成體干細胞及組織工程學

關于成體干細胞及組織工程學什么是成體干細胞？

（somaticstemcelloradultstemcells）指存在于分化組織中的未分化細胞，具有自我更新、構建和補充相應組織中各種類型細胞的潛能。成體干細胞存在于機體的各種組織器官中。2第2頁,共48頁，2024年2月25日，星期天主要的成體干細胞：造血干細胞（hematopoieticstemcell,HSC）骨髓間充質干細胞（mesenchymalstemcell,MSC）神經干細胞（neuralstemcell,NSC）表皮干細胞（epidexmisstemcell,ESC）臍血干細胞（cordbloodstemcell）腫瘤干細胞（cancerstemcell）3第3頁,共48頁，2024年2月25日，星期天CSCsandstemcellniche在腫瘤細胞中存在著小部分的腫瘤干細胞（cancerstemcells,CSCs），是腫瘤形成、復發(fā)、轉移和耐藥的決定性原因和基礎。4第4頁,共48頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞來源：可能是胚胎細胞殘留于機體，并在干細胞微環(huán)境的作用下保持靜息狀態(tài)。存留的組織需要修復，便在特定微環(huán)境下被激活并分化成所需的細胞。5第5頁,共48頁，2024年2月25日，星期天成體干細胞三大特征：自我更新種系定向分化能力：具有多能分化特性，能夠分化為特定組織的多種細胞類型，但分化潛能有限。在特定組織定居：大多數成體干細胞處于休眠狀態(tài)（G0期），病理因素或誘導后表現再生和更新能力，替代受損細胞或死亡細胞。

6第6頁,共48頁，2024年2月25日，星期天胚胎干細胞與成體干細胞具有自我更新和分化形成任何類型細胞的能力，有形成完整個體的分化潛能?？煞只蔀槿?00多種細胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官。胚胎干細胞——全能干細胞(totipotentstemcell)7第7頁,共48頁，2024年2月25日，星期天多能干細胞能產生多種類型細胞的能力，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。單能干細胞只能向單一方向分化，產生一種類型的細胞。成體干細胞——多能干細胞(pluripotentstemcell)或單能干細胞(unipotentstemcell)8第8頁,共48頁，2024年2月25日，星期天干細胞橫向分化（transdifferentiation）組織干細胞通過活化潛在的其他分化程序，改變了組織干細胞的特異性種系分化進程，可分化成其它組織細胞的能力。造血干細胞向非造血組織細胞分化、神經干細胞向血液系統(tǒng)細胞分化9第9頁,共48頁，2024年2月25日，星期天造血干細胞（HSC）胚胎期——定位于胎肝（Fetalliver,FL）成年哺乳動物——骨髓，外周血、臍帶血轉錄因子MLL（mixed-lineage-leukemiagene），RunX1，TEL/ETV6，SCL/Tal1，LMO2對胚胎期HSC分化發(fā)育有重要調節(jié)作用。

10第10頁,共48頁，2024年2月25日，星期天HSC特性：HSC的更新與分化：采用不對稱的分裂方式：其中一個細胞仍然保持干細胞的一切生物特性，從而保持HSC數量相對穩(wěn)定，這就是干細胞自我更新。另一個則進一步增殖分化為各類血細胞、前體細胞和成熟血細胞，釋放到外周血中，執(zhí)行各自任務，直至衰老死亡，這一過程是不停地進行著的11多向分化潛能自我更新第11頁,共48頁，2024年2月25日，星期天造血干細胞的分化：11第12頁,共48頁，2024年2月25日，星期天造血干細胞微環(huán)境

血管周圍微環(huán)境、骨內膜微環(huán)境：維持干細胞“干性”13第13頁,共48頁，2024年2月25日，星期天造血干細胞的分離與鑒定人HSC表面標志物：CD34+、Lin-、c-kit+、sca-1+，Thy-1,IL-7Ra,Flt3,CD150。流式細胞分選技術，免疫磁珠分選。HSC的功能鑒定：致死劑量放射線照射動物，HSC移植可以重建骨髓的造血功能，長期（>16周）產生多系成熟血液細胞。

14第14頁,共48頁，2024年2月25日，星期天骨髓間充質干細胞(MSC)

主要從骨髓中分離，胎盤、脂肪組織、臍血和肝臟也存在MSC。人MSC標志物：CD73+、CD90+、CD105+、CD45-小鼠MSC標志物：Sca-1+、CD90+、CD45-

15第15頁,共48頁，2024年2月25日，星期天16MSC在低血清培養(yǎng)基中具貼壁優(yōu)勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，可純化及擴增MSC全骨髓法根據骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養(yǎng)密度梯度離心法MSC的主要分離手段流式或磁珠分選后的細胞出現增殖緩慢，成本較高、技術難度較大，限制了這些方法的廣泛應用流式細胞儀法、免疫磁珠法第16頁,共48頁，2024年2月25日，星期天17向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等多種細胞分化MSC的分化第17頁,共48頁，2024年2月25日，星期天骨髓中的多向分化干細胞（骨、軟骨、脂肪、肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞、肝細胞）；容易獲得；體外擴增109倍仍不失多向分化潛能；外源基因容易插入；免疫原性較弱；常見的組織工程種子細胞18MSC的優(yōu)點第18頁,共48頁，2024年2月25日，星期天肝干細胞的可能位置：位于Hering’s管區(qū)域內，直接參與肝臟的生長和發(fā)育，同時也是肝細胞再生的重要細胞來源。HSC、臍帶血干細胞和MSC在一定培養(yǎng)條件下也可以向肝細胞分化。肝干細胞(hepaticstemcell)19第19頁,共48頁，2024年2月25日，星期天角蛋白19(cytokeratin19,CK19)神經細胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule，NCAM)上皮細胞粘附分子(EpCAM)claudin-3(CLDN-3)人肝干細胞特征性標志物20第20頁,共48頁，2024年2月25日，星期天細胞因子：成纖維細胞生長因子2(FGF-2)、人activinA、肝細胞生長因子(HGF)、骨形成蛋白2(BMP2)化學誘導劑：DMSO、地塞米松(Dex)、丁酸鈉(NaB)、制瘤素(OSM)肝干細胞定向分化肝干細胞誘導分化因子21第21頁,共48頁，2024年2月25日，星期天實例：2000年8月，日本筑波大學把鼠肝干細胞體外培養(yǎng)后，移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干細胞發(fā)育成新的肝組織，分泌出鼠肝特異清蛋白。肝干細胞定向分化22第22頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1992年Reynolds和Weiss首先從成年小鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC。1998年，Okano報道，成人腦室下區(qū)存在神經干細胞。1999年，Johnasson證實，成年哺乳動物腦室管壁的室管膜細胞是神經干細胞。1999年，Doetsch報道，成年哺乳動物腦內室下區(qū)的星形膠質細胞是神經干細胞。神經干細胞(NSC)NSC的可能位置23第23頁,共48頁，2024年2月25日，星期天巢蛋白(nestin)：一個比較公認的神經干細胞標志物。僅在胚胎早期神經上皮表達，出生后停止表達。一旦神經前體細胞分化即停止表達A2B5蛋白Vimentin膠質細胞標志物(GFAP)等細胞表面抗原：CD133+/CD34-/CD45-；NSC的表面標志物24第24頁,共48頁，2024年2月25日，星期天帕金森病(Parkinsondisease，PD)阿爾茲海默病(Alzheimerdisease，AD)亨廷頓病(Huntingtondisease，HD)25神經干細胞的臨床應用第25頁,共48頁，2024年2月25日，星期天首都醫(yī)科大學附屬神經外二科主任黃紅云等自2001年起在世界上率先開展流產胎（嬰）兒嗅鞘細胞(一種NSC)移植治療脊髓損傷。已經治療近400例，部分完全性脊髓損傷患者恢復部分功能。26第26頁,共48頁，2024年2月25日，星期天表皮干細胞(Skinstemcell,SSC)---SSC的來源或部位：

表皮干細胞：基底細胞毛囊干細胞：毛囊膨脹部位的真皮乳頭細胞團

27第27頁,共48頁，2024年2月25日，星期天表皮干細胞---SSC特異生物標記：K4、K14角蛋白---SSC干性的體內維持：整聯(lián)蛋白、鈣黏連蛋白將SSC與基底膜細胞強烈黏附，維持SSC在干細胞巢中附著，并維持其增殖與干性---SSC的分化：Wnt信號激活SSC增殖分化28第28頁,共48頁，2024年2月25日，星期天表皮干細胞終生都在更新；體外培養(yǎng)表皮干細胞技術已經非常成熟；治療的效果易于觀察，萬一發(fā)生不良反應可方便地移去；表皮干細胞特點與優(yōu)勢29第29頁,共48頁，2024年2月25日，星期天1996，我國徐榮祥在燒傷創(chuàng)面上找到皮膚組織原位再生的原始細胞“角蛋白十九型皮膚干細胞”。并成功誘導其分化生成皮膚細胞，使受傷的皮膚得以迅速康復，實現人體器官原位再生，獲得美國專利。已經成功應用于遺傳性水皰病、大皰性表皮松懈癥的基因治療30第30頁,共48頁，2024年2月25日，星期天組織工程（TissueEngineering）定義：應用生命科學與工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理狀態(tài)下的組織結構、功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學科。31第31頁,共48頁，2024年2月25日，星期天種子細胞支架材料和細胞外基質細胞與材料的體外復合培養(yǎng)(細胞生長環(huán)境方式、應力，材料改性等)體內植入(材料生物相容度、降解與細胞功能的同步化、營養(yǎng)支持、血管生成等)檢測和管理臨床驗證產業(yè)化組織工程研究內容32第32頁,共48頁，2024年2月25日，星期天種子細胞：胚胎干細胞：存在倫理問題，來源不易。成體干細胞：易獲得，自身的成體干細胞沒有免疫原性。33第33頁,共48頁，2024年2月25日，星期天體外途徑：從病人體內獲取細胞，體外培養(yǎng)并導入目的基因后，重新輸入患者體內。體內途徑：直接將基因或攜帶目的基因的經改造的病毒導入人體患病組織中。34干細胞定向分化的基因策略第34頁,共48頁，2024年2月25日，星期天選擇安全、無毒、容易穿過細胞膜的基因載體，將治療基因導入細胞內。理想載體的條件：易獲得高滴度的純品；能穩(wěn)定、高效地轉染體內非增殖狀態(tài)的細胞；可以長期、穩(wěn)定地表達外源基因而不會引起細胞毒性、感染或免疫應答；能特異地識別靶組織，在其中表達外源基因；35干細胞基因治療關鍵問題第35頁,共48頁，2024年2月25日，星期天西班牙馬德里自治大學博爾納德教授和丹麥歐登塞大學醫(yī)院布瑞恩斯(CancerRes,2005):體外培育人體間充質干細胞6-8周是安全的；超過4-5個月，這種干細胞會發(fā)生自發(fā)轉化；體外培養(yǎng)8個月、分裂了90-140代的人體間充質干細胞移植至動物體內后，發(fā)現“最老的”細胞發(fā)生了癌變。36轉基因干細胞安全性問題第36頁,共48頁，2024年2月25日，星期天原因——端粒酶端粒酶有阻止端粒隨細胞分裂而逐漸縮短的作用，從而穩(wěn)定染色體的末端，在保持細胞“永生”性中起重要作用。干細胞的端粒酶基因活化，最終將其變成癌細胞。

37第37頁,共48頁，2024年2月25日，星期天ECM——蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維ECM是細胞附著的基本框架和代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構成的組織形態(tài)和功能。理想的ECM應具有以下特點①生物相容性好②有可吸收性③有可塑性④表面化學特性和表面微結構利于細胞的粘附和生長⑤降解速率可根據不同細胞的組織再生速率而進行調整。38細胞外基質的研究第38頁,共48頁，2024年2月25日，星期天天然ECM：采用膠原制作人工皮膚和血管模型人工的ECM：聚乳酸、聚羥基乙酸、兩者的共聚物(PGA-PLA)、聚ρ-羥基丁酯(PHB)；聚乳酸-已內酯的共聚物(PLC)、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐天然高分子與合成高分子的復合物，如膠原-PCA的復合物等有機材料與無機材料的復合物，如羥基磷灰石-甲殼素的復合物，羥基磷灰石-PLA的復合物等39細胞外基質的研究——組織工程所應用的材料第39頁,共48頁，2024年2月25日，星期天制備干細胞，誘導定向分化；建立由細胞和可降解材料構成的三維空間復合體；采用穩(wěn)定的培養(yǎng)系統(tǒng)，是工程組織維持長期的分化狀態(tài)。40組織工程(體外)實施的三大步驟第40頁,共48頁，2024年2月25日，星期天組織相容性；材料降解與細胞功能發(fā)揮的同步化；代謝活動，營養(yǎng)來源，血管化過程及方式；與生長發(fā)育的關系，細胞的作用及轉歸，植入體的最終結局；體內生物力學，免疫學；對藥物治療的反應。41體內植入研究第41頁,共48頁，2024年2月25日，星期天42骨組織構建構建組織工程骨的方式有幾種①支架材料與成骨細胞；②支架材料與生長因子；③支架材料與成骨細胞加生長因子。第42頁,共48頁，2024年2月25日，星期天一名7歲男孩