核酸測(cè)定專題知識(shí)講座

核酸測(cè)定專題知識(shí)講座核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第1頁(yè)一、紫外分光光度法二、ECL法三、共振光散射法四、熒光探針?lè)凄や寮t法五：地衣酚法測(cè)定RNA含量核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第2頁(yè)一、紫外分光光法（定磷法）原理：①元素分析表明，RNA含磷量平均為9.4%，DNA含磷量平均為9.9％，由此能夠推導(dǎo)出核酸質(zhì)量約為其含磷量11倍，所以可從測(cè)得核酸樣品含磷量計(jì)算核酸含量。②DNA、RNA分子在強(qiáng)酸作用下降解糖，再與濃酸、酚或胺生成有色化合物，其顏色深淺與核酸含量呈正比，所以經(jīng)過(guò)比色法可測(cè)得核酸含量。核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第3頁(yè)儀器：分析天平、離心機(jī)、容量瓶、紫外分光光度計(jì)、吸管等試劑：氨水、鉬酸銨-高氯酸注意事項(xiàng)：因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含有芳香族氨基酸，故也能吸收紫外光，通常吸收峰在280nm處，在260nm處吸收值僅為核酸十分之一或更低，若樣品中蛋白質(zhì)含量較低時(shí)對(duì)核酸紫外測(cè)定影響不大，若蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，會(huì)影響核酸含量測(cè)定，故應(yīng)去除蛋白質(zhì)干擾。核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第4頁(yè)二、ECL法ECL(電化學(xué)發(fā)光分析):將電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光完美結(jié)合新型免疫分析技術(shù)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(electroehemiluminesenee,ECL),同時(shí)聯(lián)合新型免疫固相放大技術(shù)—鏈霉親和素系統(tǒng),在免疫學(xué)檢瀏中尤其是核酸測(cè)定中,發(fā)揮了以往發(fā)光技術(shù)無(wú)可比擬優(yōu)勢(shì)。核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第5頁(yè)儀器：ECL測(cè)量室、磁性微球、電極等注意事項(xiàng)：ECL技術(shù)是電化學(xué)技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合新型免疫分析方法，與普通化學(xué)發(fā)光(酶促發(fā)光或生物發(fā)光)有顯著區(qū)分．前者為電促發(fā)光，在極表面經(jīng)過(guò)三角形脈沖電壓激發(fā)產(chǎn)生穩(wěn)定、連續(xù)、高效發(fā)光，后者則是標(biāo)識(shí)辣根過(guò)氧化物酶作用下催化化學(xué)發(fā)光劑如魯米那，吖啶酶等產(chǎn)生不穩(wěn)定、間斷、閃爍性發(fā)光，且反應(yīng)過(guò)程中輕易發(fā)生裂變而使結(jié)果不穩(wěn)定。ECL測(cè)定照光度依據(jù)釋放光于，波長(zhǎng)仍屬熒光測(cè)定范圍，但與直接熒光發(fā)光不一樣，熒光發(fā)光靈敏度蹙熒光發(fā)光本底和光學(xué)部件散射光影響，適應(yīng)范圍也較低。核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第6頁(yè)三、共振光散射法原理：在普通熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行測(cè)量分析技術(shù)，靈敏度高、簡(jiǎn)便快速。該技術(shù)能夠用于研究核酸與有機(jī)小分子探針間相互作用并進(jìn)行核酸定量測(cè)定。在核酸測(cè)定分析中，該方法靈敏度主要取決于探針?lè)肿优c核酸作用強(qiáng)弱，所以尋找靈敏核酸測(cè)定探針成為核酸分析主要內(nèi)容核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第7頁(yè)儀器：F-2500型熒光分光光度計(jì)，QL-901型旋渦混合器，pHS-3C酸度計(jì)試劑：fsDNA貯備液、溴化十六烷基三甲銨、依來(lái)鉻藍(lán)黑、Britton-Robinson緩沖液、M/25混合酸注意事項(xiàng)：緩沖溶液（BR）加入次序?qū)LS強(qiáng)度影響不大，而染料加入次序則很關(guān)鍵。主要是因?yàn)殛?yáng)離子表面活性劑CTMAB首先與大分子fsDNA以靜電引力結(jié)合，再進(jìn)而與染料結(jié)合形成離子締合物而使RLS強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。在試驗(yàn)中，凡最終加入染料組合其RLS信號(hào)都尤其強(qiáng)，即CTMAB與fsDNA作用之后再讓染料聚集，所獲RLS信號(hào)更強(qiáng)。所以試劑加入最正確次序應(yīng)是先加入fsDNA和CTMAB，最終再加入染料核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第8頁(yè)四、熒光探針?lè)凄や寮t法原理：常溫下核酸本身熒光很弱,不能直接探測(cè)到。利用熒光探針—菲啶溴紅(簡(jiǎn)稱EthBr)插入核酸雙鏈區(qū)時(shí),其量子產(chǎn)率大大增高,它和核酸形成一個(gè)較強(qiáng)熒光絡(luò)合物。在一定條件下,這種絡(luò)合物熒光強(qiáng)度和核酸濃度成正比利用核酸酶處理就能確定樣品中DNA和RNA含量利用這種方法可檢測(cè)核酸最小含量為0.02微克/毫升核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第9頁(yè)儀器：熒光分光光度計(jì)、MPF-4型熒光分光光度計(jì)、組織勻漿器試劑：菲啶溴紅、核搪核酸鈉鹽、廣譜蛋白酶、三羥甲基氨基甲烷、EthBr溶液、Tris一HCL緩沖液注意事項(xiàng)：這種方法也有一定不足,如熒光測(cè)定試驗(yàn)條件嚴(yán)格;不能側(cè)定失去雙鏈區(qū)核酸;勻漿樣品中若干擾物質(zhì)(如蛋白質(zhì)等)含量大大超出核酸含量時(shí),對(duì)于結(jié)果有影響。不過(guò)利用這種熒光方法測(cè)定微量核酸含有顯著優(yōu)點(diǎn);簡(jiǎn)便、快速、靈敏和專一性強(qiáng)。核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第10頁(yè)原理：核糖核酸與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成核糖繼而轉(zhuǎn)變成糖醛，后者與3，5—二羥基甲苯（地衣酚）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氯化銅作催化劑，反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收，RNA濃度在0微克/毫升范圍內(nèi)，光密度與RNA濃度成正比關(guān)系，在反應(yīng)液中如混有DNA或其它雜質(zhì)。也能給出類似顏色。所以測(cè)定RNA時(shí)可先測(cè)定DNA含量，再計(jì)算RNA含量。五、地衣酚法測(cè)定RNA含量核酸測(cè)定專題知識(shí)講座第11頁(yè)儀器：試管及管架、水浴鍋、移液管、可見(jiàn)光分光光度計(jì)注意事項(xiàng)：①地衣酚法只能測(cè)定RNA中與嘌呤連接核糖，不一樣起源RNA所含嘌呤與嘧啶百分比各不相同，所以，用所測(cè)得核糖量來(lái)?yè)Q算