁，2024年2月25日，星期天4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應(yīng)用4.6mm內(nèi)徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內(nèi)徑的微柱，TIS源最高允許lml／min，建議使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時間。第55頁,共122頁，2024年2月25日，星期天5.輔助氣體流量和溫度的選擇

霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質(zhì)譜的產(chǎn)生。操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃

左右即可。對熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c的。第56頁,共122頁，2024年2月25日，星期天樣品的預處理：為什么要進行樣品的預處理：從保護儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結(jié)果的干擾。要求獲得最佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。第57頁,共122頁，2024年2月25日，星期天樣品的預處理常用方法a）超濾b）溶劑萃取／去鹽c）固相萃取d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽e）色譜分離反相色譜分離親和技術(shù)分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化第58頁,共122頁，2024年2月25日，星期天化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。

子離子分析（MS/MS）

子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。第59頁,共122頁，2024年2月25日，星期天用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息正離子方式常出現(xiàn)如下離子:-Na22Da.higherthanM+H-K38Da.higherthanM+H-Li6Da.higherthanM+H-NH417Da.higherthanM+H-ACN40Da.higherthanM+H2M+H,2M+Na等負離子方式常出現(xiàn)如下離子:-TFA114Da.higherthenM-H(113and227background)-Acetate60Da.higherthenM-H-Formic46Da.higherthenM-H-Cl36Da.higherthanM-H第60頁,共122頁，2024年2月25日，星期天影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。2）氣流和溫度：當水含量高及流量大時要相應(yīng)增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當高可以提高出峰的靈敏度。4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負離子乙腈好些5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì)8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質(zhì)太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮第61頁,共122頁，2024年2月25日，星期天分子量測定中的誤判

溶劑中的雜質(zhì)來自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰進樣系統(tǒng)污染樣品在源內(nèi)碎裂，形成碎片離子第62頁,共122頁，2024年2月25日，星期天LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子，[(H2O)nH+

，n=3-112]m/z102,H+乙腈

+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z279,管路中鄰苯二甲酸二丁酯

C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm離心管的產(chǎn)生的特征離子m/z384,瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子m/z391,管路中鄰苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z413,鄰苯二甲酸二辛酯+鈉,C24H38O4Na+,413.2668m/z538,乙酸+氧

+鐵（噴霧管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.8793

第63頁,共122頁，2024年2月25日，星期天分子量測定失敗的原因

a）流動相不合適b）不揮發(fā)性鹽的影響c）成分復雜，雜質(zhì)太多d)樣品濃度不夠e）pH值不合適f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂第64頁,共122頁，2024年2月25日，星期天目標化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測（SIM）

SIM用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子.第65頁,共122頁，2024年2月25日，星期天目標化合物分析（1）選擇離子監(jiān)測（SIM）

SIM用于檢測已知或目標化合物，比全掃描方式能得到更高的靈敏度。這種數(shù)據(jù)采集的方式一般用在定量目標化合物之前，而且往往需要已知化合物的性質(zhì)。若幾種目標化合物用同樣的數(shù)據(jù)采集方式監(jiān)測，那么可以同時測定幾種離子.第66頁,共122頁，2024年2月25日，星期天（3）母離子掃描母離子分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，盡管它們的母離子的質(zhì)量可以不同，但在分裂過程中會生成共同的子離子，這種掃描功能在藥物代謝研究中十分重要。

第67頁,共122頁，2024年2月25日，星期天(4)中性丟失掃描

中性丟失掃描分析可用來鑒定和確認類型已知的化合物，例如新生兒遺傳疾病篩查中某些檢測項目。也可以幫助進行未知物結(jié)構(gòu)判斷，例如有中性丟失18Da的意味著-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。第68頁,共122頁，2024年2月25日，星期天各種掃描方式的原理解釋：Q1FullScan(Start–Stop)(Q1全掃描)Q1alwaysusedassingleMSanalyzerUsedprimarilyforident.ofprecursorion第69頁,共122頁，2024年2月25日，星期天SIM-SelectedIonMonitoring(選擇離子監(jiān)測)UsedtooptimizeanalyzerforspecificionsSIMusedforquantitativeanalysesQ1SIMusedto“optimize”precursorionMaximizesignalinpreparationforMS/MS第70頁,共122頁，2024年2月25日，星期天ProductIonScan(子離子掃描)Afteridentification,theprecursorionissentintothecollisioncellandfragmentedbyCIDQ1isfixed,Q3sweepsagivenmassrangeUsedforstructuralelucidationFirststeptodevelopingquantitativemethodm3+scannedm1+fixed第71頁,共122頁，2024年2月25日，星期天ExampleofProductIonSpectrumEphedrine,MW=165第72頁,共122頁，2024年2月25日，星期天PrecursorIonScan(母離子掃描)Q1sweepsagivenmassrange,Q3isfixedUsedtodeterminethe“origin”ofparticularproduction(s)createdinthecollisioncellFrequentlyusedfordrugmetaboliteidentification(commonproductionobservedinthemetabolites)m3+fixedm1+scanned第73頁,共122頁，2024年2月25日，星期天ExampleofPrecursorIonSpectrum600900120015001800m/z,amu587.5745.6895.6802.4633.4520.31105.01704.4600900120015001800m/z,amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity,cps608.3520.3802.4600900120015001800m/z,amu3.0e46.0e49.0e4Intensity,cpsPrecursorsof86(Ile/Leu)Q1Scan745.6第74頁,共122頁，2024年2月25日，星期天FragmentationWhenanIonfragmentsthefollowingformulasapply:Positivemode(Parent)+

A++BNeutralNegativemode(Parent)-

A-+BNeutral第75頁,共122頁，2024年2月25日，星期天NeutralLossScan(中性丟失掃描)Q1&Q3bothscanagivenmassrangebutwithaconstantdifferencebetweenrangesscannedSpectrumindicateswhichionsloseaneutralspeciesequaltoQ1-Q3differenceComplementtoPrecursorIonScanNeutral“gain”indicatesamultiplychargedprecursorionwasfragmentedΔmm1+scannedm3+scanned第76頁,共122頁，2024年2月25日，星期天MultipleReactionMonitoring(MRM)PrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)Manyprecursortoproductionpairscanbemonitored(A-B,A’-B’,etc.)MRMisthebestwaytomaximizesignalintensityofproductionsMRMusedprimarilyforquantitation第77頁,共122頁，2024年2月25日，星期天WhyLC/MS/MSforQuantitation?RetentionTime

RetentionTimeIntensityIntensityPrecursorionfixedProductionfixedFragmentation(CAD)IncreasedSensitivity&Specificity第78頁,共122頁，2024年2月25日，星期天儀器介紹:4000QTRAPTM四極桿-四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司最新推出的、具有革新性設(shè)計的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀。它把四極桿-線性離子阱質(zhì)譜技術(shù)首次結(jié)合在一起，既保留了串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀的優(yōu)點如母離子掃描（PS）、中性丟失掃描（NL）、MRM定量功能，又克服了傳統(tǒng)3D離子阱質(zhì)譜儀的缺點如低質(zhì)量截止點（1/3效應(yīng)）、“空間電荷效應(yīng)”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一臺集優(yōu)異定性功能與定量功能于一體的質(zhì)譜儀，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)（組）研究、藥物開發(fā)、藥物代謝、有機化學、環(huán)境分析、毒物分析、食品檢驗、商品檢測、衛(wèi)生防疫、煙草品質(zhì)改良等眾多領(lǐng)域。第79頁,共122頁，2024年2月25日，星期天q0Q1q2Q3線性離子阱：超大的離子容量：消除了傳統(tǒng)離子阱的“空間電荷效應(yīng)”第80頁,共122頁，2024年2月25日，星期天低質(zhì)量截止(1/3效應(yīng))低碰撞效率（離子缺失）第81頁,共122頁，2024年2月25日，星期天多電荷增強掃描功能：有效消除單電荷離子的干擾，只檢測多電荷離子，更適合檢測微量的肽或蛋白質(zhì)?MS3功能：MS3功能和串聯(lián)四極桿碰撞方式，只需進行最少的實驗卻提供最充分的結(jié)構(gòu)信息?動態(tài)線性范圍寬保留3Q質(zhì)譜儀的優(yōu)異MRM定量性能，能夠檢測復雜基質(zhì)中的微量雜質(zhì)第82頁,共122頁，2024年2月25日，星期天QTRAP實現(xiàn)MSn功能以利血平為例:第一步做母離子609的MS2譜，由于碰撞能量較高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且無1/3質(zhì)量CUTOFF現(xiàn)象，故從低質(zhì)量端到高質(zhì)量端產(chǎn)生碎片很多。每個碎片均可做MS/MS/MS，從中確證下一級的碎片歸屬，進而推斷分子結(jié)構(gòu)。例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448產(chǎn)生，M/Z365和M/Z174是由M/Z397產(chǎn)生。M/Z365,M/Z236和M/Z195還可繼續(xù)打碎。第83頁,共122頁，2024年2月25日，星期天RESERPINE-MS/MS第84頁,共122頁，2024年2月25日，星期天RESERPINE-MS/MS/MS（448）第85頁,共122頁，2024年2月25日，星期天RESERPINE-MS/MS/MS（397）第86頁,共122頁，2024年2月25日，星期天RESERPINE-MS/MS/MS（365）第87頁,共122頁，2024年2月25日，星期天RESERPINE-MS/MS/MS（195）第88頁,共122頁，2024年2月25日，星期天LC-MS技術(shù)的應(yīng)用以大氣壓電離為接口的LC-MS技術(shù)已經(jīng)在藥物、化工、臨床醫(yī)學、分子生物學等許多領(lǐng)域中獲得廣泛的應(yīng)用第89頁,共122頁，2024年2月25日，星期天具體應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)藥學：藥物代謝、藥物動力學、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析生物化學：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析臨床醫(yī)學：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿?。⒀t蛋白變異、膽酸食品科學：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物法醫(yī)學：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測獸醫(yī)學：興奮劑、磺胺類藥物、抗體合成化學：有機金屬化合物、有機合成物有機化學：表面活性劑、染料第90頁,共122頁，2024年2月25日，星期天藥物代謝研究

藥物代謝與藥物動力學研究技術(shù)上的最新重大進展是LC-MS-MS的使用，電噴霧（ESI）和大氣壓化學電離（APCI）以及大氣壓光電離（APPI）是其主要的離子源，由于具有高靈敏度（ng/ml~pg/ml），高選擇性（檢測特定的碎片離子）、高效率（每天可檢測幾百個生物樣品和對藥物結(jié)構(gòu)的廣泛適用性，對液態(tài)樣品和混合樣品的分離能力高，可通過二級離子碎片尋找原型藥物并推導其結(jié)構(gòu)，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應(yīng)用于藥物代謝研究中一期生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和二期結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定、復雜生物樣品的自動化分析以及代謝物結(jié)構(gòu)闡述等，已在世界上大型制藥企業(yè)中取代HPLC而占據(jù)了主導地位，其測試的樣品量占總量的70%以上。第91頁,共122頁，2024年2月25日，星期天天然產(chǎn)物天然藥物的研究目前中藥開發(fā)研究有兩條途徑。一條途徑是從單一植物中提取一種有效成分(單體化合物)或提取物開發(fā)成新藥。另一途徑則是中藥復方制劑的開發(fā)研究。采用現(xiàn)代多種儀器聯(lián)用新技術(shù)，特別是高效液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)，可對其十幾種乃至幾十種化學成分進行指紋圖譜分離鑒定。再從指紋圖譜中選擇四、五種指標成分(有效成分或特征成分)進行定量，可以確定出簡化的指紋圖譜和指標成分，又是最合理的中藥復方質(zhì)量控制的方法，是研究中藥復雜體系，尤其是復方的有力工具。國內(nèi)外很多學者已進行了復方丹參、清開靈、瀉心湯、人參或黨參制劑等中藥中的主要成分的分析。第92頁,共122頁，2024年2月25日，星期天臨床診斷和疾病生物標志物的分析

歐美等目前已廣泛采用HPLC/MS/MS法用于臨床診斷以及疾病生物標志物的研究、檢測，具有專一性好、靈敏度高、成本低、分析快速，經(jīng)濟效益可觀等特點。目前可進行新生兒遺傳疾病篩選（PKU、MCAD等四十種左右）、新生兒性激素變異的檢測、男女激素的監(jiān)測、老年癡呆癥的早期診斷、抗排異藥物的檢測、磷酸脂的檢測、血紅蛋白變異檢測、糖化血紅蛋白（糖尿病早期檢測）、某些心臟病、癌癥疾病篩查如乳腺癌等等（Biomarker法、通過鑒定DNA損傷程度測定）、藥物劑量監(jiān)測、藥物相互作用監(jiān)測、地區(qū)性突發(fā)性中毒病人的毒物檢測等。第93頁,共122頁，2024年2月25日，星期天殘留、法醫(yī)學和環(huán)境樣品測定專家指出，中國入世后，食品工業(yè)最大的問題就是"安全壁壘"，這將給中國的進出口和國內(nèi)企業(yè)帶來極大的威脅。美國食品與藥品管理局(FDA)、歐盟、日本、韓國等主要貿(mào)易國和地區(qū)公布了在進口動物源性食品中禁止使用的藥物名單，提高了最高限量標準。這就要求中國加強農(nóng)、畜、水產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥等殘留的控制和檢測。同樣隨著人類對生存環(huán)境的倍加關(guān)注，要求對環(huán)境中各種污染物、有害或有毒物以及法庭科學中毒物、濫用藥物等進行更加嚴格的監(jiān)控。而配以ESI、APCI和APPI離子化技術(shù)的LC/MS/MS以分析速度快、靈敏度高、特異性好等特點廣泛應(yīng)用與殘留和毒物分析。目前已成功地進行數(shù)百種農(nóng)藥、獸藥、抗生素、興奮劑類殘留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺類、硝基呋喃類、毒品、多環(huán)芳烴等等化合物的檢測。第94頁,共122頁，2024年2月25日，星期天下面講解應(yīng)用示例第95頁,共122頁，2024年2月25日，星期天高效液相色譜――電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定清開靈復方中膽酸

采用HPLC/MS/MS技術(shù)，從清開靈注射液中，通過分子量、二級質(zhì)譜碎片信息定性測定了清開靈復方中的膽酸。直接進樣實驗。清開靈注射液經(jīng)過初步化學處理后采用電噴霧（ESI）離子源，在負離子掃描方式下，得到一極質(zhì)譜圖、即分子離子峰[M-H]-，再用二級質(zhì)譜（MS/MS）掃描目標分子離子的碎片峰。再以相同的實驗條件對標準品進行測定，做出其一級、二級質(zhì)譜圖。第96頁,共122頁，2024年2月25日，星期天通過對樣品進行分子離子峰的掃描發(fā)現(xiàn)[M-H]-的峰中有一個很強的407，根據(jù)樣品處理過程以及對復方各單味藥材的研究，其應(yīng)該為一有機酸的負離子峰，并初步推斷其為膽酸。（膽酸的分子量為408）。如圖所示：通過對照樣品(右)和標準品（左）的二級質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)其主要碎片峰均吻合較好。第97頁,共122頁，2024年2月25日，星期天第98頁,共1