蒲公英有效成分質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程

1DBXX/XXXXX—XXXX本規(guī)程規(guī)定了蒲公英樣本的采集、處理方法、成分提取方法、成分檢測(cè)方法、質(zhì)量評(píng)級(jí)方法及標(biāo)準(zhǔn)本規(guī)程適用于蒲公英樣本有效成分含量的綜合評(píng)價(jià)和質(zhì)量評(píng)級(jí)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本規(guī)程必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本規(guī)程；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)程?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（一部）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程3.1蒲公英本規(guī)程中的蒲公英為菊科植物蒲公英（TaraxacummongolicumHand.-Mazz.）、堿地蒲公英（TarxacumborealisinenseKitam.）或其他蒲公英同屬（Taraxacum）植物。3.2樣本和樣本采集本規(guī)程中的樣本按《中華人民共和國(guó)藥典》為蒲公英干燥全草部分。本規(guī)程中的樣本為按照規(guī)定方式采集的一定生長(zhǎng)條件下的蒲公英樣本，樣本采集后應(yīng)注明采收地點(diǎn)、時(shí)間、批次、部位、是否混樣等標(biāo)識(shí)。4樣本處理樣本洗凈、除雜，在60℃通風(fēng)條件下烘干，粉碎，過6號(hào)篩，隨后移至干燥器中，備用。得到的干樣品按《中華人民共和國(guó)藥典》通則0832第二法測(cè)定，含水量不高于13%。5有效成分提取5.1單咖啡酰酒石酸（C13H12O9）2DBXX/XXXXX—XXXX稱取0.5g～1g的樣品粉末，放入50mL具塞試管中，加入15mL纖維素酶水溶液（纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，酶活性不低于2000U/g，pH=4旋緊并于60℃條件下震蕩水浴30min，隨后加入15mL甲醇轉(zhuǎn)移至超聲波水浴中，水浴溫度60℃~70℃,超聲波功率100W～400W，超聲時(shí)間30min，全程旋緊蓋子，如果水分散失則用50%甲醇溶液按總質(zhì)量補(bǔ)足。待試管冷卻至室溫后，將提取液用0.22μm~0.45μm濾膜過濾注入進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。5.2綠原酸（C16H18O9）照5.1中的方法提取蒲公英綠原酸。5.3咖啡酸（C9H8O4）按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中的蒲公英供試品溶液的制備方法提取。5.4菊苣酸（C22H18O12）按《中華人民共和國(guó)藥典》2020版中的蒲公英供試品溶液的制備方法提取。6有效成分含量測(cè)定6.1單咖啡酰酒石酸（C13H12O9）照《中華人民共和國(guó)藥典》高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。儀器設(shè)備為安捷倫高效液相色譜儀1200系列或同等或以上性能的色譜儀；色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑且具有一定耐酸（水）能力（MarsODS-AQ4.6mm×250mm，5μm）或其他同等性能的色譜柱；以甲醇（A）和體積分?jǐn)?shù)0.2%的磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，其中B的比例為60%～70%，進(jìn)樣量5μL，流速1mL/min，等度洗脫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)327nm。理論板數(shù)按單咖啡酰酒石酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。6.2綠原酸（C16H18O9）照6.1中的方法測(cè)定蒲公英綠原酸含量，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。6.3咖啡酸（C9H8O4）按《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中的蒲公英咖啡酸含量測(cè)定方法測(cè)定。6.4菊苣酸（C22H18O12）按《中華人民共和國(guó)藥典》2020版中的蒲公英菊苣酸含量測(cè)定方法測(cè)定。7蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)3DBXX/XXXXX7.1有效成分含量分級(jí)按蒲公英有效成分含量對(duì)照表1劃分各成分含量的級(jí)別。表1蒲公英各有效成分含量（%）對(duì)應(yīng)的級(jí)別指標(biāo)/級(jí)別12345單咖啡酰酒石酸≥0.400≥0.300≥0.200≥0.100<0.100綠原酸≥0.250≥0.150≥0.085≥0.030<0.030咖啡酸≥0.045≥0.035≥0.025≥0.015<0.015菊苣酸≥0.750≥0.650≥0.500≥0.300<0.3007.2蒲公英質(zhì)量指數(shù)按蒲公英各有效成分含量的級(jí)別計(jì)算蒲公英質(zhì)量指數(shù)。iQI=4×5式中：QI－蒲公英質(zhì)量指數(shù)，%；Gi—各有效成分對(duì)應(yīng)的級(jí)別；4—有效成分指標(biāo)總數(shù)量；5—蒲公英質(zhì)量級(jí)數(shù)值。7.3蒲公英質(zhì)量等級(jí)評(píng)價(jià)以蒲公英質(zhì)量指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將蒲公英質(zhì)量劃分為5個(gè)等級(jí)，見表2。表2質(zhì)量指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量等級(jí)質(zhì)量指數(shù)（QI，%）成分含量1QI≤25超等225<QI≤45高345<QI≤60460<QI≤75合格575<QI≤100低4DBXX/XXXXX—XXXX（資料性）蒲公英有效成分質(zhì)量等級(jí)評(píng)定說明A.1蒲公英主要成分指標(biāo)的確定《中華人民共和國(guó)藥典》2020版規(guī)定了蒲公英飲片中菊苣酸含量不得少于0.3%，藥材中菊苣酸含量不得少于0.45%；2015版及之前版本則規(guī)定咖啡酸含量不得少于0.02%。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》對(duì)大量蒲公英樣本數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)單咖啡酰酒石酸和綠原酸也是共有的優(yōu)勢(shì)成分。這些成分均為咖啡酸的衍生物屬于酚酸類，在功效上具有相似性，在提取及含量檢測(cè)方法上也具有一致性，因此確定以上述四種成分的含量為依據(jù)，綜合評(píng)價(jià)蒲公英的質(zhì)量。A.2蒲公英成分級(jí)別的劃分目前河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所已在河北省范圍內(nèi)不同的生長(zhǎng)季節(jié)、種植環(huán)境等條件下采集了蒲公英材料200余份，并對(duì)這些材料成分進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)一部分材料委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、譜尼測(cè)試公司共同檢測(cè)，檢測(cè)樣本共計(jì)578份，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸等4種成分的含量范圍是0.023～0.642%、0.001～0.534%、0.001～0.060%、0.018~2.173%，平均含量分別為0.170%、0.083%、0.015%和0.383%。隨后又進(jìn)一步頻次統(tǒng)計(jì)、偏度分析、聚類分析等綜合統(tǒng)計(jì)分析，以平均數(shù)、眾數(shù)和中位數(shù)為參考值，結(jié)合《藥典》、文獻(xiàn)報(bào)道以及實(shí)際需要等綜合確定上下浮動(dòng)比例，據(jù)此按照含量從高到底劃分為5級(jí)，最高為1級(jí)。A.3蒲公英綜合質(zhì)量等級(jí)的評(píng)定由于所有《中華人民共和國(guó)藥典》版本中均規(guī)定一種成分，即咖啡酸或菊苣酸的含量為評(píng)價(jià)蒲公英質(zhì)量的依據(jù)，然而目前研究已經(jīng)證實(shí)蒲公英功效成分不止一種，對(duì)于僅憑一種成分判斷蒲公英質(zhì)量存在爭(zhēng)議，多指標(biāo)評(píng)價(jià)蒲公英質(zhì)量已經(jīng)成為共識(shí)。通過大量樣本的統(tǒng)計(jì)分析確定蒲公英的主要優(yōu)勢(shì)成分，然后再根據(jù)各主要成分的貢獻(xiàn)值綜合確定蒲公英質(zhì)量，這樣就避免了單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的偏頗性。蒲公英成分復(fù)雜，它的藥效是多種成分共同作用的結(jié)果，目前仍然沒有研究明確指出蒲公英的具體成分及其具體功效，對(duì)于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論來說這樣的研究也沒有實(shí)際意義。但總體上主要成分含量高的蒲公英總體藥效也相對(duì)較好。因此在蒲公英復(fù)雜的成分中確定含量相對(duì)優(yōu)勢(shì)的成分，能夠在一定程度上反映蒲公英的總體質(zhì)量，也能夠減少蒲公英質(zhì)量評(píng)價(jià)的工作量。綜合質(zhì)量評(píng)定的原則體現(xiàn)了“高標(biāo)準(zhǔn)”的要求，具體操5DBXX/XXXXX—XXXX作為將質(zhì)量分為5級(jí)，1級(jí)的蒲公英數(shù)量最少質(zhì)量最高，而大部分蒲公英劃入到2-5級(jí)。按概率統(tǒng)計(jì)，質(zhì)量1～5級(jí)的概率分別為0.8%、18