噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座

Contents噬菌體介紹1噬菌體應(yīng)用技術(shù)介紹2噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用3前景及展望4噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第1頁1、噬菌體介紹概念：噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體、立克次體及放線菌等微生物病毒,屬非細(xì)胞微生物。特征：個(gè)體微小，需用電鏡觀察，能夠經(jīng)過細(xì)菌濾器；沒有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)組成；專性活細(xì)胞內(nèi)寄生,含有嚴(yán)格寄生特異性。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第2頁形態(tài)與結(jié)構(gòu)形態(tài)：蝌蚪形，微球形，細(xì)桿形噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第3頁噬菌體顆粒在結(jié)構(gòu)上有很大差異，普通可分成三種類型，即

無尾部結(jié)構(gòu)二十面體，有尾部結(jié)構(gòu)二十面體和線狀體，迄今已知噬菌體大多數(shù)是有尾部結(jié)構(gòu)二十面體。

頭部尾部噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第4頁核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，一些噬菌體基因組中還含有異常堿基。

大多數(shù)為線狀雙鏈

DNA噬菌體少數(shù)為環(huán)狀單鏈多數(shù)為線狀單鏈RNA噬菌體少數(shù)為線狀雙鏈?zhǔn)删w及其研究進(jìn)展專家講座第5頁噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第6頁化學(xué)組成核酸：DNA或RNA,基因組大小為2-200kb，一些噬菌體基因組中還含有異常堿基。

大多數(shù)為線狀雙鏈

DNA噬菌體少數(shù)為環(huán)狀單鏈多數(shù)為線狀單鏈

RNA噬菌體少數(shù)為線狀雙鏈?zhǔn)删w及其研究進(jìn)展專家講座第7頁噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第8頁按與宿主相互關(guān)系，噬菌體能夠分為兩種類型：

烈性噬菌體，溫和噬菌體（溶原性噬菌體）

烈性噬菌體:能在宿主菌內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。

溫和噬菌體（溶原性噬菌體）：噬菌體基因組整合于宿主菌染色體中，不產(chǎn)生子代噬菌體，也不引發(fā)細(xì)菌裂解，但噬菌體DNA隨細(xì)菌基因組復(fù)制而復(fù)制，并隨細(xì)菌分裂而分配至子代細(xì)菌基因組中。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第9頁吸附穿入生物合成裝配釋放烈性噬菌體溶菌周期噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第10頁2、噬菌體應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用判定細(xì)菌分型測定輻射劑量檢測基因產(chǎn)物活性篩選目標(biāo)基因

檢測病原菌預(yù)防和治療傳染性疾病噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第11頁3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第12頁3.1食源性疾病病原檢測技術(shù)

食源性疾病病原檢測技術(shù)是食源性疾病預(yù)防與控制關(guān)健技術(shù)步驟。數(shù)據(jù)顯示，每年大約有7600萬人因食用了受污染食物而患病，其中91%是因?yàn)榧?xì)菌污染造成?，F(xiàn)存檢測方法包含傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、生物芯片技術(shù)和免疫學(xué)方法等。缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)費(fèi)勁、價(jià)格昂貴、特異性或靈敏度低、國內(nèi)試劑供給不配套等，極難適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)需要。有必要尋找一個(gè)簡捷、快速、靈敏度高檢測食源性病原微生物方法以及技術(shù)平臺。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第13頁檢測方法匯報(bào)基因檢測

熒光染料標(biāo)識

噬菌斑檢測

噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第14頁3.1.1噬菌斑檢測原理：用噬菌體截獲某種病原菌，隨即病原菌被噬菌體感染，用殺毒劑將胞外剩下噬菌體殺死，然后將噬菌體與被感染細(xì)胞混合并在裝有軟瓊脂雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)，被感染細(xì)胞破裂釋放出子代噬菌休，在培養(yǎng)基中就會形成空斑。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第15頁試驗(yàn)方法標(biāo)本采集后置于SC增菌管中37℃增菌18h左右,SS平板分離培養(yǎng)37℃過夜,然后挑出含有沙門氏菌特征單個(gè)菌落劃線接種于普通瓊脂平皿上,每塊平板劃格后可接種8個(gè)菌落左右。在每格中央用滅菌毛細(xì)滴管滴上O-I噬菌體,待溶液干后置37℃6-8h培養(yǎng)或過夜,觀察噬菌體裂解情況。發(fā)覺被O-I噬菌體裂解菌株,馬上挑取噬斑周圍菌苔直接做沙門氏菌A-F多價(jià)血清凝集試驗(yàn),凝集陽性者即可初步匯報(bào)結(jié)果,然后轉(zhuǎn)種克氏雙糖鐵管作深入判定分型。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第16頁簡例O-I噬菌體是作用于沙門氏菌屬特異性噬菌體,染色體為雙鏈DNA,受體是宿主細(xì)胞壁上關(guān)鍵多糖乙酰氨基葡萄糖。應(yīng)用O-I噬菌體進(jìn)行飲食行業(yè)及公共場所從業(yè)人員帶菌調(diào)查結(jié)果表明,沙門氏菌檢出率為0.131%,與廣東省報(bào)道0.134%檢出率相近,說明O-I噬菌體應(yīng)用對沙門氏菌診療含有較高特異性和敏感性,不失為大量從業(yè)人員沙門氏菌調(diào)查較為理想快速診療方法。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第17頁3.1.2熒光染料標(biāo)識法原理：選取一個(gè)適當(dāng)染色劑，噬菌體核酸染色標(biāo)識，然后用標(biāo)識過噬菌體侵染對應(yīng)宿主菌，噬菌體吸附在宿主菌表面后，隨即將標(biāo)識過核酸注入宿主細(xì)胞，伴隨越來越多噬菌體核酸注入，細(xì)胞內(nèi)熒光伴隨熒光素增多而增強(qiáng)，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌存在，從而實(shí)現(xiàn)病原菌檢測。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第18頁介紹A圖只有細(xì)菌,熒光視野里不見任何發(fā)光物質(zhì);B圖中只有熒光標(biāo)識O-I噬菌體,視野下偶然可見少許圓點(diǎn)狀熒光物質(zhì),不見菌形;C圖是熒光標(biāo)識O-I噬菌體和沙門氏菌混合,可見大量桿狀物,少許點(diǎn)狀物,極少數(shù)彗星狀桿狀物,將桿狀物質(zhì)與沙門氏菌革蘭氏染色形態(tài)進(jìn)行比較,二者一致。由此可推知,C圖中桿形物是侵有熒光噬菌體沙門氏菌,點(diǎn)狀物是標(biāo)識O-I噬菌體,結(jié)合B圖可知彗星狀桿形物是即將裂解宿主菌。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第19頁簡例蔣魯巖等用此方法快速檢測食品源沙門氏菌，檢測靈敏度達(dá)10CFU/100μL;120份食品樣品中沙門氏菌O-I噬菌體檢測與生化判定結(jié)果陽性率分別為9.17%和10%,符合率為91.7%。表明用熒光標(biāo)識O-I噬菌體能夠快速、直觀、準(zhǔn)確、大量地檢測食品中沙門氏菌。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第20頁3.1.3匯報(bào)基因檢測技術(shù)該技術(shù)中，將一個(gè)匯報(bào)基因經(jīng)過噬菌體插入到目標(biāo)菌體DNA中，伴隨匯報(bào)基因表示，目標(biāo)菌體便可快速得到檢測。應(yīng)用在這一技術(shù)匯報(bào)系統(tǒng)主要有原核生物和真核生物熒光素酶(lux,luc)基因，細(xì)菌冰核蛋白(inaW)基因，E.coliβ-半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素親和蛋白。匯報(bào)噬菌體已經(jīng)能夠成功檢測許多菌種，如E.coli,Salmonella.spp等。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第21頁介紹噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第22頁利用熒光素酶基因作為匯報(bào)基因快速檢測技術(shù)對于細(xì)菌來說，發(fā)光機(jī)理可用下式表述：FMNH2+RCHO+O2→FMN+H2O+RCOOH+hν(490nm)反應(yīng)是在熒光素酶催化下進(jìn)行。細(xì)菌熒光素酶是一個(gè)77kD二聚體，其中包含α亞基(4037kD)和β亞基(37kD)。當(dāng)前，生物發(fā)光基因(lux,luc)在匯報(bào)噬菌體檢測技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛。Waddell等利用轉(zhuǎn)座子致突變，將lucA和lucB基因插入到E.coliO157:H7溫和噬菌體φV10中，構(gòu)建了一個(gè)熒光素酶轉(zhuǎn)座噬菌體，這一噬菌體能夠使E.coliO157:H7在1h內(nèi)被成功檢測，并匯報(bào)出結(jié)果。Masahito等將綠熒光蛋白(GFP)基因分別插入到T偶數(shù)型噬菌體PP01外殼蛋白(SOC)基因C末端和N末端，構(gòu)建成噬菌體PP01-GFP/SOC和PP01-SOC/GFP，這種對E.coliO157:H7特異噬菌體能夠成功檢測菌體可培養(yǎng)細(xì)胞，不可培養(yǎng)但可存活細(xì)胞(VBNC)及經(jīng)過巴氏消毒過細(xì)胞，靈敏度高，檢測時(shí)間僅為20min。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第23頁以β-半乳糖苷酶作為匯報(bào)基因快速檢測技術(shù)β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是一個(gè)催化β-半乳糖苷水解反應(yīng)糖苷酶。β-半乳糖苷酶作用特征是伴隨水解反應(yīng)底物不一樣而改變，鄰硝基苯β-D-半乳糖苷是檢測中慣用靈敏基質(zhì)，它被β-半乳糖苷酶水解后產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，該技術(shù)能夠使檢測靈敏度到達(dá)生物發(fā)光熒光素酶檢測水平。Goodridge等設(shè)計(jì)了一個(gè)帶有l(wèi)acZ基因T4噬菌體，用這種噬菌體感染待測樣品，并用化學(xué)發(fā)光基質(zhì)作為檢測基質(zhì)，研究人員成功檢測了肉湯培養(yǎng)基中E.coli，檢測限僅為102CFU/ml。然后，研究人員將最大約率數(shù)(mostprobablenumber，MPN)法應(yīng)用到食源性病原菌檢測中，檢測水平可降至10CFU/ml，用時(shí)僅1h。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第24頁3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第25頁3.2作為食品添加劑美國食品和藥品管理局同意了一個(gè)由噬菌體病毒混合而成產(chǎn)品，主要用于殺滅肉制品中李氏桿菌。這是美國首次同意將病毒用作食品添加劑。美藥管局教授稱，該產(chǎn)品在制備過程中可能留有殘毒，但試驗(yàn)表明，這些微量殘毒不會引發(fā)任何健康問題。該產(chǎn)品包含6種噬菌體病毒，可在熟肉片和香腸等包裝前噴灑在這些肉制品上，有效殺滅各種李氏桿菌，預(yù)防由這些細(xì)菌引發(fā)食物中毒。產(chǎn)品中所包含噬菌體只會攻擊李氏桿菌，對人體和植物細(xì)胞都不會產(chǎn)生影響。

噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第26頁3、噬菌體在食品產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用食源性疾病病原檢測技術(shù)作為食品添加劑噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第27頁3.3噬菌體展示技術(shù)檢測真菌毒素噬菌體展示技術(shù)(Phagedisplaytechnology)是20世紀(jì)80年代逐步建立并發(fā)展起來一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。它以噬菌體或噬粒為載體,使外源肽或蛋白基因與噬菌體表面特定蛋白基因在其表面進(jìn)行融合表示,進(jìn)而經(jīng)過親和富集法篩選表示有特異肽或蛋白質(zhì)噬菌體。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第28頁真菌毒素作為天然毒素廣泛存在于谷物等食品中，世界很多國家都有被污染匯報(bào)，因?yàn)檎婢舅貙儆诤哿课廴疚?，所以檢測技術(shù)主要有各類色譜法和利用抗體免疫學(xué)方法。其中高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）優(yōu)點(diǎn)：靈敏度和可靠性都很高缺點(diǎn)：樣品處理繁瑣，儀器昂貴，現(xiàn)場快速檢測中難以普及使用酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)(ELISA)優(yōu)點(diǎn)：能夠同時(shí)大批量檢測樣品，攜帶方便，操作簡便和經(jīng)濟(jì),常以試劑盒形式出現(xiàn)且易商品化缺點(diǎn):當(dāng)前用于ELISA檢測試劑盒各類毒素單克隆抗體(McAb)主要起源于小鼠雜交瘤細(xì)胞，在篩選單克隆抗體生產(chǎn)雜交瘤細(xì)胞株系上，需要做雜交融合，亞克隆篩選，是一個(gè)長久復(fù)雜過程，既花費(fèi)財(cái)力、物力，又浪費(fèi)時(shí)間，且檢測所用真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第29頁利用噬菌體展示技術(shù)制備抗體、模擬抗原表位，不但繞過了細(xì)胞融合，而且能夠以單克隆抗體（McAb）或單鏈抗體（ScFv）為靶分子篩選真菌毒素模擬抗原表位，代替真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，建立無毒ELISA檢測方法，確保試驗(yàn)操作人員和相關(guān)研究人員人身安全。熊嘯（年）等選取抗黃曲霉毒素M1（anti-AFM1,AflatoxinM1,AFM1）單克隆抗體為篩選配基，從噬菌體表面展示隨機(jī)7肽庫中篩選出AFM1抗原模擬表位LTSFPRH和MAPSSWR，為研制出安全無毒ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。噬菌體及其研究進(jìn)展專家講座第30頁4、前景及展望噬菌體檢測技術(shù)含