生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座

蛋白質沉淀和變性反應1.1、原理蛋白質分子在水溶液中，因為其表面形成了水化層和雙電層而成為穩(wěn)定膠體顆粒，所以蛋白質溶液為一個親水膠體溶液。當?shù)鞍踪|溶液在一定物理化學原因影響下，蛋白質膠體顆粒穩(wěn)定條件被破壞，如失去電荷、脫水，甚至變性，則蛋白質分子將以固態(tài)形式從溶液中析出，這個過程稱為蛋白質沉淀反應。依據其特點不一樣可分為可逆沉淀反應和不可逆沉淀反應兩種類型。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第1頁蛋白質沉淀和變性反應1、可逆沉淀反應蛋白質雖已沉淀析出，但其分子內部結構并未發(fā)生顯著改變，假如把引發(fā)沉淀原因去除后，沉淀蛋白質能重新溶于原來溶劑中，并保持其原有天然結構和性質。如蛋白質鹽析作用和等電點沉淀作用及在低溫下，乙醇、丙酮短時間內對蛋白質沉淀作用。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第2頁蛋白質沉淀和變性反應蛋白質鹽析作用原理用大量中性鹽使蛋白質從溶液中沉淀析出過程稱為蛋白質鹽析作用。蛋白質是親水膠體，蛋白質溶液在高濃度中性鹽影響下，蛋白質分子被中性鹽脫去水化層，同時所帶電荷被中和，結果蛋白質膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出。析出蛋白質仍保持其天然性質，當降低鹽濃度時，還能溶解，即蛋白質鹽析作用是可逆過程。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第3頁蛋白質沉淀和變性反應沉淀不一樣蛋白質所需中性鹽濃度不一樣；沉淀相同蛋白質，因所用中性鹽不一樣所需鹽濃度也不一樣。所以在不一樣條件下，用不一樣濃度鹽類可將各種蛋白質從混合溶液中分別沉淀析出，該法稱為蛋白質分級鹽析，在提純蛋白質時常被應用。2、不可逆沉淀反應生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第4頁蛋白質沉淀和變性反應蛋白質分子發(fā)生沉淀時，其分子內部空間結構遭到破壞，蛋白質分子由規(guī)則性結構變?yōu)闊o秩序伸展肽鏈，使原來天然性質喪失，即蛋白質已發(fā)生了變性，這種因為蛋白質變性而產生沉淀不能再溶解于原來溶劑中。如重金屬鹽、植物堿試劑、強酸、強堿、有機溶劑等化學原因引發(fā)蛋白質沉淀作用，以及加熱、振蕩、超聲波、紫外線、X-射線等物理原因所引發(fā)蛋白質沉淀作用。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第5頁蛋白質沉淀和變性反應天然蛋白質變性后，變性蛋白質分子相互凝聚或相互穿插纏繞在一起形成緊密固體團塊現(xiàn)象稱為蛋白質凝固。幾乎全部蛋白質都會因加熱變性而凝固，變成不可逆不溶狀態(tài)。⑴、重金屬鹽沉淀蛋白質原理生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第6頁蛋白質沉淀和變性反應蛋白質在水溶液中為酸堿兩性電解質，在堿性溶液中（對蛋白質等電點而言），蛋白質分子帶負電荷，可與帶正電荷金屬離子結合成蛋白質鹽，當加入汞、鉛、銅、銀等重金屬鹽時，蛋白質則形成不溶性鹽類而沉淀析出，這種沉淀不再溶解于水中，說明它已發(fā)生了變性。應注意，當用乙酸鉛或硫酸銅沉淀蛋白質時，試劑不可加過量，不然可使沉淀出蛋白質重新溶解。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第7頁蛋白質沉淀和變性反應⑵、無機酸沉淀蛋白質濃無機酸（除磷酸外）都能使蛋白質發(fā)生不可逆沉淀反應。這種沉淀作用可能是蛋白質顆粒脫水結果。但過量無機酸（硝酸除外）可使沉淀出蛋白質重新溶解。⑶、有機酸沉淀蛋白質在酸性溶液中（對蛋白質等電點而言），蛋白質分子帶正電荷，可與帶負電荷酸根結合，生成不容性蛋白質鹽復合物而沉淀。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第8頁蛋白質沉淀和變性反應三氯乙酸和磺基水楊酸是沉淀蛋白質最有效兩種有機酸。⑷、有機溶劑沉淀蛋白質乙醇、丙酮都是脫水劑，能破壞蛋白質膠體顆粒水化層，而使蛋白質沉淀。低溫時，用乙醇（或丙酮）短時間對蛋白質作用，蛋白質雖沉淀但仍保持其原有生物活性，如將乙醇或丙酮除去后，沉淀仍可溶解。但如用乙醇進行較長時間脫水則可使蛋白質變性沉淀。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第9頁蛋白質沉淀和變性反應⑸、加熱沉淀蛋白質蛋白質可因加熱變性沉淀而凝固，鹽濃度和氫離子濃度對蛋白質加熱凝固有主要影響。少許鹽類能促進蛋白質加熱凝固；當?shù)鞍踪|處于等電點時，加熱凝固最完全、最快速；在酸性或堿性溶液中，蛋白質分子帶有正電荷或負電荷，雖加熱蛋白質也不會凝固；但如同時有足量中性鹽存在，則蛋白質可因加熱而凝固。生物化學實驗甲蛋白質的沉淀和變性反應專家講座第10頁蛋白質沉淀和變性反應1.2、材料與試劑1、試驗材料雞蛋或鴨蛋2、試劑試劑配制及注意