（高清版）GBT 43629.1-2023 生物技術(shù) 核酸合成 第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求

CCSA40生物技術(shù)核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求Biotechnology—Nucleicacidsynthesis—Part1:Requirementsfortheproductionandqualitycontrolofsynthesizedoligonucleotides2023-12-28發(fā)布2023-12-28實施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4寡核苷酸的設(shè)計和選擇 25通用質(zhì)量管理要求 25.1通用要求 25.2寡核苷酸分級 25.3控制文件 25.4質(zhì)量管理體系 25.5人員和培訓(xùn) 25.6安全控制 36資源管理 37生產(chǎn)工藝要求 37.1通用要求 37.2寡核苷酸合成 7.3純化 37.4質(zhì)量控制檢查 37.5干燥 47.6分裝 48質(zhì)量控制過程要求 48.1通用要求 48.2分析方法的確認與驗證 48.3鑒定與純度 48.4定量 58.5摩爾質(zhì)量和/或堿基長度 58.6退火溫度 6 68.8糾正措施和改進建議 79合成寡核苷酸(RNA)的附加要求 7附錄A(資料性)工藝過程檢查表 8附錄B(資料性)設(shè)備和裝置清單及其控制標(biāo)準(zhǔn) 9Ⅱ附錄C(資料性)摩爾質(zhì)量和摩爾數(shù)的計算 附錄D(資料性)采用質(zhì)量分析法驗證寡核苷酸序列 附錄E(資料性)采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品對測量儀器進行校準(zhǔn)——示例 附錄F(資料性)T。值的計算方法 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是GB/T43629《生物技術(shù)核酸合成》的第1部分。GB/T43629已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求。本文件做了下列最小限度的編輯性改動：——結(jié)合我國標(biāo)準(zhǔn)的具體情況，增加了頁下注。本文件等同采用ISO20688-1:2020《生物技術(shù)核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國生化檢測標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本文件起草單位：中國測試技術(shù)研究院、安徽瑞拜藥業(yè)有限公司、深檢集團(深圳)醫(yī)學(xué)檢驗實驗室、浙江貝蘭伯生物技術(shù)有限公司、成都海關(guān)技術(shù)中心、成都醫(yī)學(xué)院、河北省食品檢驗研究院、四川省疾病預(yù)防控制中心、通用生物(安徽)股份有限公司。本文件主要起草人：周李華、馬麗俠、周黎黎、徐朝花、侯曉妮、王或婕、林華、肖偉敏、蔣子敬、由核苷酸組成的單鏈、線性生物化合物稱為“合成寡核苷酸”或“寡核苷酸”,是生物技術(shù)中不可或缺的成分。例如，它們可用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增引物、微陣列、實時PCR或新一代測序(NGS)捕獲探針技術(shù)中，也可用于合成目標(biāo)基因的插入起始材料。GB/T43629擬由以下部分構(gòu)成：——第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求。適用于長度不超過250個堿基的合成寡核苷酸。——第2部分：合成基因片段、基因及基因組的生產(chǎn)和質(zhì)量控制的一般定義和要求。適用于長度低于10Mbp堿基對的合成基因片段、基因及基因組，包括非克隆片段(線性)和質(zhì)粒中的克隆基因(環(huán)狀)。在寡核苷酸合成過程中，生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制非常重要。為了確保符合最終應(yīng)用的質(zhì)量要求，需要對大小范圍、濃度和污染物進行量化?？紤]到寡核苷酸在生物活性方面的應(yīng)用，其質(zhì)量(尤其是序列和構(gòu)象)將影響其適應(yīng)性或功能，例如對同源結(jié)合位點的分子識別、化學(xué)行為等。每種終端應(yīng)用的具體要求可能有所不同。1生物技術(shù)核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生產(chǎn)和質(zhì)量控制要求本文件規(guī)定了合成寡核苷酸(通常最多250個堿基)的生產(chǎn)和質(zhì)量控制的最低要求。本文件還描述了合成寡核苷酸的一般質(zhì)量指標(biāo)以及質(zhì)量指標(biāo)評價的常用方法。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。附有特性量值、相關(guān)不確定度和計量溯源聲明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品證書，提供使用有效程序獲得的一個或多個特性量值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品。<合成寡核苷酸>具有滿足生物學(xué)試劑特定使用需求。注1:合成的寡核苷酸在作為PCR引物的情況下，合成的寡核苷酸具有引物的能力。注2:合成的寡核苷酸在作為探針以用于DNA微陣列、實時PCR或NGS的情況下，合成的寡核苷酸具有與靶核酸特異性雜交的能力。注3:通過評估寡核苷酸在其各自用途中的功能來確認其能力。<合成寡核苷酸>合成寡核苷酸的預(yù)期序列和/或長度與寡核苷酸總量之間的比率。注：合成寡核苷酸的純度是對應(yīng)于合成寡核苷酸的預(yù)期序列和/或長度的吸收峰面積與寡核苷酸的總峰面積的比率。通過高效液相色譜(HPLC)或毛細管電泳(CE)計算260nm處的吸光度(OD2so)。純度是根據(jù)HPLC或CE或質(zhì)譜儀的結(jié)果通過面積歸一化法計算的。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品referencematerial;RM具有一種或多種足夠均勻和穩(wěn)定的特定特性的物質(zhì)，其特性量值適用于測量過程中的預(yù)期用途。合成寡核苷酸syntheticoligonucleotides用化學(xué)方法合成的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。2注1:各種化合物(例如修飾的堿基、堿基類似物、末端標(biāo)記試劑、熒光化合物等)均能引入到合成的寡核苷酸中。注2:本文件中的合成寡核苷酸是單鏈的、線性的，長度范圍從大約10個到250個核苷酸。4寡核苷酸的設(shè)計和選擇合成寡核苷酸的質(zhì)量和一致性要求依據(jù)其預(yù)期用途有差異。例如，引物和探針在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或微陣列或新一代測序(NGS)中的質(zhì)量要求不同。通常，用戶負責(zé)指定具體用途的寡核苷酸的質(zhì)量要求。用戶可從生產(chǎn)者提供的質(zhì)量等級列表中選擇符合預(yù)期用途的質(zhì)量等級，例如“基因組等級”或“反義健全的質(zhì)量管理體系和檢測標(biāo)準(zhǔn)有助于提供一致的信息，以便：——用戶適當(dāng)?shù)剡x擇符合預(yù)期用途的寡核苷酸；——用戶和生產(chǎn)者能夠更好地溝通，并就定制寡核苷酸的要求達成一致。5通用質(zhì)量管理要求5.1通用要求合成寡核苷酸的生產(chǎn)者(以下稱為“生產(chǎn)者”)應(yīng)建立并實施一種程序，包括描述并保存記錄以下過程：a)訂單信息；b)寡核苷酸的生產(chǎn)；c)質(zhì)量控制要求。應(yīng)制定訂單接收過程中的質(zhì)量方針和質(zhì)量目標(biāo)。用戶的質(zhì)量要求可能因其預(yù)期用途、實驗方法的設(shè)計以及影響重復(fù)性和再現(xiàn)性結(jié)果因素的差異而變化。生產(chǎn)者應(yīng)根據(jù)訂單信息明確質(zhì)量方針、質(zhì)量目標(biāo)和合成寡核苷酸的等級(如適用),根據(jù)質(zhì)量等級表等方式監(jiān)控是否按照相應(yīng)的工藝過程進行生產(chǎn)(示例見附錄A)。此外，應(yīng)在生產(chǎn)過程中采取必要的措施，通過測量和分析所生產(chǎn)的合成寡核苷酸的質(zhì)量來達到預(yù)期的結(jié)果。5.2寡核苷酸分級為了避免產(chǎn)生不必要的或者過高的質(zhì)量定值要求，可考慮對寡核苷酸質(zhì)量進行分級。生產(chǎn)者在記錄寡核苷酸質(zhì)量等級時，應(yīng)根據(jù)預(yù)期用途確定等級。應(yīng)選擇和確定符合每個等級的純化方法，見7.3。5.3控制文件生產(chǎn)者應(yīng)制定一套程序，確保對程序化信息(包括本文件要求的記錄)進行受控，并應(yīng)防止使用任何作廢文件，嚴格執(zhí)行質(zhì)量管理體系要求。當(dāng)文件信息包括記錄保存在電子媒介中時，生產(chǎn)者應(yīng)確保對電子媒介的受控。5.4質(zhì)量管理體系生產(chǎn)者應(yīng)建立質(zhì)量管理體系。質(zhì)量管理體系應(yīng)建立必要的程序文件，并確保生產(chǎn)是根據(jù)程序文件進行的。應(yīng)定期檢查合成寡核苷酸的生產(chǎn)是否正確執(zhí)行本文件規(guī)定的質(zhì)量管理體系。注：對于標(biāo)記的寡核苷酸，能根據(jù)標(biāo)記的特性考慮其他質(zhì)量指標(biāo)，例如熒光強度和波長。生產(chǎn)者應(yīng)確保人員具備執(zhí)行本文件規(guī)定的程序文件的能力，并對其進行適當(dāng)監(jiān)督。生產(chǎn)者應(yīng)向人3員提供適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和能力評估。5.6安全控制生產(chǎn)者應(yīng)根據(jù)適用要求制定安全計劃，以確保本文件規(guī)定的寡核苷酸合成人員和純化人員的安全。6資源管理生產(chǎn)者應(yīng)確保生產(chǎn)寡核苷酸的設(shè)施和區(qū)域環(huán)境處于適當(dāng)?shù)臈l件下。生產(chǎn)者應(yīng)當(dāng)維護生產(chǎn)合成寡核苷酸的設(shè)備和儀器。生產(chǎn)者應(yīng)對可能影響合成寡核苷酸質(zhì)量的原料(包括試劑、純水和輔助材料)進行附錄B列出了適合生產(chǎn)合成寡核苷酸的設(shè)備和裝置及其控制標(biāo)準(zhǔn)示例。7生產(chǎn)工藝要求7.1通用要求單序列合成寡核苷酸的生產(chǎn)通常包括以下過程：a)合成；b)純化；c)質(zhì)量控制檢查；d)干燥(如適用);e)分裝。這些過程應(yīng)使用經(jīng)過定期維護/校準(zhǔn)的儀器進行，例如移液管或干燥器。注1:有幾種用于生產(chǎn)復(fù)雜的寡核苷酸庫的生產(chǎn)工藝。例如，幾個寡核苷酸組合成復(fù)雜的寡核苷酸庫，或者通過基于陣列的合成產(chǎn)生復(fù)雜的寡核苷酸庫。能根據(jù)生產(chǎn)方法選擇、實施適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制措施。注2:確定質(zhì)量屬性的常規(guī)方法不一定適用于基于陣列的合成。注3:在某些情況下，單序列寡核苷酸是用兼并堿基合成的，用于非特異性退火的特定應(yīng)用。在這種情況下，堿基在一個特定的位點被顛換。7.2寡核苷酸合成應(yīng)使用經(jīng)過定期校準(zhǔn)和維護的測量儀器進行質(zhì)量控制檢查。寡核苷酸合成儀應(yīng)定期維護和保養(yǎng)。操作人員應(yīng)按照程序文件進行資格認證。應(yīng)保存與實驗操作有關(guān)的記錄。應(yīng)根據(jù)設(shè)計寡核苷酸的風(fēng)險、與用戶協(xié)議的預(yù)期用途，選擇適當(dāng)?shù)募兓O(shè)備和方法。純化方法包括：反相高效液相色譜(C8,C18)純化、陰離子交換高效液相色譜[(stronganionexchangepattern,SAX),(weakanionexchangepattern,WAX)]、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、寡核苷酸純化柱(oligonucleotidepurificationcartridge,OPC)、高純度無鹽(highpuritysaltfree,HPSF)純化和直接沉淀(脫鹽)。純化方法可根據(jù)寡核苷酸的預(yù)期用途選擇。應(yīng)保留所用方法的記錄。純化設(shè)備應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行操作。與操作有關(guān)的記錄應(yīng)予以保存。7.4質(zhì)量控制檢查應(yīng)使用經(jīng)過校準(zhǔn)和維護的測量儀器進行質(zhì)量控制檢查。測量操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照程序文件4進行，并保留操作記錄。對寡核苷酸的特性、純度、雜質(zhì)、合成量和其他與預(yù)期用途有關(guān)的重要屬性應(yīng)進行質(zhì)量控制。干燥可采用離心蒸發(fā)、冷凍干燥或空氣干燥設(shè)備進行。這些操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照程序文件進行，并保留操作記錄。這些操作應(yīng)由有資質(zhì)的人員按照程序文件執(zhí)行，并保留操作記錄。8質(zhì)量控制過程要求8.1通用要求質(zhì)量控制過程應(yīng)確定寡核苷酸與其預(yù)期用途有關(guān)的特性、純度、雜質(zhì)、量和其他重要屬性。應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ú⑦M行驗證，以確定寡核苷酸的特性和質(zhì)量。測量工作應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行。8.2分析方法的確認與驗證用于進行質(zhì)量控制和檢測質(zhì)量屬性的分析方法應(yīng)經(jīng)過確認和驗證。儀器應(yīng)使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品進行校準(zhǔn)。注：附錄E描述了采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品對測量儀器進行校準(zhǔn)的示例。8.3鑒定與純度8.3.1堿基序列的鑒定堿基序列可通過適當(dāng)?shù)姆椒ù_認，例如電噴霧電離(ESI)或基質(zhì)輔助激光解析/電離(MALDI)作為離子源，飛行時間質(zhì)譜儀(ToF)、離子阱質(zhì)譜儀或四極桿質(zhì)譜儀(MS)用于分子量分析或者測序。注1:附錄D中描述了使用MS確認堿基序列的示例。注2:MS用于確認短寡核苷酸的序列，而準(zhǔn)確分析序列取決于合成寡核苷酸的長度。應(yīng)記錄確認的基本序列標(biāo)識。生產(chǎn)者和使用者應(yīng)就特定用途的寡核苷酸的純度達成一致。示例：合成寡核苷酸的純度能確定為目標(biāo)寡核苷酸量與寡核苷酸總量之比。目標(biāo)寡核苷酸是具有“預(yù)期長度”和/或正確序列的寡核苷酸。測定純度的方法包括以下一種或多種方法：a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；b)經(jīng)驗證的相對線性區(qū)間的毛細管電泳或平板凝膠電泳；c)質(zhì)譜(例如，ESI或MALDI作為離子源，ToF、MS作為分子量分析儀);d)測序。注：合成的寡核苷酸是復(fù)雜的分子，根據(jù)寡核苷酸的設(shè)計和生產(chǎn)工藝，會產(chǎn)生不同的結(jié)果。應(yīng)記錄測定的純度。在某些應(yīng)用中，雜質(zhì)的測定是很重要的。5生產(chǎn)者和使用者應(yīng)就特殊用途的寡核苷酸雜質(zhì)的可接受程度或范圍確定并達成一致。一般來說，雜質(zhì)是指干擾預(yù)期用途的寡核苷酸的含量。應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒y定雜質(zhì)的含量。雜質(zhì)測定方法包括以下一種或多種方法：a)分析用反相或離子交換高效液相色譜法；b)經(jīng)驗證的相對線性區(qū)間的毛細管電泳或平板凝膠電泳；c)質(zhì)譜(ToF或ESI);d)測序。應(yīng)記錄測定的雜質(zhì)。應(yīng)按照事先商定的預(yù)期用途提供足夠量的合成寡核苷酸。生產(chǎn)者應(yīng)確認合成總量符合用戶要求。應(yīng)記錄協(xié)商的合成寡核苷酸的總量。寡核苷酸濃度的測量可作為生產(chǎn)或產(chǎn)品測試(檢查)過程中質(zhì)量控制的一部分。吸光度可用來測量溶液中寡核苷酸的濃度。通常，使用260nm處的吸光度。物質(zhì)的量濃度是根據(jù)摩爾消光系數(shù)和OD值公式(C.1)計算的，摩爾消光系數(shù)的參數(shù)見附錄C。由于在計算摩爾消光系數(shù)時使用了不同的假設(shè)，摩爾消光系數(shù)數(shù)據(jù)(包括使用的假設(shè))均應(yīng)被記錄。其他方法，如高效液相色譜法，使用寡核苷酸參考物質(zhì)或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(如果適用),在證明與光密度的相關(guān)性后，也可用于測量濃度。應(yīng)記錄測量的濃度。質(zhì)量應(yīng)以納克(ng)或可溯源至SI單位的形式記錄。質(zhì)量通過公式(1)來計算：OD?so——260nm處的吸光度；V?——液體體積，單位為毫升(mL);C——換算系數(shù)，單位為納克每毫升(ng/mL);D——稀釋因子。8.5摩爾質(zhì)量和/或堿基長度應(yīng)檢測并記錄合成寡核苷酸的摩爾質(zhì)量和/或堿基長度。摩爾質(zhì)量可用質(zhì)譜(包括ESI或MALDI作為離子源，ToF、MS作為質(zhì)量分析儀)直接測定，也可通過平板電泳儀或毛細管電泳儀間接測定。應(yīng)由有資質(zhì)的人員進行確認，并保留記錄。質(zhì)譜法是一種測量分子量的方法。使用質(zhì)譜時，合成寡核苷酸的摩爾質(zhì)量可按公式(2)計算：6M={[(#dA×313.20)+(#dC×289.17)+(#dG×329.19)+(#dT×304.18)+(#dU×290.16)+(#I×314.18)+(#rA×329.19)+(#rC×305.17)+(#rG×345.19)+(#rU×306.15)]+(#rI×330.18)-62}+1 (2)M——摩爾質(zhì)量，單位為克每摩爾(g/mol);#dA——腺嘌呤(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dC——胞嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dG——鳥嘌呤(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dT——胸腺嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dU——尿嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#J肌苷(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#rA——腺嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rC——胞嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rG——鳥嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rU——尿嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rl——肌苷(核糖核酸)的數(shù)量。注1:更多信息見參考文獻以及C.1和表C.1。注2:公式(2)能用于計算基于3’端修飾的磷酸的摩爾質(zhì)量。使用不同的公式時，應(yīng)予以記錄。修飾的寡核苷酸的摩爾質(zhì)量可由C.2中所示修飾化合物的摩爾質(zhì)量來計算。8.6退火溫度Tm值可通過附錄F中的公式(F.1)計算。計算時應(yīng)記錄T。值。合成寡核苷酸的報告單，應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容：a)產(chǎn)品標(biāo)識；b)產(chǎn)品批號：——生產(chǎn)過程和質(zhì)量控制可追溯；c)訂單的使用者；d)純化方法；e)寡核苷酸序列：——描述應(yīng)采用IUPAC代碼的形式，示例見附錄C;f)摩爾質(zhì)量；注1:見公式(2)。原則上，寡核苷酸部分的摩爾質(zhì)量不包括帶有連接臂的修飾物，并且不包含5’端的磷酸基團。g)用于計算摩爾質(zhì)量的公式；注2:OD是一種廣泛使用的寡核苷酸量的表達。注3:見8.4.3。i)摩爾消光系數(shù)數(shù)據(jù)，包括假定的數(shù)據(jù)；注4:見公式(C.1)。j)總摩爾數(shù)；注5:根據(jù)表C.1中所示的吸光度指數(shù)和附錄C中描述的公式(C.1)計算該值。7k)退火溫度；1)鳥嘌呤胞嘧啶(GC)含量；m)推薦(例如特定的緩沖液，包括TE緩沖液)用于稀釋合成寡核苷酸的溶液；n)有效期：——有效期應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定，——可根據(jù)類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結(jié)果估計保質(zhì)期；注6:例如，干粉在4℃下的典型保質(zhì)期為兩年，溶液在一20℃下經(jīng)典保質(zhì)期為1年。o)儲存條件：——儲存條件應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定，——可根據(jù)類似寡核苷酸穩(wěn)定性研究的結(jié)果，確定儲存條件；注7:原則上，干粉儲存在4℃,溶液儲存在一20℃,但能根據(jù)用戶和生產(chǎn)者之間的協(xié)議使用不同的溫度范圍。p)運輸條件8.8糾正措施和改進建議質(zhì)量管理體系應(yīng)采取糾正措施消除包括不合格和顧客對產(chǎn)品的投訴等問題的原因。當(dāng)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品有問題需要改進時，宜考慮采取適當(dāng)?shù)募m正措施。質(zhì)量管理體系應(yīng)保存糾正措施或改進的記錄。質(zhì)量管理體系應(yīng)定期審查糾正措施和改進的情況。9合成寡核苷酸(RNA)的附加要求第4章～第8章所述的質(zhì)量管理要求也應(yīng)適用于合成RNA。此外，由于RNA易被酶降解，以下附加要求也適用于RNA。a)應(yīng)使用經(jīng)消毒的無核酸酶的器具，如容器或吸頭。b)生產(chǎn)用純水或緩沖溶液應(yīng)由受控過的純水系統(tǒng)制成。應(yīng)定期檢查所采用的純水系統(tǒng)制備的水的電導(dǎo)率。試劑應(yīng)在受控條件下在適當(dāng)?shù)脑O(shè)施中制備，以避免核酸酶的污染。此外，對于干粉狀態(tài)的產(chǎn)品，應(yīng)在打開密封容器后立即使用。試劑應(yīng)在干粉的狀態(tài)下運輸。當(dāng)產(chǎn)品以溶液形式運輸和儲存時，應(yīng)保持冷凍狀態(tài)運輸，且儲存在一80℃中。8(資料性)工藝過程檢查表表A.1工藝過程檢查表流程要求一致性章節(jié)合格不合格不適用文件和章節(jié)訂單接收過程生產(chǎn)編號客戶信息序列信息修飾純化方法訂單接收日期/交貨期訂單接收負責(zé)人產(chǎn)量生產(chǎn)過程設(shè)備管理合成合成負責(zé)人純化純化負責(zé)人定量測量定量測量負責(zé)人質(zhì)量控制過程質(zhì)量控制設(shè)備控制質(zhì)量控制負責(zé)人報告編寫報告編寫負責(zé)人運輸過程運輸負責(zé)人通用要求質(zhì)量經(jīng)理培訓(xùn)/資質(zhì)法律要求糾正措施文件控制記錄控制9(資料性)設(shè)備和裝置清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)清單設(shè)備和裝置清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)示例見表B.1。表B.1設(shè)備和裝置清單及其控制標(biāo)準(zhǔn)裝置類型規(guī)格預(yù)期用途要求檢查頻率溫控設(shè)備(培養(yǎng)箱、冰箱、冷凍機等)儲存試劑溫度穩(wěn)定性和均勻性安裝時、安裝后每兩年，以及維修后溫度檢查每天純水生產(chǎn)系統(tǒng)質(zhì)量控制電導(dǎo)率檢查每周試劑制備至少使用兩種質(zhì)量合格的可溯源的緩沖溶液進行校正每天或使用時稱重設(shè)備試劑制備零點確認和讀數(shù)檢查采用標(biāo)準(zhǔn)重量，或執(zhí)行內(nèi)置性能檢查每天或使用時移液器試劑分配校準(zhǔn)并檢查移液量的準(zhǔn)確性定期*離心機離心運轉(zhuǎn)正常，無異常響聲使用時寡核苷酸合成儀能夠通過β-氰乙基亞磷酰胺法合成寡核苷酸的裝置1),2)寡核苷酸合成檢查閥門和試劑流量定期*自動移液系統(tǒng)自動移液工作站等試劑或合成寡核苷酸等的分液檢查移液量的準(zhǔn)確性定期“高效液相色譜系統(tǒng)可安裝適當(dāng)?shù)纳V柱，配備可測量254nm～260nm的吸收波長的檢測器，可配置用于積分峰面積的記錄器和餾分收集器寡核苷酸純化檢查內(nèi)置性能和色譜柱的有效性定期*電泳設(shè)備能夠在自然條件和變性條件下進行聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳的設(shè)備以及檢測設(shè)備，如紫外線燈確認堿基長度具有分離和檢測相應(yīng)摩爾質(zhì)量標(biāo)記的能力定期*毛細管電泳系統(tǒng)能夠在自然或變性條件下分離合成寡核苷酸的裝置，并配有檢測器和記錄裝置，可對峰面積進行匯總確認堿基長度具有分離和檢測相應(yīng)摩爾質(zhì)量標(biāo)記的能力定期4分光光度計單光束或雙光束分光光度計合成寡核苷酸的得量測定內(nèi)置性能檢查定期合成寡核苷酸的得量測定用濾光片?進行校準(zhǔn)定期*考慮正常使用方式及其頻率(見ISO9001或與組織質(zhì)量管理體系相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)),確定檢驗頻率，以確保其適用于目的?！崩纾环N光學(xué)玻璃濾波器，它是為光譜光度計的校準(zhǔn)而設(shè)計的。(資料性)摩爾質(zhì)量和摩爾數(shù)的計算C.1計算摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)所需的信息計算摩爾質(zhì)量(見8.5)和摩爾消光系數(shù)所需的信息見表C.1和表C.2。這里給出的信息是常見示例的部分列表，尤其是關(guān)于帶標(biāo)簽的表單。合成寡核苷酸的摩爾數(shù)可用吸光度(用OD值表示)除以摩爾消光系數(shù)計算。pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)可按式(C.1)計算：e=(#dA×15.2)+(#dC×7.4)+(#dG×11.8)+(#dT×8.8)+(#dU×10.1)十(#I×12.1)+(#rA×14.9)+(#rC×7.55)+(#rG×13.6)+(#rU×10)式中：e—-摩爾消光系數(shù)，單位為每負一次方摩爾厘米[1/(mol·cm)];#dA——腺嘌呤(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dC——胞嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dG——鳥嘌呤(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dT——胸腺嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#dU——尿嘧啶(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#I——肌苷(脫氧核糖核酸)的數(shù)量；#rA——腺嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rC——胞嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rG——鳥嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rU——尿嘌呤(核糖核酸)的數(shù)量；#rl——肌苷(核糖核酸)的數(shù)量。如果8.7中有記錄和報告，則可使用不同的公式。IUPAC代碼摩爾質(zhì)量*pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)表C.1堿基分子的摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)(續(xù))摩爾質(zhì)量pH為7.0和260nm時的摩爾消光系數(shù)l/(mol·cm)306.15I314.18330.18摩爾質(zhì)量是水溶液中的摩爾質(zhì)量。C.2計算摩爾質(zhì)量和摩爾消光系數(shù)的附加參考位點修飾摩爾質(zhì)量摩爾消光系數(shù)激發(fā)波長nm發(fā)射波長λnmAmino—Biotin ——3’3’3’Amino——3’——3’Thiol(beforereduction)3’3’ ——3’——3’N2-aminohexyldG3’3’3’—3’ —3’—3’(資料性)采用質(zhì)量分析法驗證寡核苷酸序列本附錄提供了使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-ToF-MS)和電噴霧電離四極桿質(zhì)譜儀(ESI-Q-MS)通過離子源離子化對寡核苷酸進行堿基序列分析的示例。D.2MALDI-ToF-MS實驗方案實驗方案如下：a)樣品前處理——將每種分析物溶解在純水中，使最終濃度為50pmol/μL。取1μL樣品溶液和0.5μL基質(zhì)溶液點在MALDI板上。然后，將MALDI板風(fēng)干，加載到裝置中，最后進行質(zhì)譜分析。注：基質(zhì)溶液為20mg/mL2,4-二羥基苯乙酮(DHAP)和70mmol檸檬酸二銨的50%乙腈溶液。——試驗條件見表D.1。表D.1MALDI-ToFMS測試條件測試設(shè)備基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀特點光源：氮氣激光器(λ=337.1nm)加速電壓延遲提取針對m/z3000優(yōu)化飛行模式線性模式(陽離子檢測模式)測量范圍圖D.1合成寡核苷酸的質(zhì)譜結(jié)果示例標(biāo)引符號說明：X——質(zhì)荷比；Y——強度。圖D.1合成寡核苷酸的質(zhì)譜結(jié)果示例(續(xù))利用D.2中描述的條件，用MALDI-ToF-MS分析合成的寡核苷酸。使用原始分析軟件，圖D.1中所示的每個峰與寡核苷酸中指定位置的每個核苷酸相關(guān)。實驗方案如下：a)樣品前處理1)將每種分析物溶于純水中，終濃度為10pmol/μL。柱上的質(zhì)量負荷保持恒定，上樣量為2)流動相A:15mmolTAE緩沖液，3)流動相B:15mmTAE緩沖液，400mmolHFIP的甲醇溶液。時間/min流速/(mL/min)A/%B/%081.026.581.021.081.0b)ESI-Q-MS測試條件(見表D.3)測試設(shè)備(液相色譜)超高效液相色譜法測試設(shè)備(檢測器)質(zhì)譜儀色譜柱柱溫樣品溫度a)色譜圖b)原始質(zhì)譜c)解卷積譜標(biāo)引符號說明：X?——保留時間；X?——質(zhì)量；Y——強度。解卷積后，得到質(zhì)量為9064.5Da(+0.7Da)的母峰和一個相對強度小于6%的鈉(Na+)碎片峰，如D.4ESI-Q-MS/MS實驗方案實驗方案如下：a)樣品前處理1)本實驗采用21nt寡核苷酸(5'-UCGUCAAGCGAUUACAAGGTT-3’)(5pmol/μL水溶液)。2)流動相A:15mmolTAE緩沖液，400mmolHFIP制備的pH8.0的水溶液。3)流動相B:15mmolTAE緩沖液，400mmolHFIP的甲醇溶液。b)ESI-Q-MS/MS測試條件——測試條件見表D.4、表D.5和表D.6。時間/min流速/(mL/min)A/%B/%087.023.087.087.0測試設(shè)備(液相色譜)超高效液相色譜法測試設(shè)備(檢測器)Qtof質(zhì)譜儀色譜柱柱溫樣品溫度質(zhì)譜系統(tǒng)Qtof質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)質(zhì)量范圍400Da-3000Da模式ESI負模式毛細管出口電壓震源偏移量源溫度霧化氣溫度霧化氣流速鎖定質(zhì)量葡萄糖纖維蛋白肽B,100fmol/μL,50-50H?O-CAN,0.1%FA采用D.4中描述的條件，用ESI-Q-MS/MS分析合成的寡核苷酸。實驗使用M4-峰[在圖D.3,a中圈出的]作為母離子進行。子離子的分配是通過簡單的計算與理論質(zhì)量相匹配來y?y?標(biāo)引符號說明：X——質(zhì)量；Y——強度。圖D.3合成寡核苷酸的質(zhì)譜(ESI-Q-MS/(資料性)采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/有證標(biāo)準(zhǔn)樣品對測量儀器進行校準(zhǔn)——示例E.1總則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品可用于合成寡核苷酸測量儀器準(zhǔn)確度的校準(zhǔn)。本附錄描述了示例。E.2DNA濃度測量根據(jù)a)～c)測量DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，分光光度計獲得結(jié)果(見表E.l)。這些結(jié)果可用于分光光度計的準(zhǔn)確度評估。a)采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品：——采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品(CRM6203-a)。b)測量儀器：分光光度計；c)操作步驟：2)選擇測量模式，3)將波長設(shè)置為260nm,4)將無核酸酶的水作為參比，加入比色皿中，5)進行校準(zhǔn)，6)將樣品裝入另一個比色皿中，將樣品留在比色皿中進行3次測量，并記錄吸光度值，表E.1DNA濃度測量示例標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品測量值認證機構(gòu)建議值OD2so濃度/(ng/μL)標(biāo)準(zhǔn)值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6203-a-A0.1241CRM6203-a-G0.1398CRM6203-a-T0.1146注：截至2017年6月，CRM6203系列尚未銷售。不過，后續(xù)產(chǎn)品CRM6205系列已上市。此表中的數(shù)據(jù)等同于CRM6205系列。E.3RNA濃度的測量——例1根據(jù)a)～c)測量RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，分光光度計獲得結(jié)果(見表E.2)。結(jié)果可用于分光光度計的準(zhǔn)確度評估。a)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品。b)測量儀器：分光光度計。c)操作步驟：1)打開設(shè)備(自動校準(zhǔn)開始);3)將波長設(shè)置為260nm,模式設(shè)置為“吸光度”;4)將不含核酸酶的水作為參比物，加入比色皿中；5)按“0A/100%T”進行自動校準(zhǔn)；6)將樣品裝入另一個比色皿，然后按測量鍵。將樣品留在比色皿中進行3次測量，并記錄吸光度值；7)根據(jù)吸光度、摩爾消光系數(shù)、堿基組成和OD值，計算RNA濃度(摩爾消光系數(shù)見附錄C)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品測量值認證機構(gòu)建議值A(chǔ)260濃度/(ng/μL)標(biāo)準(zhǔn)值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6204500-ACRM6204500-BE.4RNA濃度的測量——例2RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度測量的另一個例子如下(見表E.3)。結(jié)果可用于分光光度計的準(zhǔn)確度評估。a)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品。注：采用RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品(CRM6204-a)。b)測量儀器：分光光度計。2)選擇“RNA”作為測量對象，加入2μL水，然后進行空白測量；3)擦拭測量孔，取2μL樣品，進行測量；記錄260nm處的吸光度值和RNA濃度，取3次測量表E.3RNA濃度測量示例標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品測量值認證機構(gòu)建議值A(chǔ)260濃度/(ng/μL)標(biāo)準(zhǔn)值/(ng/μL)擴展不確定度/(ng/μL)CRM6204500-C0.949CRM62041000-A69.44.9CRM62041000-B69.8GB/T43629.1—2023/ISO206(資料性)T值的計算方法F.1總則本附錄描述了T。值的計算方法。F.2算法選擇示例合成核苷酸T。值計算的算法選擇模式示例如圖F.1所示。Wallace規(guī)則如果Tm<20℃,Wallace規(guī)則重新計算合成核酸最近鄰算法如果20℃<Tm<80完成如果80℃<Tm,重新計算GC%法標(biāo)記或報告圖F.1算法選擇當(dāng)使用最近鄰算法計算的T。值小于20℃(<20℃)時，用Wallace規(guī)則重新計算。當(dāng)使用最近鄰算法計算的Tm值等于或大于80℃(≥80℃)時，使用GC%法進行重新計算。F.3最近鄰算法△H——雜化物的最近鄰焓變化之和，單位為千卡每摩爾(kcal/mol)1(見表F.1);-10.8——△S(起始常數(shù)),單位為卡路里每摩爾開爾文[cal/(mol·K)];△S——雜交子的最近鄰熵變之和，單位為卡路里每摩爾開爾文[cal/(mol·K)](見表F.1);R——氣體常數(shù)，值為1.987,單位為卡路里每千卡摩爾[cal/(K·mol)];[Na+]——Na+的摩爾濃度，單位為摩爾每升(mol/L)(標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)為50mmol/L)。1)kcal為非法定計量單位，1kcal=4.19kJ。GB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020相互作用“kcal/molcal/(mol·K)AA/TT—9.1-24AT/TA一8.6—23.9TA/AT-6-16.9CA/GT-5.8—12.9GT/CA一6.5—17.3CT/GA-7.8—20.8GA/CT—5.6—13.5CG/GC—11.9—27.8GC/CG—11.1—26.7GG/CC-11—26.65’→3’3’-5’AT/TA例如，AC(5’→3’)的△H為一6.5kcal/mol,對應(yīng)于GT/CA的值。F.4Wallace規(guī)則公式(F.2)如下：式中：Tm=2×(A+T)+4×(G+C)A,T,C,G——每種核苷酸的數(shù)目。F.5%GCmethod氣相色譜法[Na+]——Na+的物質(zhì)的量濃度，單位為摩爾每升(mol/L,標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)為50mmol/L);Xg,Xc——G和C的摩爾分數(shù)；L——促成雙鏈形成的核苷酸數(shù)；F——甲酰胺的物質(zhì)的量濃度(標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)為0)。|ISOGuide30Referencematerials—Selecte[5]ISO/IEC17025Getories[6]ISO24276:2006Foodstuffs—Methodsofanorgani