小鼠免疫抑制模型的建立及其免疫功能檢測

論文免疫抑制模型的建立及其免疫功能檢測學(xué)院：臨床醫(yī)學(xué)院專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)七年制學(xué)號(hào)：姓名：小鼠免疫抑制模型的建立及其免疫功能檢測摘要：目的利用環(huán)磷酰胺（CTX）構(gòu)建小鼠的免疫抑制模型，并檢測其免疫功能。方法用OVA作為抗原免疫小鼠，再用CTX進(jìn)行免疫抑制，加強(qiáng)免疫后，進(jìn)行免疫功能檢測。結(jié)果OVA抗原刺激的小鼠均有免疫反應(yīng)，注射了CTX的小鼠出現(xiàn)免疫功能下降，但抑制效果不佳，仍可檢測到免疫功能。結(jié)論小鼠免疫抑制模型未建立成功，但是可證實(shí)給正常小鼠注射CTX可以減弱其免疫功能。關(guān)鍵詞：環(huán)磷酰胺免疫抑制模型免疫功能檢測TheestablishmentofimmunosuppressivemodelandimmunefunctiontestingWenXingguiAbstract：ObjectiveUsingcyclophosphamide(CTX)constructsamodelofimmunosuppressivemice,andtesttheimmunefunction.MethodUsingOVAasantigenstimulatemice,andinhibitthefunctionofimmunesystem,afterstrengthentheimmuneresponse,testtheimmunefunction.ResultThereareimmuneresponsesinmicewhicharestimulatedbyOVA,butthere’snoimmuneresponseinthemiceinjectedCTX.ConclusionInjectingCTXtonormalmicecanconstructimmunosuppressivemodel.Keywords：CTX，Immunosuppressivemodel，Immunefunctiontesting環(huán)磷酰胺(cyclophosphamideCTX)作為一種細(xì)胞毒化療藥物，同時(shí)也屬于烷化劑類免疫抑制劑，其作用主要是破壞DNA的結(jié)構(gòu)，從而阻斷其復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而在免疫毒理學(xué)中，環(huán)磷酰胺是制備免疫抑制模型的常用藥物[1]。本實(shí)驗(yàn)利用環(huán)磷酰胺的免疫抑制作用，對(duì)ICR小鼠進(jìn)行免疫抑制，然后通過檢測其細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、吞噬細(xì)胞功能檢測其免疫功能，檢驗(yàn)免疫抑制模型是否建立成功。1.材料與方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ICR小鼠，♀，20-22g，清潔級(jí)，購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。1.1.2主要試劑：CTX（山西普德藥業(yè)有限公司）、生理鹽水、以氫氧化鋁為佐劑的卵清蛋白（OVA）抗原活性物質(zhì)、5%FCS-IMDM培養(yǎng)液、刀豆蛋白（ConA）（10μg/ml)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)液（2%冰醋酸）、MTT（5mg/ml)、二甲亞砜（DMSO)、磷酸鹽緩沖液（PBS）、PBS-Tween20洗液、BSA封閉液、酶標(biāo)抗體（HRP-GaM）、顯色底物、終止液（H2SO4）、3%淀粉溶液、印度墨汁1.1.3主要儀器：無菌96孔培養(yǎng)板、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃5%CO2)、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、超凈臺(tái)、水浴箱、稀釋板、酶標(biāo)板、培養(yǎng)箱43℃1.2方法1.2.1免疫抑制模型的建立將清潔級(jí)ICR小鼠按圖1隨機(jī)分為四組。初次免疫，第1天，NS-NS、CTX-NS組按0.5ml/只注射生理鹽水（NS），NS-OVA、CTX-OVA組按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3。分別在第8、10、12、14天給CTX-OVA、CTX-NS組按100mg/kg注射CTX進(jìn)行免疫抑制。第15天，給注射NS-NS、CTX-NS組按0.5ml/只注射NS；NS-OVA、CTX-OVA組按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3進(jìn)行加強(qiáng)免疫。（以上注射方法均以頭頸部皮下三點(diǎn)注射0.25ml，腹部注射0.25ml。）NSNSNSOVACTXNSOVA圖1小鼠分組示意圖1.2.2細(xì)胞免疫功能檢測（淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)）單細(xì)胞懸液的制備：小鼠摘眼球取血，室溫放置2h后，離心分離血清，4℃保存?zhèn)溆?。小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾和胸腺組織(各1/2)，分別放入預(yù)先盛有3mlIMDM培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕壓組織，將其搗碎。然后用1000μl加樣器隔著紗布將細(xì)胞懸液吸出，放入1.5mlEP管中，做好標(biāo)記。細(xì)胞計(jì)數(shù)：分別取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出20μl加到EP管中，加入980μl計(jì)數(shù)液，混勻后在顯微鏡下計(jì)數(shù)。調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，所需量為1ml。設(shè)原細(xì)胞濃度為X，需要的細(xì)胞懸液體積為Aml,可按公式：X/ml×Aml=1ml×1×107/ml計(jì)算出配比體積。在稀釋前一定將原細(xì)胞懸液混勻，否則細(xì)胞長時(shí)間沉淀使細(xì)胞數(shù)不準(zhǔn)。細(xì)胞培養(yǎng)：按圖2所示在96孔培養(yǎng)板上加樣，將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37℃5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)。MTT摻入：（48-72h后）：在終止培養(yǎng)前2小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。每孔內(nèi)加入MTT（5mg/ml)10μl，加完后輕輕搕板，使MTT和細(xì)胞混勻。在37℃5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)后，輕輕吸棄上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。加入100μl二甲亞砜（DMSO)，將顆粒溶解。結(jié)果測定：結(jié)果測量：用酶標(biāo)儀測定光密度值A(chǔ)570nm（用空白孔調(diào)零），記錄結(jié)果。結(jié)果判定：SI（刺激指數(shù)）=ConA刺激孔A值/對(duì)照孔A值。1-34-67-910-12Cspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlD

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlEspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlF

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlNSNS-NSNS-OVAACTX-NSCTX-OVA圖2細(xì)胞培養(yǎng)加樣示意圖（所加細(xì)胞懸液、IMDM、ConA體積均為100μl）1.2.3體液免疫功能—B細(xì)胞功能檢測1.2.3.1雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（檢測抗OVA抗體）①標(biāo)記：用玻璃筆在載玻片正面標(biāo)記好小鼠所屬組別。②制備瓊脂凝膠：1.5%瓊脂在微波爐內(nèi)加熱至完全溶解。③鋪膠：將刻度吸管預(yù)熱后，用刻度吸管吸取5ml瓊脂加在載玻片表面，冷卻15min后形成均勻的瓊脂凝膠。④倍比稀釋抗血清：取4個(gè)酶聯(lián)管，做好標(biāo)記；先加入生理鹽水50ul/管；在第一管中加入50ul抗血清（為之前4℃冷藏的分離血清），混勻后吸出50ul加入第二管，依次類推，進(jìn)行倍比稀釋，稀釋度依次為1:2，1:4，1:8及1:16。⑤打孔：待瓊脂凝固后，按照打孔紙樣打孔，每張載玻片打兩組梅花孔。⑥加樣：按圖3所示加樣，Ag和Ab每孔加滿為止（將加樣器頭插入孔底，緩慢加入液體，直到孔滿）。⑦孵育：放入濕盒，37℃擴(kuò)散24小時(shí)。生理鹽水1:1生理鹽水1:1Ag(OVA0.1mg/ml）1:161:2待測血清（不同稀釋度）1:81:4圖3雙向免疫擴(kuò)散加樣示意圖1.2.3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）①包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原(OVA）稀釋（10μg/ml)。100μl/孔加入聚苯乙烯酶標(biāo)板中。②封閉：棄去孔內(nèi)溶液，加入150μl/孔2%BSA（封閉液），43℃，60mins。③加樣：棄去封閉液，按圖4加倍比稀釋的待測免疫血清100μl/孔，43℃孵育40mins；孵育結(jié)束后，用PBS-T洗液加滿孔，每次3min，洗三次，在吸水紙上排干液體。④酶抗：酶標(biāo)抗體(HRP-羊抗鼠IgG)，100μl/孔，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次3min，在吸水紙上排干液體。⑤顯色：于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的底物溶液100μl/孔，室溫下避光顯色。⑥終止：加50μl/孔2M硫酸(終止液)。⑦判定：肉眼觀察：與陰性對(duì)照孔相比有明顯呈色反應(yīng)的為陽性孔，相對(duì)應(yīng)的最高抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。酶標(biāo)儀測量：490nm濾光片下測光吸收值(A)，與陰性對(duì)照孔A值相比其比值≥2，相對(duì)應(yīng)的最高抗體稀釋度為該抗體的效價(jià)。（操作中只采用了肉眼觀察方法。）圖4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)加樣示意圖1.2.4吞噬細(xì)胞功能檢測（小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬印度墨汁試驗(yàn)）實(shí)驗(yàn)前2天，給全部小鼠腹腔注射5％淀粉溶液1ml。頸椎脫臼處死小鼠，剪開小鼠腹部皮膚，用鑷子提起腹膜，用剪刀剪開一小口，用1000μl加樣器向腹腔打入2ml培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗腹腔，吸出腹腔液放入EP管中。每組樣品取1張載玻片，做好標(biāo)記。分別加兩滴100ul腹腔液，其中一滴加5ul墨汁，置濕盒中，37℃孵育1h。用生理鹽水洗掉未貼壁細(xì)胞和墨汁，蓋好蓋玻片后，顯微鏡下觀察，用40倍鏡查找觀察100個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)數(shù)其中未吞噬墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)、吞噬了墨汁的巨噬細(xì)胞數(shù)，計(jì)算吞噬百分率。吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬細(xì)胞數(shù)／100×100％。小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁圖5小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬印度墨汁試驗(yàn)加樣示意圖 結(jié)果2.1淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果用酶標(biāo)儀測定96孔培養(yǎng)板光密度值A(chǔ)570nm（用空白孔調(diào)零），記錄結(jié)果并計(jì)算刺激指數(shù)，SI（刺激指數(shù)）=ConA刺激孔A值/對(duì)照孔A值，所得結(jié)果如表1所示。由所得數(shù)據(jù)計(jì)算平均值得：脾淋巴細(xì)胞：SI（NS-NS）為=average(B3:B6)1.32125，SI(NS-CTX)為=average(C3:C6)0.97275，SI(NS-OVA)為=average(D3:D6)1.3885，SI(CTX-OVA)為=average(E3:E6)1.05525；胸腺淋巴細(xì)胞：SI（NS-NS）為=average(F3:F6)1.11825，SI(NS-CTX)為=average(G3:G6)0.9845，SI(NS-OVA)為=average(H3:H6)1.13875，SI(CTX-OVA)為=average(I3:I6)1.02225。由數(shù)據(jù)結(jié)果可得，抑制組的抑制效果雖然不好但是與對(duì)照組相比值明顯小了，說明CTX對(duì)淋巴細(xì)胞功能有抑制作用。SpleenThymusNS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVANS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11.7551.0431.6151.1751.1340.7441.2681.20821.020.951.451.011.0691.0631.0240.99631.230.961.241.151.1811.1211.1381.04441.2800.9381.2490.8861.0891.0101.1250.841平均值=average(B3:B6)1.32125=average(C3:C6)0.97275=average(D3:D6)1.3885=average(E3:E6)1.05525=average(F3:F6)1.11825=average(G3:G6)0.9845=average(H3:H6)1.13875=average(I3:I6)1.02225表1淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果2.2體液免疫功能檢測2.2.1雙向免疫試驗(yàn)結(jié)果抗原抗體在瓊脂凝膠中濕盒37℃擴(kuò)散48h后檢查結(jié)果，結(jié)果如表2，NS-NS組、NS-CTX組結(jié)果均為陰性，NS-OVA組最高稀釋倍數(shù)為1:16，而CTX-OVA組出現(xiàn)兩個(gè)陽性數(shù)據(jù)，與理論結(jié)果不符，說明免疫抑制模型建立為成功，但從所得數(shù)據(jù)結(jié)果可知免疫功能減弱。NS-OVA組結(jié)果如圖6所示。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1陰性陰性1:16陰性2陰性陰性1:41:23陰性陰性1:81:14陰性陰性1:8陰性表2雙向免疫擴(kuò)散結(jié)果NS1:1NS1:11:161:21:161:21:81:41:81:4NS-OVACTX-OVA圖6組1雙向免疫擴(kuò)散結(jié)果示意圖2.2.2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶標(biāo)板顯色結(jié)果如表3所示僅兩個(gè)數(shù)據(jù)組有抑制效應(yīng)，但并不理想。而從抗體效價(jià)的數(shù)據(jù)看，各組稀釋倍數(shù)均較高，說明各對(duì)照組實(shí)驗(yàn)較成功。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11:160陰性1:20480陰性2陰性1:1601:819201:128031:6401:6401:102401:16041:12801:801:20480陰性表3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果2.3吞噬細(xì)胞功能檢測顯微鏡下觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)并計(jì)算吞噬細(xì)胞吞噬率所得結(jié)果如表5所示，雖然有幾組異常數(shù)據(jù)，且抑制組數(shù)據(jù)結(jié)果也提示一直模型沒有建立成功，但由平均值可以看出與對(duì)照組相比，抑制組的巨噬細(xì)胞吞噬百分比顯然低，可以說明雖然沒有得到抑制效果，但是巨噬細(xì)胞功能被明顯減弱。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1100%100%無細(xì)胞0265%50%59%53%331%8%25%23%476%35%72%43%平均值=average(B2:B5)68%=average(C2:C5)48.25%=average(D3:D5)52%=average(E2:E5)29.75%表4吞噬細(xì)胞功能檢測結(jié)果3.討論環(huán)磷酰胺作為一種免疫抑制劑，已有大量研究表明其能抑制動(dòng)物的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，造成動(dòng)物的免疫抑制[2-4]。構(gòu)建免疫抑制模型時(shí)，環(huán)磷酰胺可抑制各種動(dòng)物的體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，機(jī)體免疫功能下降可表現(xiàn)在諸多方面[5]。本實(shí)驗(yàn)利用其免疫抑制作用多小鼠進(jìn)行免疫抑制建立免疫抑制模型，并通過對(duì)淋巴細(xì)胞功能、體液免疫功能及吞噬細(xì)胞功能的檢測來檢驗(yàn)免疫抑制模型的建立是否成功。有研究表明，環(huán)磷酰胺可引起小鼠脾T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增值能力下降[6]。本實(shí)驗(yàn)中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果顯示抑制組脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)小于對(duì)照組，提示環(huán)磷酰胺對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖有抑制作用，結(jié)果與研究相符，且胸腺中抑制組淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)也小于對(duì)照組，共同提示淋巴細(xì)胞的增值能力被抑制。由體液免疫功能的檢測結(jié)果可得雖然在抑制組中仍可檢測到抗體效價(jià)，但與對(duì)照組相比較，可檢測到的抗體稀釋倍數(shù)遠(yuǎn)小于對(duì)照組，提示B細(xì)胞增殖被抑制，產(chǎn)生抗體的能力降低。因此環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞確有毒性作用，可抑制其增殖。雖此次實(shí)驗(yàn)的抑制模型未建立成功，但證實(shí)了環(huán)磷酰胺對(duì)免疫功能有抑制作用。有實(shí)驗(yàn)證明，以20mg/kg體重的CP每日給荷瘤鼠，連續(xù)7次，巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)沒有明顯變化[7],本實(shí)驗(yàn)中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能檢測結(jié)果中，抑制組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分比明顯低于對(duì)照組，且有數(shù)據(jù)表明吞噬百分比為0，提示巨噬細(xì)胞功能降低，此結(jié)果與相關(guān)研究相符。此次試驗(yàn)的免疫抑制模型歲構(gòu)建不成功，但是仍從各細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能及固有免疫功能三個(gè)方面證實(shí)了環(huán)磷酰胺對(duì)免疫系統(tǒng)具有抑制作用。對(duì)于此次試驗(yàn)失敗的原因，可能有幾點(diǎn)原因，一是實(shí)驗(yàn)規(guī)模有限，數(shù)據(jù)不具有統(tǒng)計(jì)意義；二是操作不夠嚴(yán)格規(guī)范，過程中可能有污染，丟失等造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論結(jié)果偏離；三是由于條件有限，各實(shí)驗(yàn)儀器、試劑等規(guī)格不夠精確，造成實(shí)驗(yàn)測量、本身反應(yīng)等有誤差，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不符。本次實(shí)驗(yàn)雖未能成功建立小鼠免疫抑制模型，但在一定程度上證實(shí)了環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能起到了一定抑制作用。4.參考文獻(xiàn)：[1]PELAEZB,CAMPILLOJA,LOPEZ一ASENJOJA,etal.Cyclophosphamideinduces