微生物遺傳與菌種選育新

關(guān)于微生物遺傳與菌種選育新遺傳（heredity

inheritance）：親代與子代相似變異（variation）：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一第2頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（1）遺傳型（genotype）生物的全部遺傳因子及基因又稱基因型，指某一生物個體所含有的全部遺傳因子即基因組（genome）所攜帶的遺傳信息。遺傳型是一種內(nèi)在可能性或潛力，其實質(zhì)是遺傳物質(zhì)上所負(fù)載的特定遺傳信息第3頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）表型（phenotype）具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。又稱表現(xiàn)型，指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境下通過代謝和發(fā)育而得到的具體表現(xiàn)。第4頁,共141頁，2024年2月25日，星期天表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。第5頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（3）變異遺傳型變異（基因變異、基因突變）：指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-5-10-10）第6頁,共141頁，2024年2月25日，星期天表型飾變：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。（4）飾變（modification）第7頁,共141頁，2024年2月25日，星期天表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；重新將溫度降25℃，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。斜面培養(yǎng)液體培養(yǎng)第8頁,共141頁，2024年2月25日，星期天微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系

很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。

對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強。第9頁,共141頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883－－1889年間Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。FCrick在研究DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)第10頁,共141頁，2024年2月25日，星期天基因?qū)W說：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實驗對象進(jìn)行的三個著名實驗肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗噬菌體感染試驗病毒的拆開與重建試驗人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。第11頁,共141頁，2024年2月25日，星期天一、3個經(jīng)典實驗

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗

最早進(jìn)行轉(zhuǎn)化（transformation）實驗的是F.Griffith（1928年），他以Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌，舊稱“肺炎雙球菌”）作為研究對象。第12頁,共141頁，2024年2月25日，星期天光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無莢膜菌落粗糙無毒不致病實驗材料：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗第13頁,共141頁，2024年2月25日，星期天說明：加熱殺死的S型細(xì)菌中有一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它通過某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞，并使R型細(xì)菌獲得表達(dá)S型莢膜形狀的遺傳特性1928年Griffith進(jìn)行的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗（1）動物實驗第14頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）細(xì)菌培養(yǎng)試驗第15頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗第16頁,共141頁，2024年2月25日，星期天Avery在四十年代以更精密的實驗設(shè)計重復(fù)了以上實驗第17頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（1）從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA，蛋白質(zhì)，莢膜多糖等）（2）對各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明：S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的DNA是遺傳因子。第18頁,共141頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

1952年，A.D.Hershey和M.Chase發(fā)表了證明DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的著名實驗

——噬菌體感染實驗（二）噬菌體感染實驗（p188）第20頁,共141頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)只含S不含PDNA只含P不含S原理步驟1：用含同位素Ｓ35,

P32的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)大腸桿菌2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打上S35

、P32標(biāo)記第21頁,共141頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共141頁，2024年2月25日，星期天35S－蛋白質(zhì)外殼的噬菌體32P－DNA核心的噬菌體第23頁,共141頁，2024年2月25日，星期天在DNA中存在著包括合成蛋白質(zhì)外殼在內(nèi)的整套遺傳信息。第24頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（二）噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性第25頁,共141頁，2024年2月25日，星期天沉淀中含25%放射性以35S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實驗（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性第26頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實驗。（三）植物病毒的重建實驗（p189）第27頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

植物病毒蛋白質(zhì)和RNA可以人為地分開,同時又可把它們重新組合成具感染性的病毒.植物病毒的重建實驗

甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒

第28頁,共141頁，2024年2月25日，星期天TMVHRVHRVTMV原始株拆開重建感染分離純化

植物病毒的重建實驗

第29頁,共141頁，2024年2月25日，星期天遺傳物質(zhì)類型核染色體核外染色體真核生物細(xì)胞器原核生物質(zhì)粒二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式第30頁,共141頁，2024年2月25日，星期天核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質(zhì)?！痹松锏馁|(zhì)粒

線粒體細(xì)胞質(zhì)基因 葉綠體 中心體 動體共生生物：卡巴顆粒酵母菌的2

m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒第31頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（一）核酸存在的7個水平細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:

原核與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:

倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平：信息單位,起始和終止,核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基第32頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（二)原核生物的質(zhì)粒（p194）功能：帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等，并可進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。結(jié)構(gòu)與大小：質(zhì)粒通常以共價閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子狀態(tài)存在于細(xì)胞中。約為1～1000kb，上面攜帶有數(shù)個到數(shù)十個甚至上百個基因。定義：存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中，獨立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳因子。第33頁,共141頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒核外環(huán)狀小型DNA獨立復(fù)制穩(wěn)定遺傳F因子與有性接合有關(guān)種類

R因子與抗藥性有關(guān)COL編碼免疫蛋白Ti質(zhì)粒誘癌質(zhì)粒降解性質(zhì)粒：編碼降解有害物質(zhì)的酶用途基因工程中作為目的基因載體質(zhì)粒原核生物遺傳物質(zhì)存在的另一種方式第34頁,共141頁，2024年2月25日，星期天基因突變突變與育種第二節(jié)基因突變和誘變育種第35頁,共141頁，2024年2月25日，星期天一、基因突變（genemutation）一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變簡稱突變，是變異的一種，泛指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）第36頁,共141頁，2024年2月25日，星期天從自然界分離到的菌株，簡稱野生型。

野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）第37頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。第38頁,共141頁，2024年2月25日，星期天突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營養(yǎng)缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）第39頁,共141頁，2024年2月25日，星期天1.

營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營養(yǎng)或其前體物（precursor）才能正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型。第40頁,共141頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——十分重要表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長第41頁,共141頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC第42頁,共141頁，2024年2月25日，星期天hisC－缺陷型hisC＋野生型第43頁,共141頁，2024年2月25日，星期天2.

抗性突變型（resistantmutant）

指野生型菌株因發(fā)生基因突變，使菌株對對某化學(xué)藥物或致死物理因子，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的抗性變異類型。第44頁,共141頁，2024年2月25日，星期天特點：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得——在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）第45頁,共141頁，2024年2月25日，星期天表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”表示。strr對鏈霉素的抗性strs對鏈霉素的敏感性第46頁,共141頁，2024年2月25日，星期天抗性突變菌株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——極為重要第47頁,共141頁，2024年2月25日，星期天3.

條件致死突變型（conditionallethalmutant）

某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下卻無法生長、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。第48頁,共141頁，2024年2月25日，星期天在25℃下可感染其E.coli宿主在37℃卻不能感染Ts突變株即溫度敏感突變株（temperaturesensitivemutant，Tsmutant）是一類典型的條件致死突變株。E.coli的某些菌株在37℃下正常生長不能在42℃下生長某些T4噬菌體突變株第49頁,共141頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)生Ts突變的原因在某特定的溫度下具有功能在另一溫度（一般為較高溫度）下則無功能突變使某些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，第50頁,共141頁，2024年2月25日，星期天4.

形態(tài)突變型（morphologicalmutant）指由于突變而引起的個體或菌落形態(tài)的非選擇性變異。個體變異孢子有無、孢子顏色、鞭毛有無或莢膜有無等的突變菌落變異菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突變第51頁,共141頁，2024年2月25日，星期天特點：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。第52頁,共141頁，2024年2月25日，星期天舉例：菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活重組子菌落白色非重組子菌落蘭色第53頁,共141頁，2024年2月25日，星期天5.

抗原突變型（antigenicmutant）指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，一般也屬非選擇性突變。例如，細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。第54頁,共141頁，2024年2月25日，星期天6.

產(chǎn)量突變型（metabolitequantitativemutant）通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱為產(chǎn)量突變型?！罢冎辍保╬lus-mutant）產(chǎn)量高于原始菌株“負(fù)變株”（minus-mutant）產(chǎn)量低于原始菌株第55頁,共141頁，2024年2月25日，星期天篩選高產(chǎn)正變株的工作對生產(chǎn)實踐極其重要在育種實踐上誘變育種重組育種遺傳工程育種第56頁,共141頁，2024年2月25日，星期天突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細(xì)胞在1億次細(xì)胞分裂中，會發(fā)生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示例如，一個含108個細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個細(xì)胞時，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）第57頁,共141頁，2024年2月25日，星期天基因突變的7個共同點（1）自發(fā)性各種性狀的突變，可在無人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。（三)基因突變的特點（p200）第58頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）非對應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間無直接的對應(yīng)關(guān)系。這是突變的一個重要特點，也是容易引起爭論的問題（3）稀有性自發(fā)突變雖可隨時發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的，一般在10-6～10-9間。第59頁,共141頁，2024年2月25日，星期天某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨立性第60頁,共141頁，2024年2月25日，星期天基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變（forwardmutation），也可發(fā)生相反的回復(fù)突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩(wěn)定性第61頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段1.誘發(fā)突變（inducedmutation）凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。（五）基因突變及機制

p202第62頁,共141頁，2024年2月25日，星期天誘變機制移碼突變?nèi)旧w畸變

堿基的置換

第63頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（1）堿基的置換直接引起置換的誘變劑HNO2CNH2腺嘌呤CO次黃嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黃嘌呤(He)第64頁,共141頁，2024年2月25日，星期天間接引起置換的誘變劑堿基的置換COHT：烯醇式CT：酮式OA..TT..

AG..

CA..T酮式T..

G烯醇式第65頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）移碼突變ＤＮＡ分子中缺失或增加少數(shù)幾個堿基對而引起造成突變點以后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)釋發(fā)生錯誤ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一個堿基缺少一個堿基第66頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（3)染色體畸變

某些理化因子，如Ｘ射線，紫外線，亞硝酸等，除能引起點突變外，還會引起DNA分子大損傷，包括染色體易位，倒位，缺失，重復(fù)等，即為染色體畸變。第67頁,共141頁，2024年2月25日，星期天2.自發(fā)突變（spontaneousmutation）(p206)

自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。第68頁,共141頁，2024年2月25日，星期天自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過程中堿基配對錯誤（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物一個1000bp的基因自發(fā)突變頻率約為10-6例如，過氧化氫等例如，天然的宇宙射線等第69頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（六）紫外線對DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物第70頁,共141頁，2024年2月25日，星期天二、突變與育種（p208）（一）自發(fā)突變與育種1.從生產(chǎn)中選育2.定向培育優(yōu)良品種（二）誘變育種從青霉素產(chǎn)量看誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種的原則第71頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種

是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學(xué)實驗或生產(chǎn)實踐使用。第72頁,共141頁，2024年2月25日，星期天篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機的第73頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

效價：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1單位1945時間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)100250500～850～850～8000～2萬～5萬5～10萬從青霉素產(chǎn)量看誘變育種第74頁,共141頁，2024年2月25日，星期天可獲得供工業(yè)和實驗室應(yīng)用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實踐意義第75頁,共141頁，2024年2月25日，星期天1.誘變育種的基本環(huán)節(jié)（p209）大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)出發(fā)菌株計算出誘變第76頁,共141頁，2024年2月25日，星期天出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過濾細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復(fù)篩保藏及擴大試驗活菌計數(shù)，誘變預(yù)備試驗存活細(xì)胞計數(shù)，致死率計算變異率計算第77頁,共141頁，2024年2月25日，星期天2.誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個原則選優(yōu)良的出發(fā)菌株選擇簡便有效的誘變劑處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液選用最適劑量設(shè)計或采用高效篩選方案或方法利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)第78頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（1）選擇簡便有效的誘變劑出發(fā)菌株含誘變劑的液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種分離紫外線選擇優(yōu)良突變株第79頁,共141頁，2024年2月25日，星期天S.t.his回變S.t.his吸入濾紙片保溫可疑“三致”試樣鼠肝勻漿（含羥化酶）陽性陰性利用回變檢測致癌劑

——艾姆斯試驗法（p210）第80頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

平板上無大量菌落出現(xiàn)，說明樣品不含誘變劑；有抑制圈出現(xiàn)，并在外圍長滿大量菌落，說明濃度過高；在濾紙片周圍長滿菌落說明濃度合適。該法廣泛用于監(jiān)測食品飲料藥物等試樣中的致癌物時間3天，準(zhǔn)確率85%。第81頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（p211）生產(chǎn)中用過的自發(fā)變異菌株采用具有有利性狀的菌株采用已發(fā)生其他變異的菌株采用前體或最終產(chǎn)物代謝高的菌株采用增變菌株第82頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（3）處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子細(xì)菌指數(shù)期，放線菌霉菌要稍加萌發(fā)后使用出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸夜第83頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（4）選用最適劑量劑量以誘變劑濃度和處理時間來表示合適劑量：能擴大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量第84頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)兩種或多種誘變劑先后使用同種誘變劑重復(fù)使用兩種或多種誘變劑同時使用第85頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)淀粉酶變色圈試驗變色圈大的為淀粉酶高產(chǎn)菌落第86頁,共141頁，2024年2月25日，星期天在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大?。y定生長因子產(chǎn)生），纖維素酶對纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標(biāo)。第87頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（7）設(shè)計或采用高效篩選方案或方法設(shè)計簡便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選工作復(fù)篩以量為主（選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株）以質(zhì)為主（對少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量作精確測定）第88頁,共141頁，2024年2月25日，星期天一個出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理第89頁,共141頁，2024年2月25日，星期天初篩復(fù)篩對產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測定方法粗測為主在培養(yǎng)皿平板上在搖瓶中（8）創(chuàng)造新型篩選方法較精確的測定搖瓶培養(yǎng)or臺式自控發(fā)酵罐培養(yǎng)第90頁,共141頁，2024年2月25日，星期天3.突變株的篩選方法

(p212）

高產(chǎn)突變菌株的篩選方法抗性突變體的篩選方法營養(yǎng)缺陷型的的篩選方法與突變株的篩選相關(guān)的幾個概念第91頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（1）產(chǎn)量突變株的篩選

1971年，國外有人報道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產(chǎn)菌時所采用的一種瓊脂塊培養(yǎng)法，一年內(nèi)曾使該抗生素產(chǎn)量提高10倍。第92頁,共141頁，2024年2月25日，星期天此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個小菌落的瓊脂塊作分別培養(yǎng)。這樣，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴散出瓊脂塊外。數(shù)據(jù)精確，效率高第93頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長。所以很容易分離得到。）第94頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細(xì)胞懸液、經(jīng)培養(yǎng)后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應(yīng)抗藥性突變株。第95頁,共141頁，2024年2月25日，星期天梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。第96頁,共141頁，2024年2月25日，星期天表示方法：所抗藥物的前三個小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對鏈霉素的抗性敏感性第97頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

營養(yǎng)缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學(xué)基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究以及生產(chǎn)實踐上都有極其重要的意義。第98頁,共141頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營養(yǎng)物的前三個英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。第99頁,共141頁，2024年2月25日，星期天a.基本培養(yǎng)基（MM，符號為［－］）①與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基

僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所需的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱MM。第100頁,共141頁，2024年2月25日，星期天b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號為［＋］）

凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱為CM。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素、核苷酸和堿基之類的天然物質(zhì)，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。第101頁,共141頁，2024年2月25日，星期天c.補充培養(yǎng)基（supplementalmedium，SM，符號為［A］或［B］等）

凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基，稱為SM。在基本培養(yǎng)基上再添加對某一營養(yǎng)缺陷型突變株所不能合成的某相應(yīng)代謝產(chǎn)物所組成，可專門選擇相應(yīng)的突變株。第102頁,共141頁，2024年2月25日，星期天原養(yǎng)型（prototroph）②與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的3類遺傳型個體野生型（wildtype，wildstrain）營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）從自然界分離到的原始菌株（A＋B＋）經(jīng)誘變劑處理后的突變株（A—B—）經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株（A＋B＋）第103頁,共141頁，2024年2月25日，星期天營養(yǎng)缺陷型的篩選辦法

(p215)1.誘變劑處理2.淘汰野生型3.檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法4.鑒定缺陷型第104頁,共141頁，2024年2月25日，星期天基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株生長的天然或半合成培養(yǎng)基。補充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對性地加入一或幾種營養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株生長的合成培養(yǎng)基。與篩選營養(yǎng)缺陷型突變株相關(guān)的3類培養(yǎng)基第105頁,共141頁，2024年2月25日，星期天三類遺傳型野生型[A+B+]營養(yǎng)缺陷型型[A+B-]原養(yǎng)型[A+B+]與營養(yǎng)缺陷型突變相關(guān)的3類遺傳型個體

（p215）第106頁,共141頁，2024年2月25日，星期天夾層培養(yǎng)法（p216）第107頁,共141頁，2024年2月25日，星期天夾層培養(yǎng)法及結(jié)果小菌落是第二次長起來的（營養(yǎng)缺陷型）第108頁,共141頁，2024年2月25日，星期天限量補充培養(yǎng)法微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株第109頁,共141頁，2024年2月25日，星期天逐個檢出法涂布培養(yǎng)基本培養(yǎng)基上不長菌落完全培養(yǎng)基上長出菌落含誘變劑的液體培養(yǎng)基菌種營養(yǎng)缺陷型第110頁,共141頁，2024年2月25日，星期天逐個檢出法缺陷型的檢出第111頁,共141頁，2024年2月25日，星期天影印接種法完全培養(yǎng)基影印接種基本培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷型第112頁,共141頁，2024年2月25日，星期天①生長譜法方法簡便；回變和污染不影響結(jié)果測定物質(zhì)可為粉末或紙片補充：缺陷型的鑒定測定一般應(yīng)分兩階段：第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型；第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍，進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的缺陷型；第113頁,共141頁，2024年2月25日，星期天組合營養(yǎng)物法步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）：a.將多種營養(yǎng)因子編組；b.將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)；c.結(jié)果分析；一組：1

2345

二組：26

789

三組：3710

1112

四組：4811

1314

五組：59121415營養(yǎng)因子分組編排時注意；1）每組內(nèi)無重復(fù)的營養(yǎng)因子2）每組中應(yīng)包含只出現(xiàn)一次的因子3）每組中其他因子應(yīng)分別出現(xiàn)二次如：第114頁,共141頁，2024年2月25日，星期天一組：1

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二組：26

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三組：3710

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四組：4811

1314

五組：59121415第115頁,共141頁，2024年2月25日，星期天②組合補充培養(yǎng)基法將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的缺陷類型，或快速分離出所需缺陷類型的菌株。ABFEDCHG第116頁,共141頁，2024年2月25日，星期天缺陷型的應(yīng)用作為菌株的遺傳標(biāo)記：進(jìn)行基因工程、誘變育種、研究代謝過程時用作親本標(biāo)記；作為生產(chǎn)菌種：aa、核苷酸等生產(chǎn)菌種；作為aa、維生素、堿基的測定菌株。第117頁,共141頁，2024年2月25日，星期天一、微生物菌種的衰退二、微生物菌種的復(fù)壯三、微生物菌種的保藏第五節(jié)微生物菌種的衰退、復(fù)壯和保藏P.231第118頁,共141頁，2024年2月25日，星期天性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進(jìn)行。第119頁,共141頁，2024年2月25日，星期天衰退的含義：由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。一、微生物菌種的衰退

衰退的表現(xiàn)形式

1）原有的形態(tài)不典型

2）生長速度變慢

3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降

4）致病力下降

5）抗性下降第120頁,共141頁，2024年2月25日，星期天（一）衰退的防止方法1）控制傳代的次數(shù)

2）創(chuàng)造良好培養(yǎng)條件3）采用有效的菌種保藏方法

4）采用不易衰退的細(xì)胞進(jìn)行傳代

P.232第121頁,共141頁，2024年2月25日，星期天復(fù)壯的含義（二）微生物菌種的復(fù)壯1）狹義：是一種消極的措施，它指的是菌種已發(fā)生衰退，再通過純種分離和性能測定等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個體，以達(dá)到恢復(fù)該菌種原有典型性狀的一種措施。2）廣義：是一項積極的措施，即在菌種性能尚未衰退前就經(jīng)常有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變體（以期菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高）。第122頁,共141頁，2024年2月25日，星期天

復(fù)壯的方法1.純種分離；

A、平板劃線分離：主要適合細(xì)菌，酵母菌，可達(dá)到菌落純的水平。B、單孢子分離：主要適合產(chǎn)孢子的微生物，例霉菌和放線菌。用顯微操作器進(jìn)行分離，可達(dá)到細(xì)胞純的水平。2.通過寄主主體復(fù)壯3.淘汰已衰退的個體

P.232第123頁,共141頁，2024年2月25日，星期天二、微生物菌種的保藏目的：①不死亡，不污染，不變異——三不原則②隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種。原理：選用優(yōu)良的純種（最好是休眠體，如分生孢子、芽孢等），在干燥、低溫、缺氧、缺營養(yǎng)以及添加保護劑等環(huán)境條件下，降低微生物代謝活動強度，抑制微生物生長繁殖，并使其難