《船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效性檢測規(guī)程》征求意見稿

1T/CI×××—2024船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活有效性檢測規(guī)程本文件規(guī)定了船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能的采樣規(guī)程、L型和S型存活生物指示性檢測規(guī)程和詳細(xì)檢測方法、菌落總數(shù)檢測規(guī)程、耐熱大腸桿菌檢測規(guī)程、大腸埃希氏菌檢測規(guī)程、腸球菌檢測規(guī)程和有毒霍亂弧菌檢測規(guī)程。本文件適用于船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能的檢測與評估。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5750.12-2023生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB4789.38-2012食品微生物學(xué)檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)GB17378.7海洋監(jiān)測規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測檢測方法GB/T12763海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查ASTMD5392-2014用兩步膜濾法分離和計數(shù)水中大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)試驗方法JT/T1393-2021船舶壓載水指示性分析取樣與檢測要求SN/T1239-2015國境口岸霍亂檢驗規(guī)程HJ1215-2021國際海事組織國際海事組織國際海事組織國際海事組織總結(jié)》水質(zhì)浮游植物的測定濾膜顯微鏡計數(shù)法2004《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》（以下簡稱壓載水公BWM.2/Circ.70《船舶壓載水管理系統(tǒng)調(diào)試測試指南》MEPC,173(58)《G2導(dǎo)則船舶壓載水取樣導(dǎo)則》MEPC74/INF.18《在船舶壓載水中指示性檢測有毒有害海洋生物可用設(shè)備美國國家衛(wèi)生基金會認(rèn)證EPA/600/R-10/146《壓載水處理技術(shù)驗證通用協(xié)議》2T/CI×××—2024ISO6222-1999水質(zhì)可培養(yǎng)微生物的計數(shù)方法營養(yǎng)瓊脂介質(zhì)中接種法進(jìn)行群落計數(shù)法ISO9308-1-2014水質(zhì)—大腸埃希氏菌和大腸菌群計數(shù)——第一部分低細(xì)菌背景區(qū)系水的膜過濾法ISO7899-2-2000水質(zhì)—腸球菌的檢測和計數(shù)第2部分：膜過濾法ISO8199-1988水質(zhì)—微生物培養(yǎng)計數(shù)通用指南ISO5667-3-2012水質(zhì)—取樣—第三部分：水樣的處理與保存3術(shù)語和定義SN/T1239界定的術(shù)語和定義適用于本文件，下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1船舶壓載水Ballastwater為保持船舶具有一定吃水深度或調(diào)整船體平衡，以便保證船舶航行安全平穩(wěn)，而需泵入艙內(nèi)、在裝貨時再自艙內(nèi)排出的水體。3.2壓載水管理系統(tǒng)Ballastwatermanagementsystem用于清除、殺死壓載水中的生物或(在排放前)使其失去活性的預(yù)制、商用處理系統(tǒng)。供應(yīng)商壓載水處理產(chǎn)品的整體將用于實現(xiàn)供應(yīng)商對處理效果或運行性能的主張，并以集成的方式包括所有組件。3.3處理水Treatedballastwater壓載水管理系統(tǒng)處理后排出的水。3.4環(huán)境水Ambientwater在測試時提供給處理系統(tǒng)的水。環(huán)境水須在特定的生物密度范圍和水質(zhì)參數(shù)內(nèi)，用于評定處理設(shè)備全面運行條件下的效能。3.5等動力取樣Isokineticsamplecollection從取樣口收集樣品的水流速度與主壓載管中的速度相對等的取樣方式。3T/CI×××—20243.6存活生物Viableorganisms存活生物為有機體和活著的所有生命階段，本標(biāo)準(zhǔn)中僅指浮游生物。3.6.1L型存活生物是指最小尺寸≥50μm的浮游動物。3.6.2S型存活生物是指最小尺寸＜50μm且≥10μm的浮游生物。3.7浮游生物Plankton懸浮于水中，體型微小，無運動能力或游動能力很弱，不能主動做長距離運動，只能被動地“隨波逐流”，主要包括浮游植物與浮游動物。3.8最小尺寸Minimumsize基于《壓載水公約》的描述，特指浮游生物的體長、體寬和體高中最小的尺寸，浮游生物的身體長度、寬度和高度則是通過測量最大的部分來確定的。L型存活生物的最小尺寸：浮游動物的剛毛、刺、觸須等不包括在內(nèi)，L型存活生物的最小尺寸為生物的體寬部分如下圖所示。圖1L型浮游生物最小尺寸的測定（需畫平行線顯示體長）S型存活生物的最小尺寸：以單個細(xì)胞或單個體的體寬為最小尺寸，如下圖所示。4/T/CI×××—2024/圖2S型浮游生物的最小尺寸示意圖3.9脈沖-振幅-調(diào)制Pulse-Amplitude-Modulation（PAM）葉綠素?zé)晒鈾z測法通過發(fā)射一系列微弱的光，脈沖誘導(dǎo)藻類細(xì)胞內(nèi)葉綠素發(fā)出熒光（F0）而不進(jìn)行光合作用，之后以快速強光脈沖關(guān)閉所有光合細(xì)胞的電子門暫時抑制光合作用，從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大(Fm)，可變熒光Fv=Fm-F0，根據(jù)Fm和F0可以計算出光合系統(tǒng)PSII的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm，它反映了浮游植物的潛在最大光合能力，即藻類的生理狀態(tài)?；谶@種方法可用來指示性檢測最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的活體數(shù)量。3.10活性熒光檢測法Activefluorescence是將一定波長的光照射到活的藻類細(xì)胞上后得到的活細(xì)胞中的葉綠素?zé)晒庑盘枺谶@種方法可用來指示性檢測最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物的數(shù)量。3.11三磷酸腺苷Adenosinetriphosphate(ATP)熒光檢測法在熒光素酶E（luciferase）和Mg2+的作用下，熒光素LH2（luciferin）與ATP發(fā)生腺苷?；换罨?，活化后的熒光素LH2與熒光素酶E相結(jié)合，形成了熒光素—AMP復(fù)合體，并放出焦磷酸（PPi）。該復(fù)合體被分子氧氧化，形成激發(fā)態(tài)復(fù)合物P*-E·AMP，放出CO2，當(dāng)該復(fù)合物從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光，并最終形成氧化蟲熒光素P和AMP，其強度與生物密度正相關(guān)，基于這種方法可用來指示性檢測最小尺寸≥50μm（L型）浮游生物，最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）浮游生物的數(shù)量。3.12運動和熒光軌跡Motilityandfluorescenceassay（MFA）檢測法5T/CI×××—2024根據(jù)浮游動物運動軌跡成像后進(jìn)行智能計數(shù)，結(jié)合浮游植物自發(fā)熒光進(jìn)行檢測，基于這種方法來示性檢測最小尺寸≥50μm（L型）存活生物，最小尺寸≥10μm且＜50μm（S型）存活生物的數(shù)量。3.13指標(biāo)性微生物Indicatorbacteria用以指示船舶壓載水衛(wèi)生狀況及安全性的指示性微生物，主要包括菌落總數(shù)、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌、腸球菌和有毒霍亂弧菌（O1和O139）。3.14菌落總數(shù)Aerobicplatecount壓載水樣品經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每mL檢樣中形成的菌落總數(shù)。3.15耐熱大腸菌群Fecalcoliforms是指在44.5℃下培養(yǎng)24～48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。3.16大腸埃希氏菌Escherichiacoli又稱大腸桿菌，是廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，需氧及兼性厭氧，44.5℃生長，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP實驗、檸檬酸鹽）生化試驗++--或-+--的革蘭氏陰性桿菌。3.17腸球菌Intestinalenterococci一類革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，無芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷，是評估食品、水、食品加工設(shè)備、食品生產(chǎn)環(huán)境等衛(wèi)生狀況的指標(biāo)菌之一。3.18有毒霍亂弧菌ToxicogenicVibriocholerae革蘭氏陰性菌，菌體短小呈逗點狀，有單鞭毛、菌毛，部分有莢膜，共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂。6T/CI×××—20244船舶壓載水管理系統(tǒng)生物滅活性能檢測采樣規(guī)程4.1取樣信息收集樣品采集前應(yīng)與船方或壓載水設(shè)備生產(chǎn)商充分了解壓載水管理系統(tǒng)型號與安裝信息，如設(shè)備主管道是否有專用取樣口，取樣口的位置、直徑大小及類型，設(shè)備操作限制參數(shù)等，相關(guān)信息見附錄A-1/A-2/A-3。4.2取樣方案制定根據(jù)船舶和設(shè)備基本信息，制定測試方案，其內(nèi)容至少包括：檢測時間、登輪地點、試航線路、試航時間、返回?？康母劭?、測試艙位（標(biāo)明處理艙及對照艙）、壓載水處理設(shè)備類型及安裝位置、檢測項目、取樣方式、檢測方法、計劃參與取樣和檢測的人員等，并填寫附錄A-1/A-2/A-3/A-4相關(guān)信息。4.3取樣設(shè)備性能要求4.3.1主要取樣器具組成壓載水取樣設(shè)備應(yīng)包括管路連接單元、過濾與計量單元、樣品收集單元。4.3.2主要取樣器具要求取樣管路閥門建議使用隔膜閥，避免因調(diào)節(jié)流速而造成生物死亡，管路連接單元包含取樣探頭與連接軟管；過濾與計量單元包含過濾裝置與流速流量監(jiān)控裝置，流量計需定期計量和期間核查。4.3.3濾網(wǎng)要求取樣設(shè)備應(yīng)根據(jù)需要能對最小尺寸≥50μm存活生物（L型）樣品進(jìn)行收集，取樣設(shè)備中所有接觸或接近壓載管路的部件應(yīng)具備防腐蝕性，過濾裝置濾網(wǎng)或濾膜孔徑對角線直徑應(yīng)達(dá)到50μm，網(wǎng)孔孔徑需定期進(jìn)行計量和期間核查，每次取樣后濾網(wǎng)和管路需清洗干凈，并進(jìn)行紫外滅菌20min。4.4主要取樣耗材4.4.1樣品袋：5L4.4.2水樣瓶：1000mL4.4.3無菌取水袋：500mL4.4.4棕色玻璃瓶：250mL4.4.5鹽度計精度1‰7T/CI×××—20244.4.6溫度計精度0.1℃4.4.7潛水泵4.5登輪取樣前準(zhǔn)備工作4.5.1應(yīng)與代理人員或船方人員或設(shè)備商調(diào)試工程師溝通，了解船舶運行情況，壓載水壓載與卸載情況，壓載水處理系統(tǒng)運行情況，確保船上設(shè)備及安全防護(hù)措施運作正常，按照要求填寫附錄A-1/A-2/A-3船舶信息，壓載水信息，壓載水設(shè)備信息。4.5.2加強與碼頭經(jīng)營部門的聯(lián)系，在作業(yè)現(xiàn)場發(fā)出安全指令后方可登輪進(jìn)入作業(yè)現(xiàn)場。4.5.3取樣作業(yè)人數(shù)至少2人，取樣人員應(yīng)按照要求穿戴好防護(hù)裝備，穿戴整齊后方可進(jìn)入作業(yè)現(xiàn)場，如：安全繩、救生圈、防墜器、安全帽、護(hù)目鏡、勞保手套、聽力護(hù)具、防護(hù)鞋、登輪服。4.5.4進(jìn)入特殊區(qū)域取樣時，宜參考相關(guān)國際公約的要求。4.6樣品采集取樣人員在排放點附近的排放管上進(jìn)行壓載水取樣。遇不能從排放管取樣的情況下，可采用通過測深管、人孔和排水口等方式進(jìn)行取樣。4.6.1壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣4.6.1.1處理水取樣時需與船方或設(shè)備調(diào)試工程師確認(rèn)處理水艙位以及處理時間是否已經(jīng)達(dá)到設(shè)備技術(shù)指標(biāo)要求，檢查設(shè)備處理日志，如壓載水管理系統(tǒng)出現(xiàn)常見錯誤類別需進(jìn)行現(xiàn)場應(yīng)急處理，類別及處理方式詳見附錄B；4.6.1.2取樣人員需拍攝設(shè)備銘牌、流量計初始數(shù)值，階段性取樣體積以及取樣后總體積數(shù)值以備電子存檔，或使用執(zhí)法記錄儀開展取樣監(jiān)督工作；4.6.1.3壓載水主管路取樣等動力取樣要求在壓載水完全發(fā)展成湍流的狀態(tài)下，在排放管內(nèi)取樣，壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意圖如圖3所示。T/CI×××—2024圖3壓載水管理系統(tǒng)主管路取樣示意圖取樣流速應(yīng)滿足國際海事組織MEPC,173(58)G2導(dǎo)則船舶壓載水取樣導(dǎo)則要求的等動力取樣，計算公式如下式所示，取樣平均流速不應(yīng)超過50L/min。2(Diso)Qiso=Qm×2(Diso)Qiso為取樣流量，Qm為壓載水主管路排放流量，Diso為取樣管直徑，Dm為壓載水主管道排放管直徑。因此，每次取樣時，取樣工程師應(yīng)提前獲悉壓載水設(shè)備主管道直徑，經(jīng)過現(xiàn)場換算，攜帶合適尺寸的取樣設(shè)備管路，并通過隔膜閥調(diào)整合適的取樣流速，以達(dá)到等動力取樣要求。4.6.1.4壓載水處理系統(tǒng)主管道出水口附近搭建取樣設(shè)備，可根據(jù)不同尺寸壓載水處理系統(tǒng)取樣口，采用不同規(guī)格墊片與法蘭連接排水口與取樣設(shè)備通水管路或采用同等方式連接設(shè)備通水管路。4.6.1.5啟動船舶壓載水處理設(shè)備，檢查其運行情況，通過取樣管路上隔膜閥將流量調(diào)節(jié)至合適流速運行3-5min，清洗排放管路。4.6.1.6待流量計歸零后，拍照取證，打開壓載水處理系統(tǒng)采樣口閥門，正式取樣，在取樣過程中，階段性從取樣管路中取具有代表性的≥10μm和<50μm（S型）生物樣品5-10L，微生物樣品500mL，理化指標(biāo)樣品250mL，至少分3次取完S型生物樣品及微生物樣品。4.6.1.7當(dāng)處理水取樣達(dá)到1000L后，關(guān)閉設(shè)備等動力采樣口閥門，并拍照流量計取證；如處理水取不到1000L，則需在附錄A取樣表格中進(jìn)行情況說明。4.6.1.8環(huán)境水取樣可通過調(diào)換艙室在對照艙通過設(shè)備主管路排放口進(jìn)行取樣，需更換取樣濾網(wǎng)，如隨航取樣，則可通過舷邊使用隔膜泵進(jìn)行富集取樣。4.6.1.9環(huán)境水取樣過程參考處理水，需更換濾網(wǎng)，取樣體積達(dá)到100L后，關(guān)閉設(shè)備等動力采樣口閥門，并拍照流量計取證。4.6.2人孔取樣4.6.2.1適用對象（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，在壓載水頂邊艙和邊艙滿載或較高水位時的樣品采集；（2）壓載水艙人孔中取樣僅用于壓載水在艙內(nèi)或之前進(jìn)行了壓載水處理的情況；（3）若壓載水處理中的任何過程是在壓載水排放期間進(jìn)行的，不應(yīng)在壓載水艙人孔中取樣；s9T/CI×××—2024（4）盡可能靠近排放管路的排放點進(jìn)行取樣。4.6.2.2采集程序（1）由船方人員負(fù)責(zé)確認(rèn)并打開位于甲板上的人孔蓋；（2）人孔附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，泵的吸入管應(yīng)降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。4.6.3測深孔/空氣管中取樣4.6.3.1適用對象（1）此方法適用于未安裝壓載水管理系統(tǒng)或系統(tǒng)出現(xiàn)故障，壓載水頂邊艙和邊艙樣品采集，自測量管處采集方法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集；（2）確保壓載水在測深管/空氣管內(nèi)外充分混合；（3）船舶記錄簿記錄置換了壓載水時，應(yīng)謹(jǐn)慎使用測深管/空氣管取樣；（4）非多孔測深管在置換過壓載水的情況下，管中的壓載水可能會沒有受到置換的影響，導(dǎo)致無法滿足代表性取樣的要求。4.6.3.2采集程序（1）由船方人員打開測量管/空氣管上蓋，用測量尺測定水深和水面高度；（2）使用合適的潛水泵從測深空/空氣管中抽取壓載水樣品；如液面在操作部位以下10m深及以下，不適合用負(fù)壓泵；（3）測深孔/空氣管附近搭建取樣裝備，使用潛水泵連接取樣裝備，潛水泵放入人孔后，泵的吸入管應(yīng)降低到不同深度采集不同水深樣品，取樣流程參考4.6.1。4.6.4排水口取樣4.6.4.1適用對象此方法適用于壓載水頂邊艙有手動排水口且便于采樣時的樣品采集，自測量管處采集方法也適用于壓載水底邊艙和底艙的樣品采集。4.6.4.2采集程序（1）由船方人員打開壓載水艙頂邊艙手動排水閥門，排水3-5min。（2）用采樣桶自甲板上墜下或自岸上送至排水口處下方接水。4.7樣品保存、運送4.7.1樣品封存T/CI×××—2024采集樣品直接注入樣品瓶，根據(jù)檢測項目需求進(jìn)行必要現(xiàn)場預(yù)處理，貼標(biāo)簽，封口，樣品標(biāo)簽需包括：船舶名稱、IMO號、樣品類別、取樣方式、取樣日期、取樣體積、檢測項目等要素。4.7.2樣品現(xiàn)場檢測現(xiàn)場可利用鹽度計、溫度計等指示性檢測設(shè)備對樣品的溫度、鹽度進(jìn)行檢測，相關(guān)結(jié)果填入附錄A-5。4.7.3樣品運輸將樣品封存放入取樣包中，并由取樣人員快遞或?qū)＼囉?4h內(nèi)低溫（4℃±2℃)送達(dá)實驗室開展檢測，除有毒霍亂弧菌與理化樣品以外，其他樣品需存放在保溫箱或車載冰箱中。5L型和S型存活生物指示性檢測規(guī)程5.1檢測方法指示性方法可選擇附錄C中的方法或根據(jù)實際的需要選擇其他合適的方法。5.2指示性檢測設(shè)備要求指示性檢測設(shè)備宜具備出廠檢測報告，設(shè)備使用說明書，設(shè)備精度與誤差分析報告，歷史檢測數(shù)據(jù)報告，詳細(xì)檢測數(shù)據(jù)偏離分析報告，第三方產(chǎn)品檢測報告。5.3S型存活生物指示性檢測5.3.1PAM分析法基于PAM分析方法，對壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進(jìn)行指示性檢測分析，至少檢測3次及以上，檢測設(shè)備或推薦方法參見附錄C。5.3.2活性熒光檢測法基于活性熒光檢測法，對壓載水中≥10μm且＜50μm（S型）浮游植物進(jìn)行指示性檢測分析，至少檢測3次及以上，檢測設(shè)備或推薦方法參見附錄C。5.4L型和S型存活生物指示性檢測5.4.1ATP分析法基于ATP分析方法，對壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測分析，L型生物檢測量不少于500mL，S型生物檢測量不少于200mL，至少檢測3次及以上，方法標(biāo)準(zhǔn)參見5.4.2MFA分析法T/CI×××—2024基于MFA分析方法，對壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測分析，L型生物檢測量不少于600mL，S型生物檢測量不少于200mL，檢測1次，方法標(biāo)準(zhǔn)參見附錄C。5.5指示性檢測結(jié)果判定《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。5.5.1PAM分析法基于PAM分析法對S型生物的檢測，結(jié)果為PASS或者FAIL，檢測3次，以2次同樣結(jié)果為最終記錄，如2次及以上為PASS，則判定S型生物符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，如2次及以上為FAIL，需開展顯微鏡詳細(xì)檢測，如果詳細(xì)檢測依然超標(biāo)，則判定S型生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，D-2排放標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。5.5.2活性熒光檢測法基于活性熒光檢測法對S型生物的檢測，檢測結(jié)果為RiskFail或者RiskHigh或者RiskLow，檢測3次，以2次同樣結(jié)果為最終記錄，如2次及以上為RiskFail或者RiskHi需開展顯微鏡詳細(xì)檢測，如果詳細(xì)檢測依然超標(biāo)，則判定S型生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，D-2排放標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。5.5.3ATP分析法基于ATP分析法，對壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測分析，檢測結(jié)果為MostLikelyCompliant或者SignalClosetoLimit或者M(jìn)ostLikelynotCompliant，樣品檢測3次，以3次平均結(jié)果為最終記錄，如結(jié)果為SignalClosetoLimit或者M(jìn)ostLikelynotCompliant，則需開展顯微鏡詳細(xì)檢測，如果詳細(xì)檢測依然超標(biāo)，則判定L型和S型存活生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)；如3次平均結(jié)果為MostLikelyCompliant，則判定L型和S型存活生物符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，排放標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。5.5.4MFA分析法基于MFA分析法對壓載水中L型和S型存活生物進(jìn)行指示性檢測分析，檢測結(jié)果為VeryLowRisk或者LowRisk或者HighRisk，檢測1次，LowRisk或者HighRisk，則需開展顯微鏡詳細(xì)檢測，如果詳細(xì)檢測依然超標(biāo)，則判定L型和S型存活生物不符合《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)；如檢測過VeryLowRisk，則判定L型和S型存活生物符合《壓載水公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)，排放標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。T/CI×××—20245.5.5復(fù)驗因船舶壓載水中存活生物可能隨著時間的推移進(jìn)行不斷繁殖、再生或死亡，因此其數(shù)量一直是動態(tài)變化的，壓載水樣品不接受復(fù)驗。5.6結(jié)果記錄原始檢測記錄應(yīng)包括樣品編號、樣品名稱、檢測日期和時間、檢測方法、儀器設(shè)備、檢測結(jié)果、檢測人、復(fù)核日期、復(fù)核人等內(nèi)容，指示性檢測結(jié)果均需保留電子圖片存檔，以備復(fù)查溯源。5.7質(zhì)量控制定期每季度進(jìn)行陽性及陰性對照試驗。將培養(yǎng)的浮游生物制成100-200cells/mL的懸浮液，鏡檢后對指示性檢測設(shè)備按照操作程序進(jìn)行陽性試驗。陰性對照則使用純凈水進(jìn)行，如陰性對照或陽性對照試驗結(jié)果不符合要求，則應(yīng)查明原因后重新調(diào)試設(shè)備。6L型與S型存活生物顯微鏡詳細(xì)檢測規(guī)程6L型存活生物詳細(xì)檢測規(guī)程6.1檢測原理直接觀察法：通過顯微鏡觀察L型生物，當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時，該生物體被判定為不可存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其存活/死亡；如不能觀察器官活動，則可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應(yīng)，如無反應(yīng)則判斷為死亡，記錄活體數(shù)量的方法。差減法：通過顯微鏡觀察L型生物，當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時，該生物體被判定為不可存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其存活/死亡；如不能觀察器官活動，則可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應(yīng)，如無反應(yīng)則判斷為死亡。差減法為先計數(shù)死亡個體，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，再計數(shù)全體死亡個體數(shù)，兩個計數(shù)相減的數(shù)量為活體數(shù)量的個數(shù)。6.1.1主要設(shè)備、器具（1）倒置顯微鏡或體視顯微鏡（物鏡4×、10×、20×、40×;目鏡1×)（2）浮游動物計數(shù)框(80mm×100mm，22mL)（3）計數(shù)器（4）電動加樣管：量程20mL（5）燒杯T/CI×××—20246.1.2主要試劑及其配置6.1.2.1試劑碘化鉀（KI，分析純），碘（I2，分析純）6.1.2.2配置魯哥氏試劑：6g碘化鉀（KI）溶于少量水中（10mL-20mL），待其完全溶解后，加入4g碘（I2）充分搖動，待碘完全溶解后定容到100mL。6.1.3L型存活生物活體計數(shù)6.1.3.1準(zhǔn)備工作L型存活生物樣品送達(dá)實驗室后，用量筒計量樣品瓶中壓載水濃縮后的體積（V1每次取20mL樣品作為一個子樣品，根據(jù)表1數(shù)量水平選擇不同的檢測方法，根據(jù)樣品應(yīng)在取樣后24h內(nèi)開展檢測工作。6.1.3.2樣品初篩可先觀察一個浮游生物計數(shù)框的活體生物數(shù)量，預(yù)估L型活體生物的數(shù)量，如活體生物個體低于2個則為低數(shù)量水平，2-20個為中數(shù)量水平，超過20個則為高數(shù)量水平，低數(shù)量水平推薦計數(shù)片數(shù)為10片，中數(shù)量水平為5片，高數(shù)量水平則為3片，如表1所示：表1L型存活生物推薦計數(shù)片數(shù)及方法水平推薦計數(shù)片數(shù)推薦計數(shù)方法高數(shù)量水平（>100inds./m3）差減法/直接觀察法中數(shù)量水平（10inds./m3-100inds./m3）差減法/直接觀察法低數(shù)量水平（<10inds./m3）差減法/直接觀察法6.1.3.3樣品檢測（1）直接觀察法A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；B.迅速用電動定量加樣管取20mL樣品注入浮游動物計數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡下計數(shù)存活的數(shù)量（nL1），檢測浮游動物計數(shù)框移動方式如圖4所示；T/CI×××—2024圖4浮游動物計數(shù)框在顯微鏡視野下的移動方式示意圖C.當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時，該生物體被判定為不存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如心跳）判斷其存活/死亡；如不能觀察器官活動，則可用解剖針輕輕戳動，看其是否有反應(yīng)，如無反應(yīng)則判斷為死亡；D.每個樣品平均單片存活生物個體數(shù)按如下計算公式來計算。計算公式：單片存活生物個數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；NL為平均單片L型存活生物個體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2片，第3片，....第m片上L型存活生物個體數(shù)，單位為inds.；m為計數(shù)片數(shù)；單片體積數(shù)為20mL。（2）差減法A.將瓶中樣品輕輕上下顛倒若干次搖勻；B.用電動加樣管取20mL瓶中樣品注入浮游動物計數(shù)框內(nèi)，在倒置或體視顯微鏡下計數(shù)已死亡的L型生物（Nd(Dead)），檢測存活生物框轉(zhuǎn)動如圖4所示；C.當(dāng)生物體的某部分被嚴(yán)重破壞時，該生物體被判定為不存活；對于形態(tài)完整但是不動的浮游動物，可以觀察器官活動（如有心跳）判斷存活；如不能觀察器官活動，則可用浮游動物解剖針輕輕戳動，看其是否有反應(yīng)，如無反應(yīng)則判斷為死亡；D.先計數(shù)死亡個體Nd，再使用滴管加幾滴魯哥氏試劑到計數(shù)框內(nèi)，將樣品固定，再按照如下計算公式，計數(shù)全體Nt(Total)個體數(shù)；計算公式：單片存活生物個體數(shù)NL=Nt(Total)-Nd(Dead);單片存活生物平均個數(shù)NL，參考計算公式2：單片存活生物個數(shù)平均數(shù)為NL=(NL1+NL2+NL3+....NLm)/m；T/CI×××—2024NL為平均單片L型存活生物個體數(shù)，單位為inds./片；NL1，NL2，NL3，NLm為第1片，第2片，第3片，....第m片上L型存活生物個體數(shù)，單位為inds.；m為計數(shù)片數(shù)；單片體積數(shù)為20mL。注：第三片計算結(jié)果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效結(jié)果，否則必須再測一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過平均數(shù)的20%為止，即可視為有效平均計數(shù)結(jié)果。6.1.3.4計算每m3壓載水樣品中L型存活生物個體數(shù)量DL可參考如下公式計算：計算公式：DL(inds./m3)=（NL×V1）/（V2×V3）式中：NL為每個樣品平均單片存活生物個體數(shù)（inds./片）；V1為濃縮樣體積（mL）；V2為計數(shù)體積（20mL）；V3為采樣量（m3）。6.2S型存活生物詳細(xì)檢測規(guī)程6.2.1檢測原理雙熒光染色法（CMFDA/FDA），其中FDA是熒光素二乙酸酯，英文全稱是Fluorescein5-chloromethy-lfluoresceindiacetate，這兩種是可自由透過活細(xì)胞膜對細(xì)胞進(jìn)行示蹤的熒光染料。具細(xì)胞膜滲透性，無色，不具有熒光發(fā)光性。當(dāng)通過被動運輸穿透細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞后，CMFDA中的親脂性基團(tuán)可被胞漿內(nèi)非特異性酯酶水解，生成5-氯甲基熒光素（5-chloromethylfluorescein）；5-氯甲基熒光素可發(fā)出綠色熒光，因帶電荷而不能自由穿透細(xì)胞膜，并利用自身氯甲基與細(xì)胞內(nèi)蛋白和多肽中的谷胱甘肽在谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶作用下生成加合物，能完好地保留在胞內(nèi)。經(jīng)CMFDA/FDA標(biāo)記的細(xì)胞，在465nm-495nm波段下可激發(fā)穩(wěn)定的熒光，穩(wěn)定標(biāo)記的時間可達(dá)數(shù)天（至少3d），可用于S型細(xì)胞的活體計數(shù)。6.2.2主要設(shè)備、器具（1）正置或倒置熒光顯微鏡（可激發(fā)465nm-495nm波段）（2）浮游植物計數(shù)框（50mm×20mm×1mm，1mL）（3）計數(shù)器（4）移液槍：量程1mL，10μL（5）燒杯：500mLT/CI×××—2024（6）離心管：1.5mL6.2.3主要試劑及其配置6.2.3.1試劑熒光素二乙酸酯（FDA），5-氯甲酸熒光素酯（CMFDA），二甲基亞砜（DMSO）6.2.3.2CMFDA的配制（1）將50μg的CMFDA，加入430μL的二甲基亞砜（DMSO）并渦旋混勻，配制成濃度為250μM的CMFDA存儲液，避光；（2）通過移液槍，將存儲液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；（3）每管貼上標(biāo)簽，注明復(fù)溶日期和濃度，-20℃,避光保存；（4）每次用完后仍需重新-20℃,避光保存。6.2.3.3FDA的配制（1）取100mg的FDA溶于4.8mL的DMSO中，配制成濃度為50mM的FDA準(zhǔn)備液；（2）取10μL的50mMFDA準(zhǔn)備液，溶于990μL的二甲基亞砜DMSO中，制成濃（3）通過移液槍，將存儲液等分成100μL每份，保存在1.5mL的離心管中；每管貼上標(biāo)簽，注明復(fù)溶日期和濃度，-20℃避光保存。（4）每次用完后仍需重新保存在-20℃避光保存。6.2.4S型存活生物計數(shù)6.2.4.1準(zhǔn)備工作S型存活生物樣品送達(dá)實驗室后，采用CMFDA和FDA雙熒光染料進(jìn)行染色，并使用1mL浮游植物計數(shù)框在熒光顯微鏡激發(fā)光465-495nm下進(jìn)行染色細(xì)胞計數(shù)，樣品應(yīng)在取樣后24h內(nèi)開展檢測工作。預(yù)估樣品密度水平，選擇生物分布較為平均的視野進(jìn)行計數(shù)，視野中計數(shù)10個格子，如活體細(xì)胞總數(shù)小于10，則為低密度水平；如計數(shù)10-100個活體細(xì)胞總數(shù)，則為中密度水平，大于100個活體細(xì)胞的為高密度水平，參考表2開展推薦計數(shù)條數(shù)計算。表2S型存活生物推薦浮游植物框計數(shù)方法S型存活樣品預(yù)估密度水平推薦計數(shù)條數(shù)高密度水平（>103cells/mL）3條法計數(shù)（2、5、8條）T/CI×××—2024中密度水平（102cells/mL-103cells/mL）5條法計數(shù)（2、4、6、8、10條）低密度水平（<102cells/mL）全片計數(shù)6.2.4.2檢測（1）將水袋中S型生物樣品輕輕顛倒，再倒入500mL燒杯中，用1000μL移液槍吸取S型尺寸樣品980μL于1.5mLEP管中，分別再加入10μL的500μM的FDA工作液和10μL250μM的CMFDA工作液，使FDA的終濃度為5避光染色10min；（2）將染色后樣品輕輕搖勻，用移液槍將樣品加入1mL計數(shù)框內(nèi)，在激發(fā)波長為465nm-495nm的熒光顯微鏡下，4倍或10倍物鏡下分別計數(shù)被FDA和CMFDA著色的S型尺寸活體細(xì)胞數(shù)，被染色的生物體、運動的生物體或被染色同時運動的生物體都被視為存活生物，并用顯微鏡軟件測量存活生物細(xì)胞的最小尺寸，如圖5所示；圖5雙熒光染色后顯微鏡視野下活體細(xì)胞示例圖（3）染色后樣品應(yīng)在20min內(nèi)檢測完畢，以防熒光信號減弱；參考HJ1215水質(zhì)浮游植物的測定濾膜顯微鏡計數(shù)法，檢測時注意視野范圍內(nèi)細(xì)胞參照圖5Whipple視野計數(shù)約定規(guī)則，即：視野中處于下邊界及右邊界線的細(xì)胞計入總數(shù)，處于上邊界及左邊界線的細(xì)胞不計入總數(shù)，如圖6所示。若出現(xiàn)絲狀體等較大個體顯著穿過兩個或多個格子的邊界時，應(yīng)在低倍鏡下單獨計數(shù)，再計入總數(shù)；圖6Whipple視野計數(shù)約定規(guī)則示意圖T/CI×××—2024（4）若單個視野中生物體過多，參考表2計數(shù)方法，可采用長條計數(shù)法，選取兩相鄰刻度從計數(shù)框左邊一直計數(shù)到計數(shù)框右邊稱為一個長條。如樣品細(xì)胞數(shù)為高密度水平，則計數(shù)3條，即第2、5、8條，單片細(xì)胞密度為3條計數(shù)數(shù)量除以計數(shù)條數(shù)；若樣品細(xì)胞數(shù)為中密度水平，則計數(shù)五條，即第2、4、6、8、10，單片細(xì)胞密度為5條計數(shù)數(shù)量除以計數(shù)條數(shù)；若生物體密度為低密度水平，則應(yīng)全片計數(shù)，破損細(xì)胞不計數(shù)。計數(shù)時宜緩慢移動顯微鏡載物臺，如圖7所示，一般檢測片數(shù)為3片。圖7顯微鏡視野在浮游植物框下移動示意圖（5）對于S型存活生物每mL細(xì)胞密度DS，參考如下計算公式：計算公式：DS=(NS1+NS2+NS3)/3式中：NS1為第1片計數(shù)細(xì)胞密度（cells/mLNS2為第2片計數(shù)細(xì)胞密度（cells/mLNS3為第3片計數(shù)細(xì)胞密度（cells/mL）。注：第三片計算結(jié)果和前兩片的平均數(shù)之差如不大于其均數(shù)的±20%，其均數(shù)視為有效結(jié)果，否則必須再測一片，直至三片數(shù)值與前兩片平均數(shù)之差不超過均數(shù)的20%為止，即可視為有效平均計數(shù)結(jié)果。6.3原始記錄原始檢測記錄應(yīng)包括樣品編號、樣品名稱、檢測日期和時間、檢測方法、儀器設(shè)備、檢測結(jié)果、檢測人、復(fù)核日期、復(fù)核人等內(nèi)容，如樣品檢測不合格，則需對存活生物保存至少10張帶標(biāo)尺圖片，保存的照片應(yīng)帶有系統(tǒng)自帶的標(biāo)尺和日期，以供溯源。6.4結(jié)果報告數(shù)量/細(xì)胞計數(shù)≤10個時，以實際數(shù)量報告；數(shù)量/細(xì)胞計數(shù)＞10個且≤100個時，以整數(shù)報告；如＞于100個時，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。T/CI×××—20246.5結(jié)果判定6.5.1最小尺寸≥50μm（L型）存活生物結(jié)果不符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，則判定該壓載水不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。6.5.2最小尺寸＜50μm且≥10μm（S型）存活生物結(jié)果不符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，則判定為該壓載水不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。6.5.3《國際船舶壓載水與沉積物控制與管理公約》D-2標(biāo)準(zhǔn)參見附錄E。6.6復(fù)驗因存活生物樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當(dāng)實驗室檢測結(jié)果中的某一項檢驗結(jié)果不符合檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復(fù)驗。7菌落總數(shù)檢測規(guī)程7.1檢驗原理將待測樣品原液或經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液涂布到平板上，經(jīng)過指定的溫度和時間培養(yǎng)，由每個單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細(xì)胞；統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的菌落總數(shù)。7.2設(shè)備和材料電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。7.3培養(yǎng)基和試劑7.3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（g/L）組分質(zhì)量蛋白胨牛肉膏3.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0-20.0g將上述成分或商品化粉末，用1000mL去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至45-50°C倒入無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.2±0.2，在4℃避光條件下保存，兩周有效。7.3.2無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。7.3.310%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容100mL水中，滅菌。T/CI×××—20247.4檢驗程序7.4.1水樣前處理若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用（每125mL容積加入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液），在24h以內(nèi)處理采集樣品。7.4.2梯度稀釋使用無菌容器進(jìn)行稀釋，設(shè)置2-3個梯度，每個梯度2-3個平行。根據(jù)不同類別水樣壓載地點，樣品稀釋度可以參考表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無菌水中。表3樣品稀釋度參考表樣品類型樣品狀態(tài)1公海水處理前▲▲▲處理后▲▲▲港口水處理前▲▲▲處理后▲▲▲7.4.3接種以無菌操作方式用1mL滅菌移液槍吸取充分混勻的樣品或稀釋樣品1mL，注入滅菌平皿中，傾注15-20mL冷卻到44-47℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使樣品或稀釋樣品與培養(yǎng)基充分混勻，每個樣品或稀釋樣品傾注2個平皿。7.4.4培養(yǎng)待平皿內(nèi)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上（避免因表面水分凝結(jié)而影響細(xì)菌均勻生長），其中一組在36℃±2℃條件下，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)44±4h，另一組是22℃±2℃培養(yǎng)68±4h后觀察結(jié)果。7.4.5空白對照用無菌水做實驗室空白測定，培養(yǎng)后平皿上不得有菌落生長，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。7.5計數(shù)7.5.1計數(shù)規(guī)則T/CI×××—2024作平皿菌落計數(shù)時，可用眼睛直接觀察，必要時使用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數(shù)后，應(yīng)求出不同稀釋度的平均菌落數(shù)，供下一步計算時應(yīng)用。平皿上有較大片狀菌落超過平皿一半時，該平皿不參加計數(shù)。片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時，將此分布均勻的菌落計數(shù)。片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半菌落分布又很均勻時，將此分布均勻的菌落計數(shù)，并乘以2代表全皿菌落總數(shù)。外觀（形態(tài)或顏色）相似，距離相近卻不相觸的菌落，只要它們之間的距離不小于最小菌落的直徑，予以計數(shù)。緊密接觸而外觀相異的菌落，予以計數(shù)。若未能及時觀察，可5±3℃溫度保存，48h內(nèi)計數(shù)。7.5.2不同稀釋度的選擇及報告方式（1）首先選擇平均菌落數(shù)在30-399之間者進(jìn)行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則將該菌落乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例1）。（2）若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小于2應(yīng)報告兩者的平均數(shù)（如表4中實例2）。若大于2則報告其中稀釋度較小的菌落總數(shù)（如表4中實例3）。若等于2亦報告其中稀釋度較小的菌落數(shù)（見表4中實例4）。（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例5）。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)以按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例6）。（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則應(yīng)以最接近30或300的平均菌落乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表4中實例7）。（6）若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則以未檢出報告之。（7）如果所有平板上都有菌落密布，不要用“多不可計”報告，而應(yīng)在稀釋度最大的平板上，任意數(shù)其中2個平板1cm2中的菌落數(shù)，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)，乘以皿底面積63.6cm2，再乘以其稀釋倍數(shù)作報告。（8）菌落計數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時按實有數(shù)報告，大于100時，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來表示（見表4報告方式欄）。表4稀釋度選擇及菌落總數(shù)報告方式T/CI×××—2024實例不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個稀釋度菌落數(shù)之比（CFU/mL）報告方式（CFU/mL）1——1640016000或1.6×10422760295463775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044821500或1.5×1035多不可計513——5130051000或5.1×10465——270270或2.7×1027多不可計3053020031000或3.1×1048耐熱大腸桿菌檢測規(guī)程8.1檢測原理耐熱大腸桿菌Thermotolerantcoliforms又稱糞大腸菌群(FecalColiforms)，44.5℃培養(yǎng)24h，能在mTEC擇性培養(yǎng)基上生長，并形成黃色菌落的腸桿菌科細(xì)菌。8.2設(shè)備和耗材電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種環(huán)、酒精燈等。8.3培養(yǎng)基和試劑配置（1）mTEC培養(yǎng)基（g/L）組分含量乳糖氯化鈉7.5g月示蛋白胨5.0g磷酸氫二鉀3.3g酵母提取物3.0gX-Gluc0.5gSDS0.2gT/CI×××—2024脫氧膽酸鈉0.1g瓊脂將上述成分或商業(yè)化產(chǎn)品粉末稱取45.6g，用1L去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，121°C滅菌15min，冷卻至50°C左右倒入無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.3±0.2，在4℃避光條件下保存。（2）EC培養(yǎng)基（g/L）組分含量胰蛋白胨20.0g3號膽鹽乳糖5.0g磷酸氫二鉀4.0g磷酸二氫鉀氯化鈉5.0g將上述成分或商業(yè)化產(chǎn)品粉末稱取37.1g，用1L去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，加熱煮沸至完全溶解，定量分裝，115°C滅菌20min。培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.3±0.2℃,在4℃避光條件下保存。（3）10%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容至100mL水中，滅菌。8.4檢驗程序8.4.1水樣前處理無菌采樣袋，樣品儲存瓶，5±3℃溫度保存，若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每125mL容積加入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液)，在24h以內(nèi)處理采集樣品。8.4.2梯度稀釋使用無菌容器進(jìn)行稀釋，設(shè)置2-3個梯度，每個梯度2-3個平行。根據(jù)不同類別水樣壓載地點，樣品稀釋度可以參考7.4.2表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無菌水8.4.3水樣抽濾T/CI×××—2024用滅菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開關(guān)。8.4.4培養(yǎng)用滅菌鑷子夾取濾膜移放在mTEC培養(yǎng)基，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將培養(yǎng)皿倒置，放入35±0.5℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2h，復(fù)蘇菌種，44.5±0.2℃培養(yǎng)22h。注意保濕，防止濾膜和介質(zhì)的脫水。8.4.5確證實驗典型可疑菌落為黃色，對可疑菌落轉(zhuǎn)種EC培養(yǎng)基，44.5°C培養(yǎng)24±2h，如產(chǎn)氣則證實為耐熱大腸菌群。8.5對照試驗8.5.1空白對照每次試驗都要用無菌水做實驗室空白測定，培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。8.5.2陽性及陰性對照定期進(jìn)行陽性及陰性對照試驗，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。8.6計數(shù)對確證為耐熱大腸桿菌菌落的濾膜進(jìn)行計數(shù)，生長有20-60個耐熱大腸桿菌菌落數(shù)為計數(shù)合適范圍，如未在該范圍，則以最接近該范圍的數(shù)值為宜。計數(shù)被證實的耐熱大腸桿菌菌落數(shù)，水中耐熱大腸菌群數(shù)系以100mL水樣中耐熱大腸菌群菌落形成單位（CFU）表示，見下式。耐熱大腸桿菌菌落（CFU/100mL）=所計得×1008.7結(jié)果報告細(xì)胞計數(shù)大于或等于100個時，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。8.8結(jié)果判定T/CI×××—20248.8.1符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，如超過250CFU/100mL則判定為不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。8.8.2如樣品檢測不合格，則需對平板進(jìn)行拍照留存，以供溯源。8.8.3因微生物活體樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當(dāng)實驗室檢測結(jié)果中的不符合檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復(fù)驗。如需復(fù)驗，則需再次對壓載水管理系統(tǒng)處理后樣品進(jìn)行取樣重新抽取代表性樣本進(jìn)行全項檢驗，也可重新抽取代表性樣本對上次不合格項目單獨進(jìn)行檢驗。9大腸埃希氏菌檢測規(guī)程9.1檢測原理大腸埃希氏菌（Escherichiacoli）俗稱大腸桿菌，是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人、畜糞便，故以此作為船舶壓載水處理后排放標(biāo)準(zhǔn)之一，推斷壓載水中有沒有污染腸道致病菌的可能。大腸埃希氏菌培養(yǎng)原理通過CCA大腸菌群顯色培養(yǎng)基中含有三種顯色劑，用于檢測β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶，其中IPTG用于增強顯色反應(yīng)。大腸桿菌為β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶雙陽性，菌落呈深藍(lán)至紫色。9.2設(shè)備和材料電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。9.3培養(yǎng)基和試劑（1）稱取46g商業(yè)化CCA大腸菌群顯色培養(yǎng)基：培養(yǎng)基粉末，加蒸餾水定容至1000mL，混勻，加熱溶解并不停攪拌，煮沸不要超過1min。最終pH為6.8±0.2，在無菌操作下鋪板備用。制作好的平板在4℃避光條件下保存，兩周有效。（2）10%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容至100mL水中，滅菌。9.4檢驗程序9.4.1水樣前處理無菌采樣袋，樣品儲存瓶，5±3℃溫度保存，若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每125mL容積加入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液)，在24h以內(nèi)處理采集樣品。9.4.2梯度稀釋T/CI×××—2024使用無菌容器進(jìn)行稀釋，設(shè)置2-3個梯度，每個梯度2-3個平行。根據(jù)不同類別水樣壓載地點，樣品稀釋度可以參考7.4.2表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無菌水9.4.3水樣抽濾用滅菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開關(guān)。9.4.4培養(yǎng)用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移在CCA培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入36±2℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)21±3h。濾膜上藍(lán)黑色至紫色菌落為大腸埃希氏E.coli陽性菌落。9.5對照試驗9.5.1空白對照每次試驗都要用無菌水做實驗室空白測定，培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。9.5.2陽性及陰性對照定期進(jìn)行陽性及陰性對照試驗，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。9.6計數(shù)對確證為大腸埃希氏菌落的濾膜進(jìn)行計數(shù)，生長有20-60個大腸埃希氏菌落菌落數(shù)為計數(shù)合適范圍，如未在該范圍，則以最接近該范圍的數(shù)值為宜。計數(shù)被證實的大腸埃希氏菌落落數(shù)，水中耐熱大腸菌群數(shù)系以100mL水樣中耐熱大腸菌群菌落形成單位（CFU）表示，見下式。大腸埃希氏菌菌落（CFU/100mL）=所計得×1009.7檢測報告細(xì)胞計數(shù)大于或等于100個時，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。9.8結(jié)果判定T/CI×××—20249.8.1符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，如超過100CFU/100mL則判定為不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。9.8.2如樣品檢測不合格，則需對平板進(jìn)行拍照留存，以供溯源。9.8.3因微生物活體樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當(dāng)實驗室檢測結(jié)果中的不符合檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復(fù)驗。如需復(fù)驗，則需再次對壓載水管理系統(tǒng)處理后樣品進(jìn)行取樣重新抽取代表性樣本進(jìn)行全項檢驗，也可重新抽取代表性樣本對上次不合格項目單獨進(jìn)行檢驗。10腸球菌檢測規(guī)程10.1檢驗原理腸球菌IntestinalEnterococci是一類革蘭氏陽性球菌，堿性厭氧，無芽孢和莢膜，可分解膽汁七葉苷，是壓載水排放是否達(dá)標(biāo)的指示菌之一。本標(biāo)準(zhǔn)使用SBM培養(yǎng)基含有疊氮化鈉和的固體選擇性培養(yǎng)基上，典型的菌落形態(tài)是凸起的，菌落的中心或整體呈紅色、栗色或粉紅色。2,3,5-三苯基氯化四氮唑是一種無色染料，可被腸球菌還原紅色甲瓚，疊氮化鈉主要抑制革蘭氏陰性細(xì)菌的生長發(fā)育。再使用BAAA膽汁七葉苷疊氮瓊脂為培養(yǎng)基，其中牛膽汁可以抑制大部分革蘭氏陽性菌的生長，腸球菌水解七葉苷與檸檬酸鐵銨中鐵離子反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素，菌落成棕褐色至黑色。10.2設(shè)備和耗材電子天平、抽濾裝置、0.45μm無菌濾膜、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。10.3培養(yǎng)基和試劑配置（1）SBM培養(yǎng)基（g/L）組分含量胰蛋白胨酵母提取物5.0g葡萄糖2.0g磷酸氫二鉀4.0g疊氮鈉0.4g氯化四唑0.1g瓊脂T/CI×××—2024將上述成分或商品化粉末用1000mL去離子蒸餾水重懸，攪拌均勻，加熱至沸騰，使培養(yǎng)基完全溶解，避免過度加熱，冷卻至45-50°C倒入無菌培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.2±0.2，在4℃避光條件下保存，兩周有效。（2）BAAA培養(yǎng)基成分（g/L）組分含量胰蛋白胨牛肉浸粉3.0g酵母浸粉5.0g牛膽粉氯化鈉5.0g檸檬酸鈉七葉苷檸檬酸鐵銨0.5g疊氮化鈉0.25g瓊脂13.5g將上述成分或商品化粉末加熱溶解于1000mL蒸餾水中，103.43kPa（121℃)高壓滅菌15min，冷至46±1℃到平板，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為7.1±0.2，在4℃避光條件下保存，兩周有效。（3）10%Na2S2O3：10%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容至100mL水中，滅菌。10.4檢驗程序10.4.1水樣前處理無菌采樣袋，樣品儲存瓶，5±3℃溫度保存，若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每125mL容積加入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液)，在24h以內(nèi)處理采集樣品。10.4.2梯度稀釋使用無菌容器進(jìn)行稀釋，設(shè)置2-3個梯度，每個梯度2-3個平行。根據(jù)不同類別水樣壓載地點，樣品稀釋度可以參考7.4.2表3，梯度稀釋可使用50mL原液加入450mL無菌水T/CI×××—202410.4.3水樣抽濾用滅菌鑷子以無菌操作夾取無菌濾膜貼放在已滅菌的過濾裝置上，固定好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾。樣品過濾完成后，再抽氣約5s，關(guān)上開關(guān)。10.4.4培養(yǎng)濾膜小心移至SBM培養(yǎng)基上，然后將平皿倒置，放入37±1℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)44±4h。注意保濕，防止濾膜和介質(zhì)的脫水。10.4.5確證實驗典型可疑菌落為凸起的，中心或整個呈現(xiàn)紅色、栗色至粉紅色。如有，在無菌條件下將膜轉(zhuǎn)移至BAAA培養(yǎng)基上，44±0.5℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)4h后立即觀察，典型陽性菌落呈現(xiàn)棕褐色至黑色。10.5對照試驗10.5.1空白對照每次試驗都要用無菌水做實驗室空白測定，培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落生長。否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。10.5.2陽性及陰性對照定期進(jìn)行陽性及陰性對照試驗，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。10.6計數(shù)對確證為腸球菌菌落的濾膜進(jìn)行計數(shù)，生長有20-60個腸球菌為計數(shù)合適范圍，如未在該范圍，則以最接近該范圍的數(shù)值為宜；根據(jù)所使用的樣品量，按照下式，計算每100mL樣品中腸球菌菌落數(shù)。腸球菌菌落（CFU/100mL）=0010.7檢測報告細(xì)胞計數(shù)大于或等于100個時，將第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)，也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。10.8結(jié)果判定10.8.1符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，如超過100CFU/100mL則判定為不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。T/CI×××—202410.8.2如樣品檢測不合格，則需對平板進(jìn)行拍照留存，以供溯源。10.8.3因微生物活體樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當(dāng)實驗室檢測結(jié)果中的不符合檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復(fù)驗。如需復(fù)驗，則需再次對壓載水管理系統(tǒng)處理后樣品進(jìn)行取樣重新抽取代表性樣本進(jìn)行全項檢驗，也可重新抽取代表性樣本對上次不合格項目單獨進(jìn)行檢驗。11有毒霍亂弧菌檢測規(guī)程11.1檢驗要求本標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序指O1群和0139群霍亂弧菌引起的急性腸道傳染病，是發(fā)病急、傳播快、波及面廣、可水傳的甲類傳染病，需在生物安全二級BSL-2實驗室開展檢測工作。11.2設(shè)備和耗材電子天平、鑷子、量筒、恒溫培養(yǎng)箱、接種針、接種環(huán)、酒精燈、培養(yǎng)皿等。11.3培養(yǎng)基和試劑配置（1）2×APW培養(yǎng)基（g/L）組分含量蛋白胨20.0g氯化鈉20.0g將上述成分或商品化粉末40.0g，溶于1000mL去離子蒸餾水，分裝成100mL，121℃高壓滅菌15min，培養(yǎng)基最終pH值應(yīng)為8.6±0.2。在4℃避光條件下保存，兩周有效。（2）TCBS培養(yǎng)基成分（g/L）組分含量細(xì)菌蛋白胨酵母提取物蔗糖硫代硫酸鈉膽酸鈉檸檬酸鈉牛膽汁檸檬酸鐵T/CI×××—2024溴麝香草酚藍(lán)百里酚藍(lán)0.04g瓊脂將上述成分或商品化粉末加入1000mL的蒸餾水，浸泡10min，加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃倒入無菌培養(yǎng)皿中。在4℃避光條件下保存，兩周有效，勿高壓滅菌。（3）堿性瓊脂培養(yǎng)基（g/L）組分含量蛋白胨牛肉膏粉氯化鈉瓊脂將上述成分或商品化粉末加入1000mL的蒸餾水，浸泡10min，微波爐加熱煮沸至完全溶解，冷卻至55℃倒入無菌培養(yǎng)皿中。在4℃避光條件下保存，兩周有效，勿高壓滅菌。（4）10%Na2S2O3：稱取15.7g硫代硫酸鈉，定容至100mL水中，滅菌。11.4檢驗程序11.4.1水樣前處理無菌采樣袋，樣品儲存瓶，5±3℃溫度保存，若電解原理的壓載水處理設(shè)備產(chǎn)生的樣品，則水樣含有活性氯成分，需在收到樣品后根據(jù)樣品體積加入10%濃度Na2S2O3溶液，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每125mL容積加入0.1mL的Na2S2O3溶液，若500mL水樣則加入0.4mL的Na2S2O3溶液)，在24h以內(nèi)處理采集樣品。11.4.2增菌培養(yǎng)將100mL原水樣品加入至2倍APW堿性蛋白胨水培養(yǎng)液，36±1℃增菌18-24h，也可選擇二次增菌，第一次6-8h，第二次18h。11.4.3分離用接種環(huán)挑取增菌液表面生長物一環(huán)劃線接種于一弱選擇性培養(yǎng)基堿性瓊脂，以及一強選擇性培養(yǎng)基，本操作流程選用TCBS培養(yǎng)基，36±1℃培養(yǎng)24h。TCBS培養(yǎng)基上霍亂弧菌菌落呈黃色發(fā)亮、菌落大、表面光滑濕潤、稍凸起、邊緣整齊半透明，中心不透明。T/CI×××—202411.4.4鑒定應(yīng)挑取至少5個（少于5個則全部挑?。┛梢删渲练沁x擇性培養(yǎng)基（堿性瓊脂平板）進(jìn)行純化培養(yǎng)(36±1℃,18-24h)。11.4.4.1玻片凝集實驗從分離純化培養(yǎng)基上挑取可疑菌落與O1群霍亂弧菌特異性診斷血清及O139群霍亂弧菌特異性診斷血清作玻片凝集試驗。如可疑菌落在血清中很快（一般<10s）出現(xiàn)肉眼可見的明顯凝集，而在生理鹽水中不凝聚著判定為陽性，如在1min仍無明顯的凝集顆粒，判定為霍亂弧菌陰性。每份樣本至少應(yīng)挑選5個以上菌落逐個進(jìn)行玻片凝集檢查，必要時，取培養(yǎng)皿涂布劃線或劃線部位菌落邊緣部分菌苔再做玻片凝集，均為陰性時可報告未檢出O1群和O139群霍亂弧菌。與O139群霍亂弧菌特異性診斷血清凝集者初步鑒定為O139群霍亂弧菌，與O1群霍亂弧菌特異性診斷血清凝集者初步鑒定為O1群霍亂弧菌。推薦使用O1群和O139群霍亂弧菌兩價診斷血清，檢出陽性時再用單價血清進(jìn)一步鑒定。11.4.4.2形態(tài)學(xué)檢查取純菌進(jìn)行革蘭氏染色，霍亂弧菌為革蘭氏陰性短小稍彎曲桿菌，無芽孢。11.4.4.3動力檢查（1）半固體法以接種針挑取分離培養(yǎng)純菌落在半固體瓊脂上穿刺，35-37℃培養(yǎng)8-10h，如沿穿刺線擴(kuò)散生長并使培養(yǎng)基變渾濁，為動力陽性?；魜y弧菌動力為陽性。（2）懸滴法用懸滴法制片，在高倍顯微鏡或暗視野顯微鏡下觀察，如有穿梭狀或流星狀運動的短小弧形桿菌，則為動力陽性?；魜y弧菌動力為陽性。11.4.4.4生化鑒定（1）氧化酶試驗以接種環(huán)挑取一環(huán)新鮮營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物至滅菌白色濾紙上，滴加氧化酶試劑一滴，如在1-2min內(nèi)出現(xiàn)粉紅色至紫色至黑紫色，則為氧化酶試驗陽性，霍亂弧菌氧化酶試驗為陽性。（2）黏絲試驗在潔凈玻片或平皿上加一大滴0.5%去氧膽酸鈉水溶液，用接種環(huán)挑取一環(huán)新鮮營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)物，放在試劑旁研磨，再與試劑混合制成濃厚的懸液。在不斷地研磨下，霍亂弧菌懸T/CI×××—2024液能在1min內(nèi)由混變清并變得很黏稠，用接種環(huán)挑取時，可拉出細(xì)絲。黏絲試驗陰性菌呈均勻懸液狀，與蒸餾水對照相同。（3）系統(tǒng)生化試驗API20E生化鑒定試劑盒，參考說明書，進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。利用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)（VITEK），從純化平板上挑取可疑菌落，參照說明書進(jìn)行鑒定。11.4.5結(jié)果判定與O1群霍亂弧菌特異性診斷血清或O139群霍亂弧菌特異性診斷血清凝集，而在生理鹽水中無自凝現(xiàn)象，氧化酶試驗陽性，黏絲試驗陽性，動力陽性，形態(tài)學(xué)檢查為革蘭氏陰性短小稍彎曲桿菌，無芽孢?？膳袛酁闄z出O1群或O139群霍亂弧菌。符合附錄E壓載水公約D-2排放標(biāo)準(zhǔn)，如有有毒霍亂弧菌檢出則判定船舶壓艙水為不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。11.5陽性結(jié)果的處置（1）對首發(fā)分離菌株，應(yīng)送上一級或有確認(rèn)能力的實驗室或指定實驗室做進(jìn)一步復(fù)核鑒定，復(fù)核鑒定按第7部分鑒定流程執(zhí)行。（2）檢出的霍亂弧菌菌株由專人負(fù)責(zé)保管及詳細(xì)記錄。（3）對陽性樣品處理需滿足BSL-2實驗室的樣品處理要求。11.6實驗室安全操作實驗室生物安全按GB19489規(guī)定。11.7結(jié)果報告未檢出霍亂弧菌的報告時，按檢測所需樣本的量，報告為“100mL樣品中未出O1群和O139群霍亂弧菌”；檢出霍亂弧菌的報告時，按檢測所需樣本的量，報告為“100mL樣品中檢出O1群和O139群霍亂弧菌”。11.8結(jié)果判定11.8.1符合附錄ED-2排放標(biāo)準(zhǔn)，如檢出有毒霍亂則判定壓艙水為不合格，按照相應(yīng)法律、法規(guī)、部門規(guī)章等進(jìn)行處置。11.8.2如樣品檢測不合格，則需對平板和驗證結(jié)果進(jìn)行拍照留存，以供溯源。11.8.3因微生物活體樣品24h內(nèi)檢驗完畢，因此當(dāng)實驗室檢測結(jié)果中的不符合檢驗依據(jù)的要求時，樣品不接受復(fù)驗。如需復(fù)驗，則需再次對壓載水管理系統(tǒng)處理后樣品進(jìn)行取樣重新抽取代表性樣本進(jìn)行全項檢驗，也可重新抽取代表性樣本對上次不合格項目單獨進(jìn)行檢驗。T/CI×××—2024壓載水取樣與指示性樣品分析表附錄A-1船舶信息表VesselInformation船舶信息VesselInformation船舶名稱：VesselName:船東：Owner:掛旗國：Flag:建造日期：DateofConstruction:上一個港口與國家：LastPortandCountry:下一個港口與國家：NextPortandCountry:船型：Type:載重噸：GT:到達(dá)日期：ArrivalDate:IMONumber:CallSign:代理商：T/CI×××—2024Agent:到達(dá)港口：ArrivalPort:IOPP更新調(diào)查日期：IOPPrenewalsurveydate:附錄A-2壓載水信息表BallastWaterInformation壓載水信息BallastWaterInformation是否有壓載水管理計劃？BallastWaterManagementPlanonboard?是否已經(jīng)開始實施計劃？Hasthisbeenimplemented?指定單位：SpecifyUnits:壓載水總量：TotalBallastWateronboard:壓載水艙容：TotalBallastWatercapacity:船上的壓載艙數(shù)量：Totalnumberoftanksonboard:裝載壓載水的艙室：Numberoftanksinballast:壓載水管理類型（處理或置換）：TypeofBWmanagementundertaken(treatmentorexchange):其他額外的壓載水管理方式？（沖洗，延遲排放）？AnyadditionnalBWMconducted?(flushing,delayeduptakeoutsideport…)T/CI×××—2024已置換壓載艙號：Numberoftanksexchanged:未置換壓載水艙號：Numberoftanksnotexchanged:壓載定位：Uptakelocation:壓載日期：Uptakedate:鹽度類別（淡水，淡咸水，海水）：Salinitytype(fresh,brackish,marine):附錄A-3壓載水處理系統(tǒng)BallastWaterTreatmentSystem壓載水處理系統(tǒng)BallastWaterTreatmentSystem壓載水處理系統(tǒng)名稱：Modelname:壓載水處理型式（電解，紫外或其他）：Type(electrolysis,UV…):壓載水處理系統(tǒng)型式認(rèn)可部門/機構(gòu)：TypeApprovedby(classification/authority):安裝日期：Dateofinstallation:壓載水處理系統(tǒng)安裝/調(diào)試存在的問題？ShipreportdifficultywithBWTSoperation/maintenance?壓載水處理系統(tǒng)是否有運行問題？BWTSIssues?壓載水處理系統(tǒng)是否使用（是/否）：BWTSutilized?(yes/no)壓載水處理系統(tǒng)常規(guī)使用情況（處理循環(huán)數(shù)）：DurationBWTSinregularuse(treatmentcycles):T/CI×××—2024壓載水處理系統(tǒng)傳感器上次校準(zhǔn)時間（月份）：TimesincelastcalibrationofBWTSsensor(months):是否在壓載水處理系統(tǒng)在工作過程中取樣？BWTSinworkingconditionduringsampling?樣品采集過程中是否發(fā)生壓載水處理系統(tǒng)報警？BWTSalarmoccurredduringsamplecollection?壓載水處理系統(tǒng)最新的維護(hù)日期？BWTSmaintenanceuptodate?壓載水的保存時間（天）：Ageofballastwater(days):附錄A-4壓載水取樣BallastWaterSampling壓載水取樣BallastWaterSampling取樣日期：SamplingDate:取樣地理信息（國家，港口）：SamplingLocation(country,port):檢察官姓名：Nameofinspector:取樣艙室/點：Identificationofsamplingtank/point:取樣口類別：Typeofsamplingaccesspoint:取樣端口位置（機艙，壓載水處理排放口，測量孔或其他Locationofsamplingaccesspoint(engineroom,BWTSoutput,soundingpipe…):取樣方式：艙內(nèi)取樣或在線取樣：Typeofsampling:In-tankorin-line:取樣壓載艙描述：T/CI×××—2024Descriptionoftankssampled:取樣時間：Samplingduration:水樣體積：Watervolumesampled:取樣過程中從壓載艙排放體積總量（m3Totalvolumeofwaterdischargedfromsampledtanksduring取樣探針情況：Sampleprobeinformation:-安裝（永久性或半永久性）：-Installation(permanentorsemi-permanent):-來源（由船方提供或取樣隊提供）：-Source(providebytheshiporsamplingteam):-取樣探頭直徑（cm）：-Diameterofsampleprobe(cm):-主管路直徑（cm）-壓載水主管路直徑（cm）-Diameterofmainballastline(cm):-取樣口形狀（L-形，直形）：-Shape(L-shaped,straight…):-方向（例如：水流方向）：-Orientation(e.gintotheflowofwater):-位置（例如壓載水主線中心）：-Position(e.gcenterofmainballastline):-是否有閥門（是/否）：-Valvepresent(Y/N):-閥門形狀（球閥、隔膜閥）：-Valvetype(ball,diaphragm…):T/CI×××—2024-閥門位置（距離如T型閥門cm）：-Location(distancetoclosetupanddownstreamfeaturesuchaselbow,T,valve…)(cm):等動力取樣（取樣探頭尺寸，流速，位置是否正確）：Isokineticsamplecollection(probesize,flowrates,locationcorrect)?yesorno是否有收集樣品的裝備（是/否）？Wasadeviceusedtocollectsample(Y/N):如果有，樣品收集裝備是：Ifyes,Samplingequipmentused:-存活生物網(wǎng)（網(wǎng)垂長度，網(wǎng)口尺寸，網(wǎng)目尺寸）-Net(depthofverticalnethaul,netope