生物化學甲上氨基酸專家講座

Chapter3氨基酸

蛋白質是生物功效表達者，而組成蛋白質基本單位是氨基酸。蛋白質在酸、堿或酶作用下，可逐步降解為氨基酸。組成蛋白質氨基酸常見有20種。成千上萬不一樣蛋白質實際上就是氨基酸種類、數目及排列次序不一樣。生物化學甲上氨基酸專家講座第1頁Section1蛋白質水解

用H+，OH-或酶將蛋白質徹底水解，能夠得到許各種氨基酸混合物，說明氨基酸是蛋白質基本結構單位。

蛋白質→蛋白胨→多肽→二肽→氨基酸Mr：

大于1042x1031000—500200100生物化學甲上氨基酸專家講座第2頁1、酸水解條件：5—10倍20%鹽酸煮沸回流16—24小時，或加壓于120℃水解2小時。優(yōu)點：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產物為L—α—氨基酸，產物單一，無消旋現象。

缺點：色氨酸破壞，并產生一個黑色物質：腐黑質，水解液呈黑色。2、

堿水解條件：4mol/LBa(OH)2或6mol/LNaOH煮沸6小時。優(yōu)點：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。缺點：產生消旋產物，破壞氨基酸多，普通極少使用。3、

蛋白酶水解條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫37—40℃，pH值5—8優(yōu)點：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現象。缺點：水解不完全，中間產物多。蛋白質酸堿水解慣用于蛋白質組成份析，而酶水解用于制備蛋白質水解產物。生物化學甲上氨基酸專家講座第3頁Section2氨基酸結構通式2).除甘氨酸外,其它全部氨基酸分子中α-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都含有旋光性。B.每一個氨基酸都含有D-型和L-型兩種立體異構體。當前已知天然蛋白質中氨基酸都為L-型。1、氨基酸結構氨基酸是蛋白質水解最終產物，是組成蛋白質基本單位。從蛋白質水解物中分離出來氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結構上共同特點為：1).與羧基相鄰α-碳原子上都有一個氨基，因而稱為α-氨基酸COOHH2NCαHRR基團α-氨基酸基本結構通式生物化學甲上氨基酸專家講座第4頁2、組成蛋白質氨基酸結構特征（1）除Pro外，都屬α-氨基酸，Pro為α-亞氨基酸：（2）都屬L-氨基酸；（3）除Gly外，都含有旋光性；（4）為兩性電解質。因為R基團不一樣，各種氨基酸在性質上差異很大，如吸收光譜、等電點（pI）、解離常數（Ka）、顏色反應、穩(wěn)定性、對金屬絡合能力等。所以，不一樣氨基酸組成蛋白質，性質和功效千差萬別。生物化學甲上氨基酸專家講座第5頁

中性aa（1）按R基團酸堿性分酸性aa

堿性aa（2）按R基團非極性aa（9種）電性質分極性不帶電荷aa（6種）極性aa帶正電荷aa(3種）帶負電荷aa（2種）

脂肪族aa（3）按R基團化學結構分芳香族aa

雜環(huán)族aaSection3氨基酸分類生物化學甲上氨基酸專家講座第6頁

1.組成蛋白質20種氨基酸生物化學甲上氨基酸專家講座第7頁

2.人體所需八種必需氨基酸

賴氨酸(Lys)纈氨酸(Val)蛋氨酸(Met)

色氨酸(Try)亮氨酸(Leu)異亮氨酸(Ile)

酪氨酸(Thr)苯丙氨酸(Phe)

嬰兒時期所需:精氨酸(Arg)、組氨酸(His)

早產兒所需：色氨酸(Try)、半胱氨酸(Cys)3.幾個主要不常見氨基酸

在少數蛋白質中分離出一些不常見氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。這些氨基酸都是由對應基本氨基酸衍生而來。其中主要有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、N-甲基賴氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。這些不常見蛋白質氨基酸結構以下生物化學甲上氨基酸專家講座第8頁

生物化學甲上氨基酸專家講座第9頁Section4氨基酸主要理化性質1.普通物理性質常見氨基酸均為無色結晶,其形狀因構型而異溶解性：各種氨基酸在水中溶解度差異很大，并能溶解于稀酸或稀堿中，但不能溶解于有機溶劑。通常酒精能把氨基酸從其溶液中沉淀析出。(2)熔點：氨基酸熔點極高，普通在200℃以上。(3)味感：其味隨不一樣氨基酸有所不一樣，有無味、有為甜、有味苦，谷氨酸單鈉鹽有鮮味，是味精主要成份。旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都含有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋轉，左旋者通慣用（-）表示，右旋者用（+）表示。(5)光吸收：組成蛋白質20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠紫外區(qū)(<220nm)都有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光能力。生物化學甲上氨基酸專家講座第10頁

酪氨酸

max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸max＝280nm，280=5.6x103;生物化學甲上氨基酸專家講座第11頁

2.氨基酸兩性解離性質氨基酸在結晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。在不一樣pH條件下，兩性離子狀態(tài)也隨之發(fā)生改變pH1710凈電荷+10-1

正離子兩性離子負離子

等電點PI生物化學甲上氨基酸專家講座第12頁氨基酸既含有氨基，能像堿一樣接收H+，又含有羧基，像酸一樣可電離出H+，所以氨基酸含有酸堿兩性性質，是一類兩性電解質。

Asanacid（protondonor）：

Asabase（protonacceptor）：生物化學甲上氨基酸專家講座第13頁不一樣pH時氨基酸以不一樣離子化形式存在：氨基酸所帶靜電荷為“零”時，溶液pH值稱為該氨基酸等電點（isoelectricpoint），以pI表示。生物化學甲上氨基酸專家講座第14頁

試驗證實在等電點時，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少許而且數量相等正、負離子形式，還有極少許中性分子。

當溶液pH=pI時，氨基酸主要以兩性離子形式存在。

pH<pI時，氨基酸主要以正離子形式存在。

pH>pI時，氨基酸主要以負離子形式存在。

生物化學甲上氨基酸專家講座第15頁

3.氨基酸等電點

當溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含-NH3+和-COO-數目恰好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。側鏈不含離解基團中性氨基酸，其等電點是它pKa1和pKa2算術平均值：pI=(pKa1+pKa2)/2

一樣，對于側鏈含有可解離基團氨基酸，其pI值也決定于兩性離子兩邊pKa值算術平均值。酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKaR-COO-)/2

堿性氨基酸：pI=(pKa2+pKaR-NH2)/2

生物化學甲上氨基酸專家講座第16頁各種aa都有各自等電點。在酸性溶液中（pH<pI)帶正電荷；在堿性溶液中（pH>pI)帶負電荷。例：在pH=6.0混合溶液中

Ala—兼性離子

Lys—帶正電荷

Glu—帶負電荷生物化學甲上氨基酸專家講座第17頁在溶液任一條件下：

pH=pKa+lg[質子受體]/[質子供體]

對于中性aa，加酸pKa取pKa1

加堿pKa取pKa2

知道了溶液pH，即可計算出在任一pH條件下，一個aa中各種離子百分比。生物化學甲上氨基酸專家講座第18頁4.氨基酸化學性質

(1)與茚三酮反應氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，本身變?yōu)樯僖粋€碳醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。★★★生物化學甲上氨基酸專家講座第19頁反應關鍵點A.該反應由NH2與COOH共同參加B.茚三酮是強氧化劑C.該反應非常靈敏，可在570nm測定吸光值D.測定范圍：0.5~50μg/ml

E.脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質（不釋放NH3）應用：A.氨基酸定量分析（先用層析法分離）B.氨基酸自動分析儀：用陽離子交換樹脂，將樣品中氨基酸分離，自動定性定量，統(tǒng)計結果。生物化學甲上氨基酸專家講座第20頁

(2)與甲醛反應

反應特點A.為α-NH2反應B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反應，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當指示劑。B.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）D.簡單快速，普通用于測定蛋白質水解速度。生物化學甲上氨基酸專家講座第21頁

(3)與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應

反應特點A.為α-NH2反應B.氨基酸α-NH2一個H原子可被烴基取代(鹵代烴)C.在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸應用：判定多肽或蛋白質N-末端氨基酸A.即使多肽側鏈上ε-NH2、酚羥基也能與DNFB反應，但其生成物，輕易與α-DNP氨基酸區(qū)分和分離生物化學甲上氨基酸專家講座第22頁

★首先由Sanger應用，確定了胰島素一級結構A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其它游離氨基酸C.分離DNP-氨基酸D.由Edman于1950年首先提出為α-NH2反應用于N末端分析，又稱Edman降解法肽分子與DNFB反應，得DNP-肽層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸種類、數目(4)與異硫氰酸苯酯（PITC）反應生物化學甲上氨基酸專家講座第23頁

Edman（苯異硫氰酸酯法）氨基酸次序分析法實際上也是一個N-端分析法。此法特點是能夠不停重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標識和解離。生物化學甲上氨基酸專家講座第24頁

肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯，生成PTC-肽環(huán)化斷裂：最靠近PTC基肽鍵斷裂，生成PTC-氨基酸和少一殘基肽鏈，同時PTC-氨基酸環(huán)化生成PTH-氨基酸分離PTH-氨基酸層析法判定Edman降解法改進方法---DNS-Edman降解法用DNS(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸原理DNFB法相同但水解后DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或層析法判定因為DNS有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍可用于微量氨基酸定量生物化學甲上氨基酸專家講座第25頁

用Edman降解法提供逐次降低一個殘基肽鏈靈敏度提升，能連續(xù)測定。多肽次序自動分析儀樣品最低用量可在5pmol（5）與熒光胺反應

α-NH2反應氨基酸定量（6）與5,5’-雙硫基-雙(2-硝基苯甲酸)反應-SH反應測定細胞游離-SH含量（7）其它反應成鹽、成酯、成肽、脫羧反應生物化學甲上氨基酸專家講座第26頁Section5氨基酸分析分離慣用方法有：濾紙層析法(filter-paperchromatography:FPC)薄層層析法(thin-layerchromatography:TLC)離子交換層析法(Ion-exchangecolumnchromatography:IEC)氣液色譜法(gas-liquidchromatography:GLC)高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography:HPLC)電泳技術生物化學甲上氨基酸專家講座第27頁一、濾紙層析法（FPC)以濾紙作為支持物。濾紙吸附水為固定相（S)

用水飽和有機溶劑作流動相（L)

在互不相溶兩相溶劑中，依據分配系數不一樣而分離物質方法稱為分配系數法。（主要與物質極性相關）分配系數（Ka)=溶劑在流動相中濃度/溶劑在固定相中濃度遷移率（Rf)=原點到層析中心點距離/原點到層析前沿距離即在一定條件下，被分離物質在紙上移動距離與溶劑移動距離之比。在一定條件下，某種aaRf值是一定，不一樣aaRf值是不一樣。

可利用兩種不一樣展層劑，進行雙相層析（詳見P151圖3-25）。生物化學甲上氨基酸專家講座第28頁二、離子交換層析（IEC)離子交換劑是一個不溶于水、不溶于有機溶劑、不溶于酸堿高分子化合物。依據所帶基團又可分為：

1、陽離子交換劑含-SO3H（強酸型）

H型

-COOH（弱酸型）若以Na+置換H+:-SO3NaNa型

-COONa生物化學甲上氨基酸專家講座第29頁

2、陰離子交換劑：含-N+(CH3)3OH（強堿型）

OH型

-N+H3OH（弱堿型）若以Cl-置換OH-,-N+(CH3)3ClCl型

-N+H3Cl

如：732型陽離子交換樹脂（pH1-2)分離aa:

(1)轉型：由H型→Na型（2）上樣：混合aa

（3）洗脫：提升洗脫液pH或離子強度

aa洗脫次序：先酸性aa、再中性aa、后堿性aa。若用陰離子交換樹脂分離aa，洗脫次序則相反。生物化學甲上氨基酸專家講座第30頁蛋白質存在于全部生物細胞中，是組成生物體最基本結構物質和功效物質。蛋白質是生命活動物質基礎，它參加了幾乎全部生命活動過程。Chapter4蛋白質共價結構生物化學甲上氨基酸專家講座第31頁Section1概述一、蛋白質定義蛋白質：是一切生物體中普遍存在，由天然氨基酸經過肽鍵連接而成生物大分子；其種類繁多，各含有一定相對分子質量，復雜分子結構和特定生物功效；是表示生物遺傳性狀一類主要物質。

二、蛋白質在生命中主要性

早在1878年，思格斯就在《反杜林論》中指出：“生命是蛋白體存在方式，這種存在方式本質上就在于這些蛋白體化學組成部分不停自我更新?！蹦軌蚩闯?，第一，蛋白體是生命物質基礎；第二，生命是物質運動特殊形式，是蛋白體存在方式；第三，這種存在方式本質就是蛋白體與其外部自然界不停新陳代謝。當代生物化學實踐完全證實并發(fā)展了恩格斯論斷生物化學甲上氨基酸專家講座第32頁

1.蛋白質是生命機體主要組成成份

蛋白質占干重人體中（中年人）人體45%水55%

細菌50%~80%蛋白質19%

真菌14%~52%脂肪19%

酵母菌14%~50%糖類＜1%

白地菌50%無機鹽7%2.蛋白質是一個生物功效主要表達者

（1）酶催化作用（2）調整作用(多肽類激素)

（3）運輸功效（4）運動功效（5）免疫保護作用(干擾素)

（6）接收、傳遞信息受體（7）毒蛋白生物化學甲上氨基酸專家講座第33頁3.外源蛋白質有營養(yǎng)功效，可作為生產加工對象.三、蛋白質組成1.元素組成

蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少許硫。一些蛋白質還含有其它一些元素，主要是磷、鐵、碘、碘、鋅和銅等。這些元素在蛋白質中組成百分比約為：碳50％氫7％氧23％氮16%

硫0—3％其它微量生物化學甲上氨基酸專家講座第34頁

氮占生物組織中全部含氮物質絕大部分。所以，能夠將生物組織含氮量近似地看作蛋白質含氮量。因為大多數蛋白質含氮量靠近于16%，所以，能夠依據生物樣品中含氮量來計算蛋白質大約含量

★蛋白質含量測定：

凱氏定氮法

(測定氮經典方法)

優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法也簡單；缺點：易將無機氮(如核酸中氮)

都歸入蛋白質中,不準確。普通，樣品含氮量平均在16%，取其倒數100/16=6.25，即為蛋白質換算系數，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有6.25g蛋白質）；故：※蛋白質含量=氮量×100/16×6.25

生物化學甲上氨基酸專家講座第35頁

除了上述法方外，還有

紫外比色法

雙縮脲法

Folin—酚

考馬斯亮蘭G—250比色法（條件：蛋白質必須是可溶）

2.化學組成（兩種類型）單純蛋白質：水解為α-氨基酸結合蛋白質=單純蛋白質+輔基

生物化學甲上氨基酸專家講座第36頁

四、蛋白質分類一.依據蛋白質外形分類按照蛋白質外形可分為球狀蛋白質和纖維狀蛋白質。1.球狀蛋白質：（globularprotein）外形靠近球形或橢圓形，溶解性很好，能形成結晶，大多數蛋白質屬于這一類。2.纖維狀蛋白質(fibrousprotein)分子類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質和不溶性纖維狀蛋白質。二.依據蛋白質組成份類

按照蛋白質組成，能夠分為1.簡單蛋白(simpleprotein)

：又稱為單純蛋白質；這類蛋白質只含由

-氨基酸組成肽鏈，不含其它成份。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。（3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。（4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。生物化學甲上氨基酸專家講座第37頁2.結合蛋白(conjugatedprotein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成份結合而成（1）色蛋白：由簡單蛋白與色素物質結合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。（2）糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質組成。如細胞膜中糖蛋白等。（3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。如血清

-，

-脂蛋白等。（4）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。如細胞核中核糖核蛋白等。（5）色蛋白：由簡單蛋白與色素結合而成。如血紅素、過氧化氫酶、細胞色素c等。（6）磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。生物化學甲上氨基酸專家講座第38頁

Section2肽(peptide)蛋白質是由一條或多條多肽(polypeptide)鏈以特殊方式結合而成生物大分子。蛋白質與多肽并無嚴格界限，通常是將分子量在6000道爾頓以上多肽稱為蛋白質。蛋白質分子量改變范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大

一.肽一個氨基酸氨基與另一個氨基酸羧基之間失水形成酰胺鍵稱為肽鍵，所形成化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成肽稱為二肽，由多個氨基酸組成肽則稱為多肽。組成多肽氨基酸單元稱為氨基酸殘基。

1.肽鏈生物化學甲上氨基酸專家講座第39頁

在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定次序排列，這種排列次序稱為氨基酸次序通常在多肽鏈一端含有一個游離

-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個游離

-羧基，稱為羧基端或C-端。氨基酸次序是從N-端氨基酸殘基開始，以C-端氨基酸殘基為終點排列次序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln生物化學甲上氨基酸專家講座第40頁

2.肽鍵

肽鍵特點是氮原子上孤對電子與羰基含有顯著共軛作用。組成肽鍵原子處于同一平面。肽鍵中C-N鍵含有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。在大多數情況下，以反式結構存在。生物化學甲上氨基酸專家講座第41頁

3.天然存在主要多肽

在生物體中，多肽最主要存在形式是作為蛋白質亞單位。不過，也有許多分子量比較小多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都含有特殊生理功效，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。生物化學甲上氨基酸專家講座第42頁

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-

+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Met-腦啡肽

Leu-腦啡肽生物化學甲上氨基酸專家講座第43頁二.蛋白質一級結構1.蛋白質一級結構(Primarystructure)包含：

(1)組成蛋白質多肽鏈數目.(2)多肽鏈氨基酸次序，

(3)多肽鏈內或鏈間二硫鍵數目和位置?！锲渲凶钪饕嵌嚯逆湴被岽涡?，它是蛋白質生物功效基礎。2.蛋白質一級結構測定

蛋白質氨基酸次序測定是蛋白質化學研究基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素一級結構以來，現在已經有上千種不一樣蛋白質一級結構被測定。(1)測定蛋白質一級結構要求

生物化學甲上氨基酸專家講座第44頁A.樣品必需純（>97%以上）；B.知道蛋白質分子量；C.知道蛋白質由幾個亞基組成；D.測定蛋白質氨基酸組成；并依據分子量計算每種氨基酸個數。E.測定水解液中氨量，計算酰胺含量。(2)測定步驟

①多肽鏈拆分：由多條多肽鏈組成蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).生物化學甲上氨基酸專家講座第45頁

②測定蛋白質分子中多肽鏈數目：經過測定末端氨基酸殘基摩爾數與蛋白質分子量之間關系，即可確定多肽鏈數目。

③二硫鍵斷裂：幾條多肽鏈經過二硫鍵交聯在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成巰基，以預防它重新被氧化。能夠經過加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間二硫鍵。生物化學甲上氨基酸專家講座第46頁

★巰基保護④測定每條多肽鏈氨基酸組成，并計算出氨基酸成份分子比；⑤分析多肽鏈N-末端和C-末端

★末端氨基酸測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸次序分析中，最主要是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定主要方法有：生物化學甲上氨基酸專家講座第47頁

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯法:在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）能夠與N-端氨基酸游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法優(yōu)點是丹磺酰-氨基酸有很強熒光性質，檢測靈敏度能夠到達1

10-9mol。生物化學甲上氨基酸專家講座第48頁肼解法：此法是多肽鏈C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水物質而與C-端氨基酸分離。生物化學甲上氨基酸專家講座第49頁

氨肽酶法：氨肽酶是一個肽鏈外切酶，它能從多肽鏈N-端逐一向里水解。根基不一樣反應時間測出酶水解所釋放出氨基酸種類和數量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質N-末端殘基次序。最慣用氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為N-末端肽鍵速度最大。羧肽酶法：羧肽酶是一個肽鏈外切酶，它能從多肽鏈C-端逐一水解。根基不一樣反應時間測出酶水解所釋放出氨基酸種類和數量，從而知道蛋白質C-末端殘基次序。當前慣用羧肽酶有四種：A,B,C和Y；A和B來自胰臟；C來自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外全部C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基肽鍵。⑥多肽鏈斷裂成多個肽段，可采取兩種或各種不一樣斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽選擇性降解方法有：生物化學甲上氨基酸專家講座第50頁酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶化學法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽鍵。生物化學甲上氨基酸專家講座第51頁⑦測定每個肽段氨基酸次序。⑧確定肽段在多肽鏈中次序：利用兩套或多套肽段氨基酸次序彼此間交織重合，拼湊出整條多肽鏈氨基酸次序。⑨確定原多肽鏈中二硫鍵位置：普通采取胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及次序分析，然后同其它方法分析肽段進行比較，確定二硫鍵位置。生物化學甲上氨基酸專家講座第52頁Chapter5蛋白質空間結構

Section1蛋白質三維結構內容及研究方法

Protein分子中原子或基團在三維空間分布、排列及肽鏈主鏈在空間走向。蛋白質這種天然結構決定于3個原因：（1）與溶劑分子相互作用（2）溶劑pH與離子組成（3）蛋白質aa序列（主要原因）生物化學甲上氨基酸專家講座第53頁一、蛋白質結構水平一級結構(primarystructure)：蛋白質分子中肽鍵、肽鏈、aa序列和二硫鍵位置。二級結構(secondarystructure):蛋白質主鏈在空間走向。三級結構(tertiarystructuer):由多個三維實體（結構域）組成近似球狀構象。四級結構(quaternarystructure):寡聚蛋白構象。生物化學甲上氨基酸專家講座第54頁在二級結構和三級結構之間還可細分為：超二級結構和結構域。超二級結構(supersecondarystructure)：若干相鄰二級結構單元相互作用，形成有規(guī)則組合體。結構域(structuredomain)：多肽鏈中相對獨立三維實體。生物化學甲上氨基酸專家講座第55頁蛋白質空間結構研究方法旋光色散法重氫交換法紫外差示光譜法核磁共振光譜激光拉曼光譜X-晶體衍射質子光譜色質聯用圓二色散熒光偏振光譜生物化學甲上氨基酸專家講座第56頁X-射線衍射法

生物化學甲上氨基酸專家講座第57頁Section2蛋白質二級結構蛋白質二級(Secondary)結構是指肽鏈主鏈在空間排列,或規(guī)則幾何走向、旋轉及折疊。它只包括肽鏈主鏈構象及鏈內或鏈間形成氫鍵。主要有

-螺旋、-折疊、-轉角。不一樣蛋白質二級結構是不一樣。生物化學甲上氨基酸專家講座第58頁肽平面（酰胺平面）生物化學甲上氨基酸專家講座第59頁

多肽鏈主鏈由許多酰胺平面組成，平面之間以α碳原子相隔。而Cα-C鍵和Cα-N鍵是單鍵，能夠自由旋轉，其中Cα-C鍵旋轉角度稱ψ，Cα-N鍵旋轉角度稱φ。ψ和φ這一對兩面角決定了相鄰兩個酰胺平面相對位置，也就決定了肽鏈構象。生物化學甲上氨基酸專家講座第60頁生物化學甲上氨基酸專家講座第61頁生物化學甲上氨基酸專家講座第62頁生物化學甲上氨基酸專家講座第63頁早在20世紀30年代，Pauling和Corey就開始有X-射線衍射方法研究了氨基酸和肽結構，他們得到了主要結論:(1)肽鍵鍵長介于C-N單鍵和雙鍵之間，含有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。(2)參加肽鍵形成兩個原子及相鄰四個原子處于同一平面，形成了酰胺平面，也稱肽鍵平面，又稱一個肽單位。

(3)酰胺平面中鍵長、鍵角是一定（4）在酰胺平面中C=0與N-H呈反式。（5）相鄰肽平面組成二面角生物化學甲上氨基酸專家講座第64頁在

-螺旋中肽平面鍵長和鍵角一定,肽鍵原子排列呈反式構型,相鄰肽平面組成兩面角.①多肽鏈中各個肽平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋結構，螺旋一周，沿軸上升距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間距離0.15nm.②肽鏈內形成氫鍵，氫鍵取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基酰胺基團-CO基與第四個氨基酸殘基酰胺基團-NH基形成氫鍵。③蛋白質分子為右手

-螺旋。左手和右手螺旋

1.-螺旋生物化學甲上氨基酸專家講座第65頁α-螺旋結構關鍵點以下：

①蛋白質多肽鏈像螺旋一樣盤曲上升，每3.6個氨基酸殘基螺旋上升一圈，每圈螺旋高度為0.54nm，每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm，螺旋上升時，每個殘基沿軸旋轉100o。②維系這種螺旋結構作用力是氫鍵，多肽主鏈上第n個殘基羰基和第n+4個殘基酰氨基形成氫鍵。③α-螺旋有右手螺旋和左手螺旋之分，天然蛋白質絕大部分是右手螺旋，到當前為止僅在嗜熱菌蛋白酶中發(fā)覺了一段左手螺旋。α-螺旋穩(wěn)定性主要靠氫鍵來維持。

生物化學甲上氨基酸專家講座第66頁生物化學甲上氨基酸專家講座第67頁

除了上面這種經典α-螺旋外，還有一些不經典α-螺旋，所以要求了相關螺旋寫法，用“nS”來表示，n為螺旋上升一圈氨基酸殘基數，S為氫鍵封閉環(huán)內原子數，經典α-螺旋用3.613表示，非經典α-螺旋有3.010，4.416（π螺旋）等。生物化學甲上氨基酸專家講座第68頁生物化學甲上氨基酸專家講座第69頁一些側鏈基團即使不參加螺旋，但他們可影響α-螺旋(1)、在多肽鏈中連續(xù)出現帶同種電荷極性氨基酸，α-螺旋就不穩(wěn)定。在多肽鏈中只要出現pro，α-螺旋就被中止，產生一個彎（bend）或結節(jié)（kink）（不能形成氫鍵，側鏈占據相鄰殘基空間），Pro常出現在α-螺旋末端；(2)、GlyR基太小，難以形成α-螺旋所需兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋最大破壞者。(3)、肽鏈中連續(xù)出現帶龐大側鏈氨基酸如Ile，因為空間位阻，也難以形成α-螺旋。生物化學甲上氨基酸專家講座第70頁α-螺旋在不一樣蛋白質中情況α-角蛋白：全部由α-螺旋組成肌紅蛋白：大部分由α-螺旋組成溶菌酶：僅含一部分α-螺旋鐵氧還蛋白：完全不含有α-螺旋生物化學甲上氨基酸專家講座第71頁

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展肽鏈平行排列，經過鏈間氫鍵交聯而形成。肽鏈主鏈呈鋸齒樁折疊構象。①在

-折疊中，

-碳原子總是處于折疊角上，氨基酸R基團處于折疊棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間軸心距為0.35nm.②

-折疊結構氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成；也能夠在同一肽鏈不一樣部分之間形成。幾乎全部肽鍵都參加鏈內氫鍵交聯，氫鍵與鏈長軸靠近垂直。③

-折疊有兩種類型。一個為平行式，即全部肽鏈N-端都在同一邊。另一個為反平行式，即相鄰兩條肽鏈方向相反。2.

-折疊生物化學甲上氨基酸專家講座第72頁β-折疊有平行和反平行兩種形式:平行：兩條肽鏈或肽段走向相同；反平行：走向相反生物化學甲上氨基酸專家講座第73頁在

-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成.四個形成轉角殘基中，第三個普通均為甘氨酸殘基．彎曲處第一個氨基酸殘基-C=O和第四個殘基–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定環(huán)狀結構。這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。４.自由回轉沒有一定規(guī)律渙散肽鏈結構，但仍是緊密有序穩(wěn)定結構，經過主鏈間及主鏈與側鏈間氫鍵維持其構象．不一樣蛋白質，自由回轉數量和形式各不相同．分兩類：①緊密環(huán)②連接條帶3.

-轉角生物化學甲上氨基酸專家講座第74頁１、超二級結構在蛋白質分子中，由若干相鄰二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則、在空間上能識別二級結構組合體。幾個類型超二級結構：αα；ββ；βαβ；βββ．

★超二級結構在結構層次上高于二級結構，但沒有聚集成含有功效結構域．ααβββαβSection3超二級結構和結構域生物化學甲上氨基酸專家講座第75頁

對于較大蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個或兩個以上相對獨立三維實體締合而成三級結構。這種相對獨立三維實體就稱結構域。結構域通常是幾個超二級結構組合，對于較小蛋白質分子，結構域與三級結構等同，即這些蛋白為單結構域。結構域普通由100~200個氨基酸殘基組成，但大小范圍可達40~400個殘基。氨基酸能夠是連續(xù)，也能夠是不連續(xù)．結構域之間常形成裂隙，比較渙散，往往是蛋白質優(yōu)先被水解部位。酶活性中心往往位于兩個結構域界面上．結構域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構象有一定柔性，經過結構域之間相對運動，使蛋白質分子實現一定生物功效。在蛋白質分子內，結構域可作為結構單位進行相對獨立運動，水解出來后仍能維持穩(wěn)定結構，甚至保留一些生物活性．２、結構域生物化學甲上氨基酸專家講座第76頁常見結構域：EF-hand(EF-handCa2+-bindingmotif)EF手型鈣結合性模體（基序）Zincfinger（鋅指結構）Leucinzipper（亮氨酸拉鏈結構）生物化學甲上氨基酸專家講座第77頁：有時一個結構域就是蛋白質功效域。包含一個但通常是多個結構域?！锝Y構域與功效域關系生物化學甲上氨基酸專家講座第78頁Section4蛋白質三級結構1、定義：蛋白質三級結構是指多肽鏈在各種二級結構基礎上深入盤旋、折疊，從而生成特定空間結構（球狀）。包含主鏈和側鏈全部原子空間排布．普通非極性側鏈埋在分子內部，形成疏水核，極性側鏈在分子表面．生物化學甲上氨基酸專家講座第79頁2、特點：球狀蛋白質溶于水。

親水R基位于球狀表面，疏水R基位于球狀內部，含有兩個以上相對獨立三維結構實體（結構域）。

3、經典代表：肌紅蛋白

是哺乳動物肌肉中儲存O2蛋白質，由153個氨基酸組成單鏈蛋白，分子量17.8KD（人），16.7KD（鯨）。生物化學甲上氨基酸專家講座第80頁結構（1）球型結構4×3.5×2.5nm。（2）肽鏈75%組成α-螺旋，具8個α-螺區(qū)。（3）Pro,Ile,Ser,Thr,Asn都出現在拐彎處。（4）分子疏水基都聚集在內部，整個分子致密堅固，分子內部只有一個適于包含4個水分子空間。（5）含有一個血紅素輔基，垂直伸出表面，卟啉Fe有6個配位鍵，其中4個與卟啉環(huán)上N原子相連，1個與蛋白肽鏈中His咪唑基相連，另1個用于結合氧氣。生物化學甲上氨基酸專家講座第81頁一、定義：

許多蛋白質是由兩個或兩個以上獨立三級結構經過非共價鍵結合成多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中每個獨立三級結構單元稱為亞基。蛋白質四級結構是指亞基種類、數量以及各個亞基在寡聚蛋白質中空間排布和亞基間相互作用。四級結構中，肽鏈之間是以非共價鍵相連。包含均一寡聚蛋白：相同亞基組成非均一寡聚蛋白：由不一樣亞級組成。Section5蛋白質四級結構生物化學甲上氨基酸專家講座第82頁二、實例：血紅蛋白血紅蛋白四級結構測定由佩魯茨1958年完成，其結構關鍵點為：球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個亞基兩條α鏈，兩條β鏈，α2β2α鏈：141個殘基；β鏈：146個殘基分子量65000含四個血紅素輔基親水性側鏈基團在分子表面，疏水性基團在分子內部生物化學甲上氨基酸專家講座第83頁血紅蛋白性質：

1、協(xié)同效應

2、別構效應

3、玻爾效應生物化學甲上氨基酸專家講座第84頁

一級結構→二級結構→超二級結構→結構域→三級結構→亞基→四級結構三．蛋白質空間結構作用力生物化學甲上氨基酸專家講座第85頁維系蛋白質分子一級結構：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質分子二級結構：氫鍵維系蛋白質分子三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質分子四級結構：范德華力、鹽鍵a鹽鍵（離子鍵）b氫鍵c疏水相互作用力

d范德華力e二硫鍵f酯鍵生物化學甲上氨基酸專家講座第86頁氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵氫鍵、范德華力即使鍵能小，但數量大疏水相互作用力對維持三級結構尤其主要鹽鍵數量小二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質構象很主要，二硫鍵越多，蛋白質分子構象越穩(wěn)定離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力生物化學甲上氨基酸專家講座第87頁四、aa次序與空間構象關系1、核糖核酸酶復性試驗

在8mol/L尿素存在下，用巰基乙醇處理，是4個二硫鍵斷裂，整個肽鏈渙散無規(guī)則，酶活性散失。用透析法除去尿素和巰基乙醇，此酶又恢復活性達原來95%以上，復性后酶理化性質與原來也一樣。在105中組合中，只選擇了其中一個（天然構象）。此試驗證實：蛋白質一級結構決定它高級結構。即一維信息決定三維構象。生物化學甲上氨基酸專家講座第88頁2、aa種類、次序與空間構象關系：

Pro,Hyp不參加α-螺旋形成。

Ile,Asn,Ser,Thr形成α-螺旋不穩(wěn)定。

Gly形成α-螺旋不規(guī)則。側鏈R基對α-螺旋有影響，帶同種電荷R基相互排斥。生物化學甲上氨基酸專家講座第89頁Chapter6蛋白質分子結構與功效關系一.蛋白質一級結構與功效關系研究蛋白質一級結構與功效關系主要是：研究多肽鏈中不一樣部位殘基與生物功效關系。進行這方面研究慣用方法有：同源蛋白質氨基酸次序相同性分析、氨基酸殘基化學修飾及切割試驗等。例1鐮刀形貧血病患者血紅細胞合成了一個不正常血紅蛋白（Hb-S）它與正常血紅蛋白（Hb-A）差異：僅僅在于β鏈N-末端第6位殘基發(fā)生了改變（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性纈氨酸殘基使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血這說明了蛋白質分子結構與功效關系高度統(tǒng)一性生物化學甲上氨基酸專家講座第90頁例2一級結構局部斷裂與蛋白質激活

體內一些蛋白質分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質原.蛋白質原部分肽鏈以特定方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟胰島素分子大一倍多單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈胰島素分子單體.生物化學甲上氨基酸專家講座第91頁

同源蛋白：是指在不一樣有機體中實現同一功效蛋白質.同源蛋白中一級結構中有許多位置氨基酸對全部種屬來說都是相同，稱為不變殘基；其它位置氨基酸稱可變殘基.不一樣種屬可變殘基有很大改變.可用于判斷生物體間親緣關系遠近.例：細胞色素C60個物種中，有27個位置上氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發(fā)揮特有功效所必要部位，屬于不變殘基.可變殘基可能伴隨進化而變異，而且不一樣種屬細胞色素C氨基酸差異數與種屬之間親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.例3同源蛋白生物化學甲上氨基酸專家講座第92頁黃色：不變殘基（invariableresidues）藍色：保守氨基酸（conservativeresidues）未標識：可變殘基（variableresidues）二.蛋白質構象與功效關系

別構效應：又稱變構效應，是指寡聚蛋白與配基結合，改變蛋白質構象，造成蛋白質生物活性改變現象.它是細胞內最簡單調整方式.例：血紅蛋白別構效應一個亞基與氧結合后，引發(fā)該亞基構象改變進而引發(fā)另三個亞基構象改變整個分子構象改變與氧結合能力增加生物化學甲上氨基酸專家講座第93頁Chapter7蛋白質性質及分離純化一.蛋白質分子大小蛋白質是分子量很大生物分子，相對分子質量大于10000.最高可達40000000（煙草花葉病毒）．

蛋白質相對分子質量測定方法1.依據化學成份測定最小相對分子質量此法首先利用化學分析方法測定蛋白質分子中某一特殊成份百分含量然后，假定蛋白質分子中該成份只有一個，據其百分含量可計算出最低相對分子質量：最小相對分子質量＝（已知成份相對分子、原子質量）/已知成份百分含量假如蛋白質分子中所含已知成份不是一個單位，則真實相對分子質量等于最小相對分子質量倍數。2.

超離心法在60000～80000r/min高速離心力作用下，蛋白質分子會沿旋轉中心向外周方向移動用光學方法測定界面移動速度即為蛋白質離心沉降速度蛋白質沉降速度與分子大小和形狀相關生物化學甲上氨基酸專家講座第94頁沉降系數是溶質顆粒在單位離心場中沉降速度，用S表示。一個S單位，為1×10-13秒相對分子質量越大，S值越大蛋白質沉降系數：1～200S

由沉降系數S可依據斯維得貝格〔Svedberg〕方程計算蛋白質分子相對分子質量：

M=RST/D〔1－vρ〕R：氣體常數T：絕對溫度

D：擴散系數ρ：溶劑密度3.凝膠過濾法凝膠過濾所用介質為凝膠珠，其內部為多孔網狀結構一定型號凝膠網孔大小一定，只允許對應大小分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積??；小分子在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質分子量普通用葡聚糖，商品名：Sephadex生物化學甲上氨基酸專家講座第95頁測得幾個標準蛋白質洗脫體積〔Ve〕以相對分子質量對數（logM）對Ve作圖，得標準曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標準曲線上可查出樣品蛋白質相對分子質量4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質電泳泳動速率取決于荷質比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質變性（肽鏈伸展）并與SDS結合，形成SDS-蛋白質復合物不一樣蛋白質分子均帶負電（SDS帶負電）；且荷質比相同（蛋白質分子大，結合SDS多；分子小，結合SDS少）不一樣蛋白質分子含有相同構象用幾個標準蛋白質相對分子質量對數值對它們遷移率作圖測出待測樣品遷移率從標準曲線上查出樣品相對分子質量生物化學甲上氨基酸專家講座第96頁

★影響遷移率主要原因凝膠分子篩效應對長短不一樣棒形分子