免疫學檢測技術的基本原理

關于免疫學檢測技術的基本原理第一節(jié)體外免疫反應的特點及影響因素※※(一)抗原抗體反應的特點高度特異性特異性越強，親和力也越高；表面化學基團之間的可逆結合抗原抗體結合除了空間結構互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等非共價結合。不如共價鍵穩(wěn)定，易受溫度、酸堿度和離子強度的影響而解離，解離后抗原抗體仍具有原有特性；適宜的抗原抗體濃度和比例決定抗原抗體結合后能否出現(xiàn)肉眼可見的反應；抗原抗體反應的2個階段第1階段是抗原抗體特異性結合，可在數(shù)秒鐘至幾分鐘內完成；第2階段是小的抗原抗體復合物靠正負電荷吸引形成較大復合物，所需時間從數(shù)分鐘至數(shù)日不等。第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天(二)抗原抗體反應的影響因素電解質抗原抗體等電點分別為pH3-5和pH5-6，在中性或弱堿性條件下表面帶有較多負電荷，適當濃度的電解質會使它們失去一部分負電荷而相互結合；溫度通常為37℃，適當提高反應溫度可增加抗原與抗體分子的碰撞機會，但56℃以上可使抗原或抗體變性失活；酸堿度抗原抗體反應的最適pH值在6-8之間，pH值過高或過低均可直接影響抗原抗體的理化性質。當pH值接近等電點時，抗原抗體多帶正負電荷相等，由于自身吸引而出現(xiàn)凝集，導致非特異性反應。第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)檢測抗原和抗體的體外實驗第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天AbAg高親和力AbAg低親和力特異性結合力的表示方法親和力和親合力低親合力高親合力Ag-Ab反應的原理第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天Ab過剩Ag過剩比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡Ag-Ab反應的可見性第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1.凝集反應直接凝集反應1:2稀釋待測血清1:41:81:16細菌、細胞等顆粒性Ag或表面包被抗原的顆粒狀物質與相應Ab在電解質存在的情況下結合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。玻片法試管法常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定常用于檢測抗體的滴度或效價，見于臨床診斷傷寒或副傷寒所用的肥達氏反應和診斷布氏菌病所用的瑞特試驗。第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天間接凝集反應將可溶性Ag/Ab先吸附在某些顆粒載體上，形成致敏顆粒，然后再與相應Ab/Ag進行反應產生凝集，叫間接凝集反應。如將溶血毒素O吸附于乳膠顆粒上的抗“O”試驗、人IgG作為Ag吸附于乳膠顆粒上的類風濕因子檢測。凝集反應常用于溶血性疾病的診斷：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC體內anti-Rh由于抗體多屬于IgG，分子量較小，抗體與紅細胞間的結合力不能克服細胞間的排斥力，不出現(xiàn)凝集+YYYYYYYYYYYYYYY體外加入抗人IgG出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫直接庫姆試驗正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清內的游離anti-Rh+Y體外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，叫間接庫姆試驗第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2.沉淀反應AgAgAgAgAbingel單向免疫擴散Ag1AbAg2Ag3Ag4雙向免疫擴散免疫比濁過量AbAbAbAb毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應抗體反應后，出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。鑒定多種抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于確定抗原濃度第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天沉淀反應—免疫電泳存在于不同區(qū)域的抗原與抗體結合，在比例適宜處形成沉淀弧。沉淀弧的數(shù)量、位置和形狀與標準品相對比，可分析樣品的成分及其性質。第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3.免疫標記技術免疫酶測定法免疫熒光技術放射免疫測定法免疫膠體金技術第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天①免疫酶測定法夾心法ELISA間接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白為橋梁微粒捕獲酶免疫分析技術將已知特異性抗體致敏的免疫微粒與生物素、親和素、酶相結合，最后酶作用于熒光底物發(fā)光，通過檢測熒光強度判斷未知抗原的含量。a）b）第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天免疫組化技術定位、定性、定量檢測第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天②免疫熒光技術第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天③放射免疫測定用放射性核素標記抗原或抗體進行的免疫測定。將同位素的敏感性與抗原抗體結合的特異性結合起來，具有重復性好、準確性高等優(yōu)點，廣泛應用于激素、藥物等微量物質的檢測。常用的有131I、125I。④化學發(fā)光免疫技術將化學發(fā)光分析和免疫反應相結合而建立的一種新的免疫分析技術。最常用的發(fā)光物質是魯米諾。靈敏度高、簡便、可實現(xiàn)自動化分析。第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天⑤免疫膠體金技術用膠體金顆粒標記Ab/Ag，以檢測未知Ag/Ab的方法。氯金酸在還原劑作用下，可聚合成特定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液，因靜電作用而呈穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。該技術可應用于免疫組化(光鏡下檢查)和免疫層析快速診斷。第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天⑥免疫印跡法-Westernblotting第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天4.蛋白質芯片技術又稱為蛋白質微列陣，指固定于支持介質上的大量蛋白質構成的微列陣。根據(jù)蛋白質分子間特異性結合的原理，可實現(xiàn)快速、準確、高通量的檢測。第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)免疫細胞功能的檢測淋巴細胞及其亞群的分離免疫細胞功能測定磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術肽—MHC四聚體技術T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天外周血單個核細胞的分離稀釋血液淋巴細胞分離液(葡聚糖-泛影葡胺r=1.078)離心單個核細胞(PBMC，包括淋巴細胞、DC和NK)紅細胞和粒細胞血漿第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天磁珠分離法免疫吸附分離法流式細胞術肽—MHC四聚體技術淋巴細胞及其亞群的分離第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天免疫吸附分離法加入淋巴細胞懸液anti-CD4anti-CD4anti-CD4棄上清第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天磁珠分離法第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天流式細胞術熒光抗體標記混合細胞噴嘴單細胞懸液5000-10000個/秒細胞分選器熒光檢測器第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天抗原肽-MHC四聚體分離技術親和素抗原肽MHCI生物素anti-CD8肽-四聚體肽特異性CD8TCD4T及B非肽特異性CD8T熒光素第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天二、免疫細胞功能的測定T細胞功能測定B細胞功能測定細胞因子檢測T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測抗體含量測定溶血空斑試驗巨噬細胞吞噬試驗細胞毒試驗吞噬功能測定51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法凋亡細胞檢測法硝基藍四氮唑試驗生物活性檢測法免疫學檢測法第26頁,共34頁，2024年2月25日，星期天T細胞功能測定T細胞增殖試驗遲發(fā)型超敏反應的檢測T細胞受到特異性抗原或有絲分裂原刺激后發(fā)生增殖，可通過以下三種方法檢測：形態(tài)計數(shù)法：活化細胞體積增大、形態(tài)不規(guī)則、胞質增多、細胞核松散及出現(xiàn)較多核仁；3H-TdR或125I-UdR摻入法：3H-TdR能摻入到合成的DNA中，用液體閃爍儀檢測樣品的放射活性，特點是靈敏可靠，但須特殊儀器，易有放射性污染。MTT(四甲基偶氮唑鹽)比色法：外來抗原刺激機體產生免疫應答后，再用相同的抗原作皮試，可導致遲發(fā)型超敏反應，T細胞活化并釋放多種細胞因子，產生以單個核細胞浸潤為主的炎癥，局部發(fā)生充血滲出，24-48h發(fā)生，72h到達高峰。陽性反應表現(xiàn)為局部紅腫和硬結，反應強烈的發(fā)生水腫甚至壞死。細胞免疫正常者出現(xiàn)陽性反應，細胞免疫低下者呈弱陽性或陰性反應。常用于檢測某些微生物感染。第27頁,共34頁，2024年2月25日，星期天B細胞功能測定抗體含量測定溶血空斑試驗可通過單項瓊脂擴散法、ELISA、速率比濁法等測定標本中各類Ig的含量。綿羊紅細胞(SRBC)免疫動物4天后取出動物脾臟，在脾細胞懸液中含有抗SRBC的漿細胞脾細胞與SRBC在適量瓊脂糖液中混勻在抗體形成細胞周圍出現(xiàn)溶解的透明區(qū)，即溶血空斑。1個空斑區(qū)代表1個漿細胞通過記錄溶血空斑的數(shù)目可知抗原特異性B細胞的數(shù)目加入新鮮補體，倒入平皿中培養(yǎng)第28頁,共34頁，2024年2月25日，星期天細胞毒試驗51Cr釋放法乳酸脫氫酶釋放法細胞染色法靶細胞被殺傷后，向體系中加入臺盼蘭，可進入膜破損的細胞內，將細胞染成藍色?；罴毎苋径恢?。第29頁,共34頁，2024年2月25日，星期天凋亡細胞檢測法瓊脂糖電泳法正常細胞基因組DNA凋亡細胞TUNEL法在細胞中加入末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和生物素標記的核苷酸TdT能在游離的DNA3’端缺口連接標記的核苷酸加入親和素-酶復合物，在DNA斷裂處顯色流式細胞術AnnexinVPI凋亡早期凋亡晚期壞死期第30頁,共34頁，2024年2月25日，星期天巨噬細胞吞噬試驗吞噬功能測定硝基藍四氮唑(NBT)試驗NBT在殺菌過程中產生反應性氧中間物，其中超氧陰離子能使被吞噬進細胞內的NBT還原成不溶性藍黑色甲臜顆粒，沉積于胞漿中。光鏡下計數(shù)NBT陽性細胞可反映PMN的殺傷功能。將待測mf與雞紅細胞混合溫育后，雞紅細胞被mf吞噬，根據(jù)吞噬百分率確定mf吞噬能力。吞噬百分率=吞有紅細胞的mf/mf總數(shù)第31頁,共34頁，2024年2月25日，星期天細胞因子檢測生物活性檢測法免疫學檢測法夾