免疫檢測技術(shù)

關(guān)于免疫檢測技術(shù)免疫檢測是目前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛的一種方法。具有高度精確、靈敏、特異的特點(diǎn)?？捎糜诿庖邔W(xué)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。第2頁,共53頁，2024年2月25日，星期天1、免疫疾病診斷

2、動物植物生理活動研究（激素、維生素）

3、物種及微生物鑒定

4、動物、植物性狀的免疫標(biāo)記

5、免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究

6、發(fā)病機(jī)理研究

7、分子生物學(xué)研究

免疫檢測技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用：第3頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理

抗體能特異性地識別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測出的反應(yīng)現(xiàn)象。

試驗時既可用已知抗體檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體。這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ)!!第4頁,共53頁，2024年2月25日，星期天一、體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)①特異性：抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。②可逆性：抗原抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定，但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）③比例性：抗原抗體的比例合適，才可出現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）④階段性：特異性結(jié)合階段和可見反應(yīng)階段。第5頁,共53頁，2024年2月25日，星期天網(wǎng)格理論——解釋抗原抗體形成沉淀的機(jī)制第6頁,共53頁，2024年2月25日，星期天網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）抗體過剩抗原過?？贵w抗體比例合適抗原抗體第7頁,共53頁，2024年2月25日，星期天二、影響抗原抗體反應(yīng)的因素①溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提高溫度可加速反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間，常用反應(yīng)溫度為37-45℃。②溶液的pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，因此溶液的pH應(yīng)適宜（pH6-8）。③電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì)（0.85%NaCl）參與，否則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。第8頁,共53頁，2024年2月25日，星期天三、抗原抗體反應(yīng)類型1.沉淀反應(yīng)2.凝集反應(yīng)3.補(bǔ)體參與的反應(yīng)4.中和反應(yīng)5.免疫標(biāo)記技術(shù)第9頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)常見免疫檢測方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng)。一、免疫沉淀反應(yīng)第10頁,共53頁，2024年2月25日，星期天一、免疫沉淀反應(yīng)

1.液相沉淀反應(yīng)2.凝膠擴(kuò)散沉淀3.凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗雙向瓊脂擴(kuò)散試驗血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡等第11頁,共53頁，2024年2月25日，星期天絮狀沉淀試驗操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度的適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，目前多用以測定抗原抗體反應(yīng)的最適比。第12頁,共53頁，2024年2月25日，星期天環(huán)狀沉淀試驗操作步驟：（1）用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，避免產(chǎn)生氣泡。（已知?。?）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。（待測?。?）置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原的定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。

（診斷炭疽的Ascoli實(shí)驗、細(xì)菌分型、血跡鑒定）。

第13頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2.凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最常用的方法為：①單向瓊脂擴(kuò)散試驗②雙向瓊脂擴(kuò)散試驗第14頁,共53頁，2024年2月25日，星期天單向瓊脂擴(kuò)散試驗

原理：

將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測的抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散，并在小孔周圍合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。第15頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

單向免疫擴(kuò)散試驗示意圖第16頁,共53頁，2024年2月25日，星期天雙向免疫擴(kuò)散試驗

雙向免疫擴(kuò)散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析。第17頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共53頁，2024年2月25日，星期天3.免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微的分析。免疫電泳包括:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

第19頁,共53頁，2024年2月25日，星期天血清免疫電泳將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行的小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異，即血清蛋白組分的缺少或增加。第20頁,共53頁，2024年2月25日，星期天免疫電泳原理圖解第21頁,共53頁，2024年2月25日，星期天火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散。第22頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

沉淀線的高度與抗原量成正比火箭電泳圖第23頁,共53頁，2024年2月25日，星期天二、凝集反應(yīng)（Agglutination）

顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與相應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng)。

1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。

2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。第24頁,共53頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共53頁，2024年2月25日，星期天妊娠免疫診斷試驗

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。第26頁,共53頁，2024年2月25日，星期天三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗（2個系統(tǒng)，5種成分）第27頁,共53頁，2024年2月25日，星期天已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體的紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg三、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗（2個系統(tǒng)，5種成分）第28頁,共53頁，2024年2月25日，星期天免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)記技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進(jìn)行定位分析，且大大提高了方法的靈敏度，是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。四、免疫標(biāo)記技術(shù)第29頁,共53頁，2024年2月25日，星期天常見標(biāo)記免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)

四、免疫標(biāo)記技術(shù)第30頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害，但由于其具有高度的靈敏度（pg）和自動化檢測等特點(diǎn)，因此在實(shí)驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥物、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析。1.放射免疫技術(shù)（125I）第31頁,共53頁，2024年2月25日，星期天放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原（Ag*）和非標(biāo)記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力第32頁,共53頁，2024年2月25日，星期天

Ag*AbAg

標(biāo)記抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量

測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測定法(RIA)示意圖第33頁,共53頁，2024年2月25日，星期天RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)記抗原濃度（ng/mL)結(jié)合/未結(jié)合的放射活性（%）Ag*-AbAg*第34頁,共53頁，2024年2月25日，星期天將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標(biāo)記抗體，制成熒光抗體診斷試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原的存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)第35頁,共53頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標(biāo)記的特異性抗體組織切片第36頁,共53頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標(biāo)記的抗抗體組織切片待測抗體第37頁,共53頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光染色顯示細(xì)胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合的原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位。常用于抗原、抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa－350用Alexa488標(biāo)記的抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細(xì)胞免疫熒光染色第38頁,共53頁，2024年2月25日，星期天本法是抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測技術(shù)。酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合，根據(jù)酶作用底物后的顏色變化，采用肉眼或酶標(biāo)檢測儀分析、判斷結(jié)果。常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者常用于檢測組織中或細(xì)胞表面的抗原。3.免疫酶測定法第39頁,共53頁，2024年2月25日，星期天是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。實(shí)驗中常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：第40頁,共53頁，2024年2月25日，星期天ELISA試驗三個必要的試劑(1)固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）(3)酶作用的底物（顯色劑）第41頁,共53頁，2024年2月25日，星期天底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234基本步驟第42頁,共53頁，2024年2月25日，星期天五種常見的檢測方法1雙抗夾心法（測定抗原）2測定抗體的間接法3競爭法（測定抗原）4捕獲包被法測IgM抗體5ABS-ELISA法第43頁,共53頁，2024年2月25日，星期天適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及低于二價的小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心

1雙抗夾心法測抗原第44頁,共53頁，2024年2月25日，星期天2間接法測抗體第45頁,共53頁，2024年2月25日，星期天幾種標(biāo)記/檢測技術(shù)靈敏度的比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9第46頁,共53頁，2024年2月25日，星期天幾種標(biāo)記/檢測試劑的有效期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630第47頁,共53頁，2024年2月25日，星期天020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測定技術(shù)的成本及費(fèi)用三種免疫測定技術(shù)的成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光第48頁,共53頁，2024年2月25日，星期天A