生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座

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生物大分子制備2

蛋白質(zhì)（酶）分離純化第四章樣品全息制備生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第1頁1

生物大分子制備1.1

概述1.2

生物大分子制備前處理1.3

生物大分子分離純化1.4樣品保留生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第2頁1.1概述在生命科學(xué)高度發(fā)展今天，蛋白質(zhì)、酶和核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)與功效研究是探求生命奧秘中心課題，而生物大分子結(jié)構(gòu)與功效研究，必須首先處理生物大分子制備問題，假如沒有能夠到達(dá)足夠純度生物大分子制備工作為前提，結(jié)構(gòu)與功效研究就無從談起。然而生物大分子分離純化與制備是一件十分細(xì)致而困難工作。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第3頁⑴生物材料組成極其復(fù)雜，經(jīng)常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。⑵許多生物大分子在生物材料中含量極微，分離純化步驟繁多、流程長(zhǎng)。⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)環(huán)境時(shí)就極易失活，所以分離過程中怎樣預(yù)防其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。⑷生物大分子制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行，溫度、pH值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成綜合影響，極難準(zhǔn)確預(yù)計(jì)和判斷。⑸生物大分子中各種詳細(xì)物質(zhì)組成百分比不一樣。與化學(xué)產(chǎn)品分離制備相比較，生物大分子制備有以下主要特點(diǎn)：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第4頁生物大分子制備通?？砂匆韵虏襟E進(jìn)行：①確定要制備生物大分子目標(biāo)和要求，是進(jìn)行科研、開發(fā)還是要發(fā)覺新物質(zhì)。②建立對(duì)應(yīng)可靠分析測(cè)定方法，這是制備生物大分子關(guān)鍵。③經(jīng)過文件調(diào)研和預(yù)備性試驗(yàn)，掌握生物大分子目標(biāo)產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)。④生物材料破碎和預(yù)處理。⑤分離純化方案選擇和探索，這是最困難過程。⑥生物大分子制備物均一性（即純度）判定，要求到達(dá)一維電泳一條帶，二維電泳一個(gè)點(diǎn)，或HPLC和毛細(xì)管電泳都是一個(gè)峰。⑦產(chǎn)物濃縮、干燥和保留。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第5頁分析測(cè)定方法主要有兩類：即生物學(xué)和物理、化學(xué)測(cè)定方法。生物學(xué)測(cè)定法主要有：酶各種測(cè)活方法、蛋白質(zhì)含量各種測(cè)定法、免疫化學(xué)方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學(xué)方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法(紫外/可見、紅外和熒光等分光光度法)、電泳法、以及核磁共振等。實(shí)際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測(cè)定愈加緊速、簡(jiǎn)便。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第6頁要了解生物大分子物理、化學(xué)性質(zhì)主要有：①在水和各種有機(jī)溶劑中溶解性。②

在不一樣溫度、pH值和各種緩沖液中生物大分子穩(wěn)定性。③固態(tài)時(shí)對(duì)溫度、含水量和凍干時(shí)穩(wěn)定性。④各種物理性質(zhì)：如分子大小、穿膜能力、帶電情況、在電場(chǎng)中行為、離心沉降時(shí)表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中分配系數(shù)。⑤其它化學(xué)性質(zhì)：如對(duì)各種蛋白酶、水解酶穩(wěn)定性和對(duì)各種化學(xué)試劑穩(wěn)定性。⑥對(duì)其它生物分子特殊親和力。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第7頁生物大分子分離純化方法各種多樣，主要是利用它們之間特異性差異，如分子大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其它分子親和性等。各種方法基本原理能夠歸納為兩個(gè)方面：①利用混合物中幾個(gè)組分分配系數(shù)差異，把它們分配到兩個(gè)或幾個(gè)相中，如鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；②將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，經(jīng)過物理力場(chǎng)作用，使各組分分配于不一樣區(qū)域，從而到達(dá)分離目標(biāo)，如電泳、離心、超濾等。當(dāng)前純化蛋白質(zhì)等生物大分子關(guān)鍵技術(shù)是電泳、層析和高速與超速離心。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第8頁1.2生物大分子制備前處理1.2.1生物材料選擇制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)生物材料。材料起源無非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。選擇材料應(yīng)含量高、起源豐富、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)溶劑中提取，假如所要求成份在細(xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。植物要先去殼、除脂。微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保留。動(dòng)物材料則需深度冷凍保留。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第9頁1.2.2細(xì)胞破碎不一樣生物體或同一生物體不一樣部位組織，其細(xì)胞破碎難易不一，使用方法也不相同，如動(dòng)物臟器細(xì)胞膜較脆弱，輕易破碎，植物和微生物因?yàn)楹休^堅(jiān)固纖維素、半纖維素組成細(xì)胞壁，要采取專門細(xì)胞破碎方法。(1)機(jī)械法：①

研磨：將剪碎動(dòng)物組織或其它生物材料置于研缽或勻漿器中，加入少許石英砂研磨成勻漿。②

組織搗碎器：這是一個(gè)較猛烈細(xì)胞破碎方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)械將組織打壞，然后再用10000～0r/min內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)（即高速分散器）將組織細(xì)胞打壞。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第10頁(2)物理法：①重復(fù)凍融法：將待破碎細(xì)胞冷至-15℃到-20℃，然后放于室溫（或40℃）快速融化，如此重復(fù)凍融屢次，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩下胞液鹽濃度增高而引發(fā)細(xì)胞溶脹破碎。②超聲波處理法：此法是借助超聲波振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。③壓榨法：這是一個(gè)溫和、徹底破碎細(xì)胞方法。在1000×105

Pa～×105

Pa

高壓下使細(xì)胞懸液經(jīng)過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。④冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，馬上放入冰浴中使之冷卻，如此重復(fù)屢次，絕大部分細(xì)胞能夠被破碎。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第11頁(3)化學(xué)與生物化學(xué)方法：①自溶法：將新鮮生物材料存放于一定

pH

和適當(dāng)溫度下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所含有各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。②溶脹法：細(xì)胞膜為天然半透膜，在低滲溶液和低濃度稀鹽溶液中，因?yàn)榇嬖跐B透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。③酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，處理15分鐘，能夠?qū)Ｒ恍缘貙⒓?xì)胞壁分解。④有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基磺酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也能夠與研磨法聯(lián)合使用。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第12頁1.2.3生物大分子提取

“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎細(xì)胞置于溶劑中，使被分離生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來天然狀態(tài)不丟失生物活性過程。通常：極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH值，溶解度增加。影響提取原因主要有：目標(biāo)產(chǎn)物在提取溶劑中溶解度大??；由固相擴(kuò)散到液相難易；溶劑pH值和提取時(shí)間等。注意：提取時(shí)所選擇條件應(yīng)有利于目標(biāo)產(chǎn)物溶解度增加和保持其生物活性。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第13頁蛋白質(zhì)和酶提取普通以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最慣用溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意幾個(gè)主要影響原因是：1)鹽濃度(即離子強(qiáng)度)：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子溶解度有極大影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強(qiáng)度下溶解度增加。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度溶液中都有較大溶解度，如在純水中加入少許中性鹽，蛋白質(zhì)溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象產(chǎn)生主要是少許離子活動(dòng)，降低了偶極分子之間極性基團(tuán)靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力結(jié)果。為了提升提取效率，有時(shí)需要降低或提升溶劑極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度(如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4)，能夠增加溶液極性。⑴水溶液提取：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第14頁2)pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸溶解度和穩(wěn)定性與pH值相關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡可能防止，普通控制在pH=6～8范圍內(nèi)，提取溶劑pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)兩側(cè)。

3)溫度：為預(yù)防變性和降解，制備含有活性蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)普通在0～5℃低溫操作。

4)預(yù)防蛋白酶或核酸酶降解作用：加入抑制劑或調(diào)整提取液pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使對(duì)應(yīng)水解酶失去活性，預(yù)防它們對(duì)欲提純蛋白質(zhì)、酶及核酸降解作用。5)攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物溶解，普通采取溫和攪拌為宜，速度太快輕易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣接觸面，會(huì)引發(fā)酶等物質(zhì)變性失活。因?yàn)槠胀ǖ鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量巰基，有些巰基經(jīng)常是活性部位必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中氧氣接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間二硫鍵，造成酶活性喪失。在提取液中加入少許巰基乙醇或半胱氨酸以預(yù)防巰基氧化。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第15頁一些和脂類結(jié)合比較牢靠或分子中非極性側(cè)鏈較多蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，慣用不一樣百分比有機(jī)溶劑提取。慣用有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑能夠與水互溶或部分互溶，同時(shí)含有親水性和親脂性。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定百分比有機(jī)溶劑水溶液中，在這種情況下，采取稀有機(jī)溶液提取經(jīng)常能夠預(yù)防水解酶破壞，并兼有除去雜質(zhì)提升純化效果作用，如胰島素提取即是如此。⑵有機(jī)溶劑提取生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第16頁因?yàn)樯矬w組成成份是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，所以不可能有一個(gè)適合于各類分子固定分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分基本伎倆是相同。為了防止盲目性，節(jié)約試驗(yàn)探索時(shí)間，要認(rèn)真參考和借鑒前人經(jīng)驗(yàn)，少走彎路。慣用分離純化方法和技術(shù)有：沉淀法（包含：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。1.3生物大分子分離純化生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第17頁

沉淀是溶液中溶質(zhì)由液相變成固相而析出過程。沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不但適合用于試驗(yàn)室中，也可用于一些生產(chǎn)目標(biāo)制備過程，是分離純化生物大分子，尤其是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最慣用方法。經(jīng)過沉淀，將目標(biāo)生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步分離。沉淀法基本原理是依據(jù)不一樣物質(zhì)在溶劑中溶解度不一樣而到達(dá)分離目標(biāo)，不一樣溶解度產(chǎn)生是因?yàn)槿苜|(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力差異而引發(fā)，溶解度大小與溶質(zhì)和溶劑化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)相關(guān)，溶劑組分改變或加入一些沉淀劑以及改變?nèi)芤簆H值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)溶解度產(chǎn)生顯著改變。1.3.1沉淀法生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第18頁⑴中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶分離純化。⑵有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子分離純化。⑶選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去一些不耐熱和在一定

pH

值下易變性雜蛋白。⑷等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其它兩性物質(zhì)沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其它方法結(jié)合使用。⑸有機(jī)聚合物沉淀：是發(fā)展較快一個(gè)新方法，主要使用聚乙二醇(Polyethyeneglycol,

PEG)作為沉淀劑。在生物大分子制備中最慣用幾個(gè)沉淀方法是：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第19頁在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都能夠用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。鹽析法應(yīng)用最廣還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已經(jīng)有八十多年歷史，其突出優(yōu)點(diǎn)是：①成本低，不需要尤其昂貴設(shè)備。②操作簡(jiǎn)單、安全。③對(duì)許多生物活性物質(zhì)含有穩(wěn)定作用。1.3.1.1中性鹽沉淀（鹽析法）生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第20頁蛋白質(zhì)和酶均易溶于水，因?yàn)樵摲肿?COOH、-NH2和-OH都是親水基團(tuán)，這些基團(tuán)與極性水分子相互作用形成水化層，包圍于蛋白質(zhì)分子周圍形成1～100nm顆粒親水膠體，減弱了蛋白質(zhì)分子之間作用力，蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)越多，水化層越厚，蛋白質(zhì)分子與溶劑分子之間親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中穩(wěn)定原因有兩個(gè)：即電荷和水膜。因?yàn)橹行喳}親水性大于蛋白質(zhì)和酶分子親水性，所以加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。鹽析示意圖以下頁“圖”所表示。⑴中性鹽沉淀蛋白質(zhì)基本原理生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第21頁鹽析原理示意圖生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第22頁慣用中性鹽中最主要是(NH4)2SO4，因?yàn)樗c其它慣用鹽類相比有十分突出優(yōu)點(diǎn)：⑵中性鹽選擇1)溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高溶解度，這是其它鹽類所不具備。因?yàn)槊负透鞣N蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下(0～4℃)進(jìn)行。由下表能夠看到，硫銨在0℃時(shí)溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：

幾個(gè)鹽在不一樣溫度下溶解度(g/100ml水)0℃20℃80℃100℃(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.81012)分離效果好：有提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就能夠除去75％雜蛋白，純度提升了4倍。3)不易引發(fā)變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)作用有酶或蛋白質(zhì)用2～3mol/L濃度(NH4)2SO4保留可達(dá)多年之久。4)價(jià)格廉價(jià)，廢液不污染環(huán)境。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第23頁最慣用是固體硫酸銨加入法。將其研成細(xì)粉，在攪拌下遲緩均勻少許屢次地加入，靠近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽速度更要慢一些，盡可能防止局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采取離心分離，高濃度硫酸銨慣用過濾方法。各種飽和度下需加固體硫酸銨量可由附錄中查出。⑶鹽析操作方法生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第24頁⑷鹽析曲線制作假如要分離一個(gè)新蛋白質(zhì)和酶，沒有文件數(shù)據(jù)能夠借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)硫酸銨飽和度。蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力

102030405060708090100硫銨飽和度生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第25頁1)蛋白質(zhì)濃度：高濃度蛋白質(zhì)用稍低硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)共沉淀作用。低濃度蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中蛋白質(zhì)濃度是2.5～3.0％，相當(dāng)于25～30mg/mL。2)pH值對(duì)鹽析影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近。3)溫度影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們?nèi)芙舛确炊鴾p小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加。普通情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于一些對(duì)溫度敏感酶，要求在0～4℃下操作，以防止活力喪失。⑸鹽析影響原因生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第26頁1.3.1.2有機(jī)溶劑沉淀法基本原理：有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)(酶)、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用沉淀方法之一。其原理主要是：①降低水溶液介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液介電常數(shù)，減小溶劑極性，從而減弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間相互作用力，造成蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。②因?yàn)槭褂糜袡C(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子水膜，因而發(fā)生沉淀作用。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第27頁有機(jī)溶劑沉淀法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：①分辨能力比鹽析法高，即一個(gè)蛋白質(zhì)或其它溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀不用脫鹽，過濾比較輕易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)：①對(duì)一些含有生物活性大分子輕易引發(fā)變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。②有機(jī)溶劑選擇和濃度計(jì)算用于生化制備有機(jī)溶劑選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶慣用是乙醇、甲醇和丙酮。為了取得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積有機(jī)溶劑，來進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第28頁①溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度尤其敏感，溫度稍高就會(huì)引發(fā)變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，所以必須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須遲緩且不停攪拌以免局部過濃。普通規(guī)律是溫度越低，得到蛋白質(zhì)活性越高。②樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用百分比更大有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。高濃度樣品，能夠節(jié)約有機(jī)溶劑，降低變性危險(xiǎn)，但雜蛋白共沉淀作用大。通常使用5～20mg/mL蛋白質(zhì)初濃度為宜。有機(jī)溶劑沉淀影響原因：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第29頁③pH值：選擇在樣品穩(wěn)定pH值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提升此沉淀法分辨能力。④離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超出5％為宜，使用乙醇量也以不超出原蛋白質(zhì)水溶液２倍體積為宜，少許中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好保護(hù)作用，但鹽濃度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。沉淀所得固體樣品，假如不馬上溶解進(jìn)行下一步分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，降低其中有機(jī)溶劑含量，如若必要能夠裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品生物活性。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第30頁1.3.1.3選擇性變性沉淀法這一方法是利用生物大分子與非目標(biāo)生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面差異，選擇一定條件使雜蛋白等非目標(biāo)物變性沉淀而得到分離提純。⑴熱變性利用生物大分子熱穩(wěn)定性差異，加熱升高溫度使非目標(biāo)生物大分子變性沉淀而保留目標(biāo)物在溶液中。⑵表面活性劑和有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進(jìn)行。⑶選擇性酸堿變性利用對(duì)pH值穩(wěn)定性不一樣而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行分離純化步驟。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第31頁利用含有不一樣等電點(diǎn)兩性電解質(zhì)，在到達(dá)電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，能夠利用此法進(jìn)行初步沉淀分離。因?yàn)樵S多蛋白質(zhì)等電點(diǎn)十分靠近，而且?guī)в兴さ鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定溶解度，不能完全沉淀析出，所以，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其它沉淀劑一起配合使用，以提升沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目標(biāo)物。1.3.1.4等電點(diǎn)沉淀法生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第32頁1.3.1.5有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來一類主要沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶純化。其中應(yīng)用最多是“聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)】(PolyethyleneGlycol，簡(jiǎn)寫為PEG)，它親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍分子量，在生物大分子制備中，用較多是分子量為6000～0PEG。本方法優(yōu)點(diǎn)是：①操作條件溫和，不易引發(fā)生物大分子變性。②沉淀效能高，使用極少許PEG即能夠沉淀相當(dāng)多生物大分子。③沉淀后有機(jī)聚合物輕易去除。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第33頁

在生物大分子制備過程中，除鹽、除少許有機(jī)溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析技術(shù)。透析只需要使用專用半透膜即可完成。保留在透析袋內(nèi)未透析出樣品液稱為“保留液”，袋（膜）外溶液稱為“滲出液”或“透析液”。截留分子量(MwCO)通常為10KD左右。用

1％

BaCl2

檢驗(yàn)

(NH4)2SO4，用1％AgNO3檢驗(yàn)NaCl、KCl等。1.3.2透析生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第34頁超出濾即超濾，是一個(gè)加壓膜分離技術(shù)，即在一定壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑特制薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分純化。

超濾可廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）濃縮、分離和純化。1.3.3超濾生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第35頁超濾工作原理示意圖受壓生物大分子和小分子溶液濃縮生物大分子小分子溶液生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第36頁依據(jù)所加操作壓力和所用膜平均孔徑，可將超濾分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。微孔過濾所用操作壓通常小于4×104Pa，膜平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分離較大微粒、細(xì)菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104

～7×105Pa，膜平均孔徑為10-100埃，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透所用操作壓力比超濾更大，常到達(dá)35×105～140×105Pa，膜平均孔徑最小，普通為10埃以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第37頁超濾技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)試驗(yàn)條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相改變，而且不引發(fā)溫度、pH改變，因而能夠預(yù)防生物大分子變性、失活和自溶。在生物大分子制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子脫鹽、脫水和濃縮等。超濾法也有一定不足，它不能直接得到干粉制劑。對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，普通只能得到10～50％濃度。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第38頁超濾技術(shù)關(guān)鍵是膜。慣用膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者混合物制成。近年來發(fā)展了非纖維型各向異性膜，比如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH1-14都是穩(wěn)定，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定，能連續(xù)用1～2年。超濾膜基本性能指標(biāo)：水通量(cm3/(cm2·h))；截留率(以百分率％表示)；化學(xué)物理穩(wěn)定性(包含機(jī)械強(qiáng)度)等。超濾裝置由若干超濾組件組成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。因?yàn)槌瑸V法處理液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等。這些物質(zhì)極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重濃差極化和堵塞，這是超濾法最關(guān)鍵問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第39頁

冰凍干燥機(jī)是生化與分子生物學(xué)試驗(yàn)室必備儀器之一，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物大分子分離純化后最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好方法就是冰凍干燥，因?yàn)樯锎蠓肿虞p易失活，通常不能使用加熱蒸發(fā)濃縮方法。

冰凍干燥是先將生物大分子水溶液冰凍，然后在低溫和高真空下使冰升華，留下固體干粉。冰凍干燥原理可用溶劑三相點(diǎn)相圖來說明，見下列圖：1.3.4冰凍干燥生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第40頁三相點(diǎn)相圖生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第41頁當(dāng)溫度在三相點(diǎn)O以下，將壓力降至OC線以下，溶劑（通常是水）就能夠由固相直接升華為汽相。冰：-40℃上方蒸汽壓為0.1mmHg，-60℃上方蒸汽壓為0.01mmHg。1克0℃冰變成0℃蒸汽需吸熱580千卡，容器外壁上會(huì)掛霜。突出優(yōu)點(diǎn)：①

樣品不起泡，不暴沸。②

得到干粉樣品不粘壁，易取出。③

冰干后樣品是疏松粉末，易溶于水。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第42頁①

樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，不然冰點(diǎn)降低，樣品易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。②

樣品要予先脫鹽，不然冰凍后易融化。③

樣品緩沖液在冰凍時(shí)pH可能會(huì)有較大改變，需加入pH穩(wěn)定劑，如糖類和鈣離子等。④

樣品溶液濃度不要過稀，比如蛋白質(zhì)濃度不低于15mg/mL為宜。1.3.4.1適于冰凍干燥樣品溶液：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第43頁⑴

用各種尺寸培養(yǎng)皿盛樣品溶液，液層不要太厚，能夠使用安瓿瓶和青霉素小瓶。用燒杯時(shí)液層厚度不要超出2cm。⑵

凍干稀溶液時(shí)會(huì)得到很輕絨毛狀固體樣品，輕易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔薄膜或吸水紙包住杯口，刺孔不要過小過少，不然會(huì)影響凍干速度。1.3.4.2裝樣品溶液冰凍干燥容器：⑶溶液冰凍：可用干冰-乙醇低溫浴速凍，邊凍邊旋轉(zhuǎn)形成很薄冰凍層，能夠大大加緊凍干速度。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第44頁①

樣品全部?jī)龈汕?，不要輕易搖動(dòng)，以防水蒸汽沖散凍干樣品粉末。②

若外霜消失，則說明樣品已凍干，或是僅剩樣品中心小冰塊，再稍加延長(zhǎng)凍干時(shí)間即可。③

凍干后要及時(shí)取出樣品，以免樣品在室溫下停留時(shí)間過長(zhǎng)而失活。④

停真空泵時(shí)要先放氣，以免泵油倒灌。放氣時(shí)要遲緩，以免氣流沖散樣品干粉。⑤

樣品凍干后要及時(shí)密封冷藏，以防受潮。⑥

真空泵要經(jīng)常檢驗(yàn)油面和油色，油面過低和油色發(fā)黑，則需換油。⑷

凍干：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第45頁1.3.5分離純化方法選擇制備生物大分子方法能夠粗略地分類以下：①

以分子大小和形態(tài)差異為依據(jù)方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾等。②

以溶解度差異為依據(jù)方法：鹽析、萃取、分配層析、選擇性沉淀和結(jié)晶等。③

以電荷差異為依據(jù)方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。④

以生物學(xué)功效專一性為依據(jù)方法：親和層析等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第46頁1.3.5.1樣品早期分離純化①粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。②欲制備生物大分子濃度很稀。③物理化學(xué)性質(zhì)相近物質(zhì)很多。④希望能除去大部分與目標(biāo)產(chǎn)物物理化學(xué)性質(zhì)差異大雜質(zhì)。①要快速、粗放。②能較大地縮小體積。③分辨力無須太高。④負(fù)荷能力要大。(1)特點(diǎn)：(2)對(duì)所選方法要求：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第47頁吸附；萃取；沉淀法(熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等)；離子交換（批量吸附、胖柱交換）；親和層析等。(3)可選取方法：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第48頁1.3.5.2樣品晚期分離純化(1)可選取方法：吸附層析、鹽析、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析、等電聚焦制備電泳、制備HPLC等。(2)要注意一些問題：①鹽析后要及時(shí)脫鹽。②用凝膠過濾時(shí)怎樣縮小上樣體積，因?yàn)槟z層析柱上樣體積只能是柱床體積1/10～1/6，也能夠使用串聯(lián)柱以加大柱床體積。③必要時(shí)也能夠重復(fù)使用同一個(gè)分離純化方法，比如：分級(jí)有機(jī)溶劑沉淀、分級(jí)鹽析、連續(xù)兩次凝膠過濾、離子交換層析等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第49頁④分離純化步驟前后要有科學(xué)安排和銜接，盡可能降低工序，提升效率。比如：吸附不能夠放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過濾之前，因?yàn)殡x子交換層析上樣量能夠不受限制，只要不超出柱交換容量即可。⑤分離純化后期，目標(biāo)產(chǎn)物純度和濃度都大大提升，此時(shí)對(duì)于很多敏感酶極易變性失活，所以操作步驟要連續(xù)、緊湊，盡可能在低溫下(如在冷室中)進(jìn)行。⑥得到最終產(chǎn)品后，必要時(shí)要馬上冰凍干燥，分裝并寫明標(biāo)簽，-20℃或-70℃保留。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第50頁1.4樣品保留生物大分子制成品正確保留極為主要，一旦保留不妥，辛辛勞苦制成樣品失活、變性、變質(zhì)，使前面全部制備工作化為烏有，損失慘重，全功盡棄。⑴

空氣：空氣空氣影響主要是潮解、微生物污染和自動(dòng)氧化。⑵

溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應(yīng)約加緊數(shù)倍，酶促反應(yīng)增加1～3倍。影響生物大分子樣品保留主要原因有：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第51頁⑶

水份：樣品本身所帶水份和由空氣中吸收水份。水能夠參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。⑷

光線：一些生物大分子能夠吸收一定波長(zhǎng)光，使分子活化不利于樣品保留，尤其日光中紫外線能量大，影響最大，樣品受光催化反應(yīng)有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。所以樣品通常都要避光保留。⑸

樣品pH：保留液態(tài)樣品時(shí)注意其穩(wěn)定pH范圍，正確選擇保留液態(tài)樣品緩沖劑種類和濃度十分主要。⑹

時(shí)間：生化和分子生物學(xué)樣品不可能永久存活，不一樣樣品有其不一樣使用期，所以，保留樣品必須寫明日期，定時(shí)檢驗(yàn)和處理。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第52頁⑴低溫下保留：通常要保留于-5～-20℃，-70℃保留最理想。極少數(shù)酶能夠耐熱：如核糖核酸酶能夠短時(shí)煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中能夠耐受90℃；蔗糖酶在50～60℃能夠保持15～30min不失活。還有少數(shù)酶對(duì)低溫敏感，如鳥肝丙酮酸羧化酶。⑵制成干粉或結(jié)晶保留：蛋白質(zhì)和酶固態(tài)比在溶液中要穩(wěn)定多。固態(tài)干粉制劑放在干燥劑中可長(zhǎng)久保留?，F(xiàn)以保留蛋白質(zhì)和酶為例：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第53頁①惰性生化或有機(jī)物質(zhì)：如糖類、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩(wěn)定疏水環(huán)境。②中性鹽：有一些蛋白質(zhì)要求在高離子強(qiáng)度(1～4mol/L或飽和鹽溶液)極性環(huán)境中才能保持活性。慣用MgSO4、NaCl、(NH4)2SO4等。使用時(shí)要脫鹽。③巰基試劑：一些蛋白質(zhì)和酶表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保留時(shí)可加入半胱氨酸或巰基乙醇。⑶在保護(hù)劑下保留：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第54頁2蛋白質(zhì)（酶）分離純化2.1酶活性測(cè)定2.2酶溶液制備2.3酶分離純化基本過程2.4依據(jù)分子大小輕重建立分離純化方法2.5調(diào)整溶解度分離方法2.6按電荷正負(fù)性設(shè)計(jì)分離方法2.7依據(jù)親和作用建立純化方法2.8依據(jù)穩(wěn)定性差異建立分離純化方法2.9蛋白質(zhì)（酶）高效液相色譜分離分析法生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第55頁酶分離提純包含三個(gè)基本步驟：抽提：即把酶從材料轉(zhuǎn)入溶劑中制成酶溶液；純化：即把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來；制劑：即將酶制成各種劑型。(1)

要注意預(yù)防酶變性失活.(2)

酶分離純化目標(biāo)是將酶以外全部雜質(zhì)盡可能除去，所以，在不破壞所需酶條件下，可使用各種“激烈”伎倆。另外，因?yàn)槊负退孜铩⒁种苿┑群杏H和性，當(dāng)這些物質(zhì)存在時(shí)．酶理化性質(zhì)和穩(wěn)定性發(fā)生了一定改變，從而提供了更多條件和方法可供采取。(3)

酶含有催化活性。檢測(cè)酶活性，跟蹤酶來龍去脈，為選擇適當(dāng)方法和條件提供直接依據(jù)。在工作過程中，從原料開始每步都必須檢測(cè)酶活性．一個(gè)好方法和辦法會(huì)使酶純度提升倍數(shù)大，活力回收高，同時(shí)重復(fù)性好。依據(jù)酶本身特征，在分離純化工作中必須注意以下問題:生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第56頁2.1酶活性測(cè)定酶活力

(EnzymeActivity)

也稱酶活性，指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)能力。酶活性是研究酶特征、分離純化以及酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用時(shí)一項(xiàng)不可缺乏指標(biāo)。酶活力是用在一定條件下，它所催化某一反應(yīng)反應(yīng)初速度來表示。酶反應(yīng)速度（指初速度）可用單位時(shí)間內(nèi)單位體積中底物降低許或產(chǎn)物增加量來表示，其單位為mol/s。2.1.1酶活力單位2.1.2摩爾催化活性/分子活性和轉(zhuǎn)化率（催化中心活力）生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第57頁摩爾催化活性(MolarCatalyticActivity)表示在單位時(shí)間內(nèi)，酶分子中每個(gè)活性中心轉(zhuǎn)換分子數(shù)目。依據(jù)米氏方程：Vmax=K0[E]K0=Vmax/[E]K0即為轉(zhuǎn)換率

(也用Kcat表示)，假如每一個(gè)酶分子只有一個(gè)催化中心，那么催化中心活性等于摩爾催化活性，假如一個(gè)酶分子有幾個(gè)催化中心，那么催化中心活性等于摩爾催化活性除以n。每種酶轉(zhuǎn)換率不一樣，下表列出了幾個(gè)酶轉(zhuǎn)換率：酶轉(zhuǎn)換率(1/s)酶轉(zhuǎn)換率(1/s)碳酸酐酶600,000凝乳蛋白酶100乙酰膽堿脂酶25,000DNA聚合酶Ⅰ5青霉素酶2,000Trp合成酶2乳酸脫氫酶1,000溶菌酶0.5生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第58頁2.1.3比活力

比活力(性)(SpecificActivity)是酶純度量度，指單位重量蛋白質(zhì)中所含有酶活力單位數(shù)，普通用IU/mg蛋白質(zhì)來表示。一般來說，酶比活力越高，酶越純。2.1.4酶活力測(cè)定方法酶活力與底物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑、抑制劑濃度以及緩沖液種類和濃度都親密相關(guān)。酶活性測(cè)定可用終止反應(yīng)法或連續(xù)反應(yīng)法。2.1.4.1終止反應(yīng)法(StoppedMethod)終止反應(yīng)法是將酶反應(yīng)按時(shí)間即刻完全停頓，取出反應(yīng)物或產(chǎn)物，給予分離，再確定反應(yīng)物消耗量，或產(chǎn)物形成量，算出酶活性。使酶停頓作用慣用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、三氯乙酸或過氯酸，也可用SDS使酶失活或加熱使酶變性等。產(chǎn)物測(cè)定方法可用酶法、化學(xué)法或放射化學(xué)法。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第59頁⑴酶法

酶法是用其它純酶將產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成一個(gè)可用分光光譜儀或熒光光譜儀測(cè)定化合物。通常采取偶聯(lián)法，比如葡萄糖氧化酶催化以下反應(yīng)：

葡萄糖+O2→葡萄糖內(nèi)脂+H2O2欲測(cè)定葡萄糖內(nèi)脂和H2O2均較困難，可在該反應(yīng)中加入過氧化物酶和木酚，使發(fā)生以下反應(yīng):生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第60頁因?yàn)?-甲氧聯(lián)酚在435nm波優(yōu)點(diǎn)有光吸收峰，所以、只要測(cè)定A435，就可知4-甲氧聯(lián)酚量，可得H2O2量，從而可推知酶活力。在這種方法中，偶聯(lián)酶(過氧化物酶)必須過量，不然，將出現(xiàn)下列圖情況。普通偶聯(lián)酶量最少也應(yīng)在5倍以上。偶聯(lián)法中偶聯(lián)酶對(duì)反應(yīng)速度影響生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第61頁再如：測(cè)定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P其偶聯(lián)-指示劑為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶葡萄糖-6-P+NADP+→6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+這時(shí)即可測(cè)定340nm處光吸收增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）活性。酶偶聯(lián)測(cè)定法可用分開也可用連續(xù)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第62頁(2)化學(xué)法化學(xué)法是利用化學(xué)反應(yīng)使產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成一個(gè)可用某種物理方法測(cè)出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、氣體體積量度法等方法測(cè)出酶活性。

化學(xué)分析法優(yōu)點(diǎn)是：不需要特殊儀器，普通有恒溫水浴、滴定管、離心機(jī)及比色計(jì)或分光光度計(jì)即可進(jìn)行工作。對(duì)于絕大多數(shù)酶，都可依據(jù)底物及產(chǎn)物化學(xué)性質(zhì)，設(shè)計(jì)詳細(xì)測(cè)定方法，應(yīng)用范圍較廣。缺點(diǎn)是：因?yàn)闇y(cè)定結(jié)果是依據(jù)間隔一定時(shí)間取樣所得，取樣過多，則總工作量較大，取樣過少，則不能得到酶反應(yīng)過程全貌，而且在實(shí)際操作過程中，取樣及停頓時(shí)間不輕易準(zhǔn)確控制，所以對(duì)于反應(yīng)較快酶反應(yīng)，結(jié)果不夠準(zhǔn)確。當(dāng)前，市場(chǎng)上已經(jīng)有酶反應(yīng)儀商品，可將不一樣時(shí)間取樣、停頓反應(yīng)、加入反應(yīng)試劑、保溫、比色或其它測(cè)定方法編排成程序，自動(dòng)依次完成，并將其結(jié)果打印輸出。所以現(xiàn)在對(duì)化學(xué)分析法必須作出新評(píng)價(jià)。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第63頁⑶放射性化學(xué)法是由含有放射性產(chǎn)物上測(cè)出全放射量，再算出產(chǎn)物量，從而計(jì)算出酶活性。優(yōu)點(diǎn)是：靈敏，可直接應(yīng)用于酶活力測(cè)定，也可用于體內(nèi)酶活性測(cè)定，尤其適合用于低濃度酶和底物測(cè)定。缺點(diǎn)是：操作煩瑣，樣品需要分離，反應(yīng)過程無法連續(xù)跟蹤，而且同位素對(duì)人體有損傷作用。另外，輻射淬滅會(huì)引發(fā)測(cè)定誤差，如3H發(fā)射射線很弱，甚至?xí)患埼?。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第64頁2.1.4.2連續(xù)反應(yīng)法(ContinuousMethod)連續(xù)反應(yīng)法無需終止反應(yīng)而是基于酶反應(yīng)過程中光譜吸收、氣體體積、酸堿度、溫度、黏度等改變用儀器跟蹤檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)行過程，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，算出酶活性。連續(xù)法使用方便，一個(gè)樣品可屢次測(cè)定，且有利于動(dòng)力學(xué)研究，但很多酶還不能用該法測(cè)定。⑴普通連續(xù)法：包含光譜吸收、電化學(xué)、量氣、量熱、旋光法等，其中以光譜吸收較為準(zhǔn)確。光譜吸收主要指分光光度和熒光法。該法適合用于一些反應(yīng)速度較快酶，自動(dòng)統(tǒng)計(jì)儀普遍使用使該法更輕易被人們所接收。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第65頁幾個(gè)連續(xù)法例子酶反應(yīng)觀察方法乳酸脫氫酶乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+丙酮酸+NADH→乳酸+NAD+340nm波優(yōu)點(diǎn)有NADH形成340nm波優(yōu)點(diǎn)有NADH降低糖苷酶(Glycosidase)Methylumbelvifery+glucoside→糖+Methylumbeviferone甲基傘型酮(Methylumbelviferone)發(fā)出熒光內(nèi)纖維素酶纖維素→低聚葡萄糖黏度下降己糖激酶葡萄糖+mgATP→6-P-葡萄糖+ADP+H+pH降低，用pH計(jì)非專一性磷脂酶405nm波長(zhǎng)有硝基苯酚生成生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第66頁⑵偶聯(lián)連續(xù)法是將指示酶直接加到待測(cè)酶反應(yīng)系統(tǒng)中，將其產(chǎn)物直接或間接轉(zhuǎn)變成可用光譜吸收儀檢測(cè)化合物。連續(xù)偶聯(lián)反應(yīng)必須在酶反應(yīng)相同條件(pH、溫度等)下進(jìn)行，且加入指示酶以及其它各種物質(zhì)不能干擾原來酶活力。如醛縮酶(Aldolase)催化1,6-二磷酸果糖生成3-P-甘油醛和磷酸二羥丙酮反應(yīng)，這些產(chǎn)物都無法直接測(cè)出，用磷酸丙糖異構(gòu)酶(TriosePhosphateIsomerase)作偶聯(lián)酶(CouplingEnzyme)、甘油-1-P-脫氫酶(Glycerol-1-PhosphateDehydrogenase)作指示酶，依據(jù)NADH變成NAD+光譜改變來算出醛縮酶活性。以下列圖：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第67頁醛縮酶以1-P-甘油脫氫酶為指示酶偶聯(lián)測(cè)定酶活性法生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第68頁2.1.4.3酶活力測(cè)定中應(yīng)注意幾個(gè)問題酶反應(yīng)和普通化學(xué)反應(yīng)一樣，都是在一定條件下進(jìn)行，但酶反應(yīng)要比普通化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜得多，除了反應(yīng)物以外，還有酶這么一個(gè)決定性原因。所以，酶活性測(cè)定除了必須遵照所用分析化學(xué)方法操作要求外，又有它—些特點(diǎn)。首先，測(cè)定酶反應(yīng)速度必須是初速度，只有初速度才與底物濃度成正比。初速度確實(shí)定普通指：底物消耗量在5％以內(nèi)，或產(chǎn)物形成量占總產(chǎn)物量15％以下時(shí)速度。其次，底物濃度、輔因子濃度必須大于酶濃度

(即過飽和)，不然，底物濃度本身是一個(gè)限制因子，此時(shí)反應(yīng)速度是兩個(gè)原因復(fù)變函數(shù)。第三，反應(yīng)必須在酶最適條件（如最適溫度、pH和離子強(qiáng)度等）下進(jìn)行。另外，測(cè)定酶活性所用試劑中不應(yīng)含有酶激活劑、抑制劑；同時(shí)底物本身不要有裂解。用反應(yīng)速度(v)對(duì)酶濃度(E)作圖，應(yīng)得一條經(jīng)過原點(diǎn)直線，即v為(E)線性函數(shù)。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第69頁初速度確實(shí)定是在底物濃度[S]足夠條件下，經(jīng)過[E]改變來確定，以下列圖。由圖可見，當(dāng)分別采取不一樣酶濃度時(shí)，測(cè)得反應(yīng)量對(duì)時(shí)間改變。求得幾個(gè)適當(dāng)初間反應(yīng)速度（反應(yīng)量/反應(yīng)時(shí)間）。再用反應(yīng)速度對(duì)酶量作圖。由圖可見，其中，5min時(shí)測(cè)得數(shù)據(jù)可用于求出初速度，若以10min以上數(shù)據(jù)時(shí)，測(cè)得酶活性偏低。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第70頁生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第71頁2.1.4.4酶活性測(cè)定實(shí)例這是一類專門去除體內(nèi)超氧陰離子酶，催化反應(yīng)為:O2·﹣+O2·﹣+2H+→H2O2+O2因?yàn)镺2

·﹣在溶液中極不穩(wěn)定，給酶活性測(cè)定帶來許多不便。當(dāng)前已經(jīng)有依據(jù)O2·﹣物理性質(zhì)測(cè)定O2·﹣歧化量，從而直接測(cè)定

SOD

活力方法。如電子順磁共振波譜法(ESR)、核磁共振法(NMR)、紫外分光光度法等。這里只介紹以鄰苯三酚法測(cè)定酶活力為例化學(xué)法。鄰苯三酚在一定條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基可經(jīng)過自氧化速率來表示。加入SOD，可抑制自氧化速率，由此計(jì)算出酶活力。SOD單位定義為：一定試驗(yàn)條件下（見操作），抑制率到達(dá)50%時(shí)SOD濃度為1個(gè)酶單位。(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力測(cè)定生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第72頁單位體積活力(u/ml)={([(0.07-樣品速率)/0.07]×100%)/50%}

×反應(yīng)液總體積×(反應(yīng)液稀釋倍數(shù)/樣液體積)總活力=單位體積活力(u/ml)×原液總體積操作：在試管中加入pH8.250mmol/LTris-HCl緩沖液4.5ml，于25℃保溫20min，然后加入預(yù)熱45mmol/L連苯三酚溶液（對(duì)照管用10mol/LHCl代替）10μl，快速搖勻倒入1cm比色杯，每隔30s在325nm處測(cè)一次光吸收值，即可測(cè)定出連苯三酚自氧化速率，普通要求自氧化速率控制在0.070OD/min。測(cè)酶或粗酶液活力時(shí)，方法同測(cè)自氧化速率相同，所不一樣僅是在加入緩沖液后再加入10μl待測(cè)樣品即可。酶活力計(jì)算方法：用這種方法測(cè)酶活力時(shí)，應(yīng)注意因?yàn)檫B苯三酚和被測(cè)樣液加入量只有10μl，在整個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中可忽略不計(jì)，故反應(yīng)液總體積按4.5計(jì)算。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第73頁(2)糖苷酶活力測(cè)定糖苷酶活力測(cè)定多用人工底物，如對(duì)硝基苯基糖苷在糖苷水解酶作用下，糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生等當(dāng)量糖和對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在堿性條件下于400nm處有特異吸收，從對(duì)硝基苯酚對(duì)光吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出糖苷水解酶活性。操作：試管中加入5mmol/L對(duì)硝基苯基糖苷200ul，pH4.60.2mol/L磷酸氫二鈉和0.1mol/L檸檬酸配制緩沖液200ul，37℃預(yù)保溫10min，再加入χμl待測(cè)樣品并用水補(bǔ)足到100ul，37℃反應(yīng)15min，用0.5mol/LNa2CO31ml終止反應(yīng)(注意空白管用水代替對(duì)硝基苯基糖苷和待測(cè)樣品)，在400nm處測(cè)定A值，酶單位定義為在上述測(cè)定條件下每分鐘釋放1μmol對(duì)硝基苯酚量為1個(gè)單位酶，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出酶活力。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第74頁2.2酶溶液制備酶溶液制備包含三個(gè)過程工作，材料預(yù)處理和破碎細(xì)胞、抽提、抽提液濃縮。2.2.1材料預(yù)處理及破碎細(xì)胞酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外分布有三種情況：一是釋放到細(xì)胞外酶，叫胞外酶；二是游離在細(xì)胞內(nèi)酶．叫溶酶；三是牢靠與膜或細(xì)胞顆粒結(jié)合在—起，叫結(jié)酶，后二者合稱胞內(nèi)酶。因?yàn)槊傅鞍追植疾灰粯?，提取方法有所差異。微生物胞外酶，用鹽析，或單寧沉淀。有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞內(nèi)酶需搜集菌體，經(jīng)破細(xì)胞后提取，其中結(jié)酶還有個(gè)打斷酶蛋白和細(xì)胞顆粒結(jié)合問題。動(dòng)植物細(xì)胞，也有打破細(xì)胞問題，對(duì)動(dòng)物材料，應(yīng)剔除結(jié)締組織、脂肪組織等；對(duì)植物材料如種子應(yīng)去殼，以免單寧等物質(zhì)著色污染。進(jìn)行預(yù)處理后，就是破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎有物理和化學(xué)方法兩大類：生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第75頁2.2.1.1物理粉碎法(1)研磨手磨法是試驗(yàn)室內(nèi)慣用方法。用石英砂或氧化鋁作助磨劑來制備無細(xì)胞抽提液。此法簡(jiǎn)單但效率低，制備量少。球磨法，將干菌體放人球磨機(jī)，經(jīng)數(shù)小時(shí)研磨，用水或緩沖液抽提。石磨法是選擇堅(jiān)硬石磨，裝上動(dòng)力研磨。細(xì)菌磨也是在試驗(yàn)室中使用很好方法。(2)機(jī)械搗碎勻漿器和高速組織搗碎器等對(duì)細(xì)胞作機(jī)械破碎。(3)高壓法在堅(jiān)固圓柱體容器內(nèi)裝上菌體與助磨劑，在2-15℃下，于活塞上加壓沖擊，以破碎細(xì)胞。(4)爆破性減壓法將菌體懸浮在N2/CO2高壓下平衡，37℃振蕩數(shù)分鐘，然后突然減壓，使細(xì)胞壁、膜破碎。(5)專用波振蕩專用波振動(dòng)經(jīng)過液體時(shí)形成局部減壓，叫空化作用，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大壓力，從而使細(xì)胞破碎。(6)快速冰凍融化法因?yàn)橥蝗槐鶅?，使胞?nèi)水形成結(jié)晶及胞內(nèi)外濃度突然改變，可使一些細(xì)胞破碎。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第76頁2.2.1.2化學(xué)法(1)滲透作用將指數(shù)生長(zhǎng)久菌體用緩沖液洗凈，并懸于含蔗糖、EDTA稀Tris緩沖液中，待平衡后離心，加入MgCl2猛烈攪拌，可使一些水解酶從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。(2)干燥處理干燥方法可用空氣干燥、真空干燥、冷凍以及脫水干燥。如空氣干燥，普通在25-30℃或高到35-40℃氣流中吹干，然后將干菌體懸浮于3-5倍水中或緩沖液中，室溫?cái)嚢?-3h抽提。(3)自溶向菌體中加醋酸乙酯、甲苯、乙醚及氯仿，使細(xì)胞滲透性改變，保溫一定時(shí)間后，能夠使菌體自溶。(4)溶菌酶處理用溶菌酶專一性地分解菌體細(xì)胞壁上多糖分子β-1,4-糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁。(5)酶處理作用于細(xì)胞壁酶有白細(xì)胞酶、溶菌酶等，用以處理細(xì)胞，使酶釋放出來。⑹表面活性劑處理

膜結(jié)合酶在細(xì)胞破碎后極難溶解下來，常借助表面活性劑來處理。在適當(dāng)pH及離子強(qiáng)度條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，使膜滲透性改變或使之溶解。⑺其它

如當(dāng)細(xì)菌感染噬菌體后，噬菌體附著于菌體細(xì)胞壁，造成菌體自溶等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第77頁2.2.2抽提因?yàn)榇蠖鄶?shù)酶蛋白屬于球蛋白，所以，普通可用稀鹽、稀酸或稀堿水溶液抽提酶。抽提液詳細(xì)組成和抽提條件選擇，取決于酶溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶與其它物質(zhì)連結(jié)。2.2.2.1pH選取pH，首先考慮酶穩(wěn)定性。選取pH不應(yīng)超出酶pH穩(wěn)定范圍。其次，從抽提效果出發(fā)，最好遠(yuǎn)離待抽提酶等電點(diǎn)。也就是說，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在一些情況下，抽提還兼有切斷酶與細(xì)胞內(nèi)其它成份間可能有聯(lián)絡(luò)，從這點(diǎn)出發(fā)，選取pH4-6為佳。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第78頁2.2.2.5其它

在細(xì)胞破碎以后，一些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也受到損傷，常給抽提系統(tǒng)帶來不穩(wěn)定原因，所以有時(shí)還要加入一些物質(zhì)。比如：加入蛋白酶抑制劑,以預(yù)防蛋白酶破壞目標(biāo)酶；為預(yù)防氧化，加入Lys或維生素C、惰性蛋白及底物等。2.2.2.2鹽

大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度鹽溶液中有較大溶解度。所以，抽提液普通采取等滲溶液。最普通為0.020-0.050mol/L磷酸緩沖液、0.15mol/LNaCl等；慣用到還有焦磷酸鈉和檸檬酸鈉緩沖液，有利于切斷酶和其它物質(zhì)聯(lián)絡(luò)；據(jù)報(bào)道，少數(shù)情況下用水抽提亦佳，這可能與低滲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)。2.2.2.3溫度溫度通?？刂圃?-4℃左右。假如酶比較穩(wěn)定，能夠例外，如胃蛋白酶可在37℃保溫抽提。2.2.2.4抽提液用量

抽提液用量常采取原料量1-5倍。有時(shí)，為了抽提效果好些需要重復(fù)抽提時(shí)，抽提溶液百分比可能大些。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第79頁總之，打破細(xì)胞后，溶酶普通不難抽提。至于結(jié)合酶，其中有些和顆粒結(jié)合不太緊，在顆粒結(jié)構(gòu)受損傷時(shí)，抽提也不難。比如：α-酮戊二酸脫氫酶、延胡索酸酶，可用緩沖液抽提出來；CytC可用0.145mol/LTCA溶液抽提出來。那些和顆粒結(jié)合緊密酶，常以脂蛋白絡(luò)合物形式存在，其中有在作成丙酮粉以后，就能夠抽提出，有卻要使用強(qiáng)烈伎倆，如正丁醇等處理。正丁醇兼有高度親脂性和親水性（尤其是磷酸鹽），能破壞蛋白間結(jié)合使酶進(jìn)入溶液，如琥珀酸脫氫酶。近年來，廣泛采取表面活性劑，如膽脂酸鹽、Triton、Tween、Teepol、SDS等，抽提呼吸鏈酶系。鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶抽提，向菌體懸浮液中加入0.1％十二烷基吡啶氯化銨，酶抽出率提升到8倍等（表）。另外，有時(shí)使用促溶劑如高氯酸；有時(shí)還用酶處理，如脂肪酶、核酸酶、蛋白酶等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第80頁表面活性劑對(duì)葡萄糖異構(gòu)酶抽提效果影晌抽提后細(xì)胞殘?jiān)蚬腆w成份可用離心或過濾除去，離心時(shí)，加

入Al(OH)3凝膠或Ca3(PO4)2等物質(zhì)，有利于除去懸浮膠體物質(zhì)。表面活性劑類型釋出酶活力總酶活力釋出(%)無—1.210.611.3十二烷基苯磺酸鈉陰離子2.410.123.8十二烷基醇磺酸鈉陰離子3.811.233.9十六烷基吡啶氯化銨陰離子8.411.970.6十二烷基吡啶氯化銨陽離子10.411.689.7十六烷基甲基溴化銨陽離子9.911.685.9聚氯乙烯非離子型2.910.926.6生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第81頁2.2.3酶溶液凈化與脫色在酶抽提液或發(fā)酵液中常含有細(xì)胞、細(xì)胞碎片等固形物質(zhì)和蛋白質(zhì)、粘多糖、脂類和核酸等大分子物質(zhì)，通常應(yīng)經(jīng)過離心或過濾而凈化。因?yàn)榘l(fā)酵液濃度較大，細(xì)胞顆粒微?。?xì)菌細(xì)胞只有1-l0μm），相對(duì)密度只有1.03，有些細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷與發(fā)酵膠液流動(dòng)電位電荷相互排斥；因?yàn)榧?xì)胞壁外層多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子與水結(jié)合成水化層而形成疏水強(qiáng)穩(wěn)定顆粒，這些在生產(chǎn)上為酶溶液離心或過濾凈化處理帶來困難，通常需要使用絮凝劑后才能凈化。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第82頁材料絮凝處理絮凝結(jié)果堿性蛋白酶發(fā)酵液200ml，pH6.4堿性蛋白酶發(fā)酵液對(duì)照添加0.26%陽離子聚丙烯酰胺(PAM)分子量為200-300萬,終濃度為328-429μl/L,先加25%Al2(SO4)3,終濃度為0.65-0.84%助凝,再加同上PAM先加Al2(SO4)3助凝劑(同上),再加分子量為400-500萬,0.0047%PAM,終濃度為105μl/L先加明礬1.5-2.0%或AlCl3·6H2O1%助凝,再加PAM60μl/L絮凝,加Na2HPO41.5%,CaCl22.5%,pH8.0濾速0.8ml/5min濾速4.5ml/5min濾速29ml/5min濾速24ml/5min比硝酸鹽凝膠濾速高5倍,濾速500L/h細(xì)菌α-淀粉酶1000ml，pH6.9細(xì)菌α-淀粉酶1000ml黑曲霉8471糖化酶發(fā)酵液100ml，pH4.0對(duì)照先加Al2(SO4)325ml,終濃度為0.47%助濾,再加分子量為200萬陽離子PAM(0.13%)300ml,終濃度為294μl/L絮凝,先加堿式氯化鋁1.7%,PAM0.35%(350μl/L)絮凝先加30%堿式氯化鋁4ml,再加分子量為700萬PAM0.2%(終濃度74μl/L)搜集濾液20ml絮凝需23min20ml需35min濾速比磷酸鹽絮凝高1倍,為81.5ml/min濾速為對(duì)照1.7倍,酶活損失<10%賴氨酸發(fā)酵液含固形物2.78%，100mlpH5-6高溫α-淀粉酶pH6.5-7對(duì)照加陽離子PAM(分子量為400萬)1.6ml(終濃度為32μl/L)先加30%堿式氯化鋁2ml,(終濃度為0.36-0.75%),再加分子量為1,140萬陽離子PAM2.5ml(終濃度為20μl/L)上述絮凝液再加1%硅藻土先加Al2(SO4)31%助濾,再加殼聚糖絮凝劑濾速100ml需220min搜集濾液100ml,需60min搜集濾液100ml,需60min濾速提升20倍生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第83頁絮凝劑種類分為無機(jī)、有機(jī)和天然高分子各種。無機(jī)絮凝劑：有些無機(jī)絮凝劑如鉛鹽、鐵鹽等水解后生成氫氧化物凝膠微粒含有吸附作用和電荷作用，產(chǎn)生絮凝下降，有些無機(jī)絮凝劑如醋酸鈣、磷酸鈣等鈣鹽及鋅鹽也含有包圍吸附沉淀作用；有機(jī)絮凝劑：是一些聚合物，多為水溶性直鏈狀大分子，按其鏈上所帶基團(tuán)不一樣而分為陽離子型、陰離子型和非離子型三種，其中以聚丙烯酰胺使用最廣泛，也有用陰離子型和非離子型絮凝劑；天然高分子絮凝劑：主要有殼聚糖，殼聚糖與鈣鹽或鋁鹽可促進(jìn)分離效果。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第84頁有些工業(yè)上用酶還需要脫色。但需考慮：在酶提取分離過程中什么階段進(jìn)行脫色處理，使脫色工作量最少，又不因?yàn)槊撋僮鞫腚s質(zhì)。工業(yè)上慣用脫色劑是活性炭?；钚蕴课缴囟撋??；钚蕴坑昧?、處理時(shí)間、溫度等對(duì)脫色效果和酶回收有影響。另外，不一樣方法制得活性炭吸附能力也不一樣。吸附能力強(qiáng)活性炭，對(duì)酶吸附能力也強(qiáng)。用氯化鋅法制得活性炭，吸附能力強(qiáng)，而水蒸氣法制備活性炭吸附能力弱，但同時(shí)能夠除臭。活性炭用量普通為0.1-1.5％，依據(jù)色素多少而增減。普通因?yàn)榛钚蕴款w粒較小，采取靜態(tài)吸附法進(jìn)行脫色。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第85頁另外，離子交換樹脂也用于脫色。其中，大孔徑樹脂效果很好，但在吸附色素同時(shí)，會(huì)引發(fā)脫色液pH和離子強(qiáng)度改變，必須對(duì)樹脂進(jìn)行緩沖化，使之與酶溶液pH和離子強(qiáng)度一致。采取無離子交換作用專用于脫色樹脂如DuoliteS30、通用1號(hào)等進(jìn)行脫色，對(duì)一些酶液效果很好，通用1號(hào)脫色樹脂在pH5.5以下吸附色素，而在5％堿液中脫出眾素，脫出眾素后用水沖至中性，再用兩倍樹脂體積5％鹽酸溶液處理，最終用水洗至pH5.5以下，可再生利用。在不一樣材料起源酶溶液中加入不一樣脫色劑，能夠降低色素。比如：從植物材料提取酶時(shí)，常加入0.5-1％吡咯烷酮，在枯草桿菌淀粉酶和蛋白酶鹽析時(shí)，加入亞硫酸鹽(Na2SO3、NaHSO3等)，都能夠除去部分色素。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第86頁2.2.4濃縮提取液或發(fā)酵液酶蛋白濃度普通很低，如發(fā)酵液中酶蛋白濃度普通為0.1-1％，所以，在分離純化過程中，酶溶液往往需要濃縮。濃縮方法很多，如鹽析或溶劑沉淀法、超出濾法、離子交換樹脂法等，這些方法既是濃縮方法，又是分離純化伎倆；還有真空濃縮及冷凍濃縮法、蒸發(fā)法、凝膠吸水法、聚乙二醇吸水法等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第87頁依據(jù)溶液相對(duì)純水熔點(diǎn)升高，冰點(diǎn)下降原理，對(duì)少許樣品，一是將溶液凍成冰，然后遲緩溶解，這么冰塊（不含酶）就浮于表面，酶溶解并集中于下層溶液（約為原體積1/4）；二是讓酶溶液慢慢凍結(jié)后移去水結(jié)成冰。這種方法也會(huì)發(fā)生離子強(qiáng)度和pH改變。2.2.4.1冷凍干燥法將酶溶液凍成固體后抽真空，使水分子直接從表面升華，最終酶呈干粉狀。采取這種方法能使各種酶活性長(zhǎng)久保留。但操作需注意幾個(gè)問題：首先被凍最好是酶水溶液，假如混有有機(jī)溶劑，會(huì)降低水冰點(diǎn)，在干燥時(shí)，樣品融化而起泡造成酶變性，同時(shí)，會(huì)使真空泵失效。其次，假如混有磷酸鹽，在冷凍干燥時(shí)會(huì)引發(fā)pH改變，比如pH7磷酸鹽在冷凍時(shí)因?yàn)镹aH2PO4會(huì)結(jié)晶析出，在溶液完全冷凍以前，pH便變成3.5左右。所以，在冷凍前，需將酶溶液脫鹽。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第88頁2.2.4.3超出濾超出濾是在加壓條件下，將酶溶液經(jīng)過一層只允許小分子物質(zhì)選擇透過微孔半透膜，而酶等大分子物質(zhì)被截留，從而到達(dá)濃縮目標(biāo)。假如采取不一樣孔徑膜，同時(shí)又含有分級(jí)分離作用。這種方法含有以下優(yōu)點(diǎn)：不需加熱，更適合用于熱敏物濃縮；無相改變、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便；能在廣泛pH條件下操作等。所以，近年來發(fā)展很快。2.2.4.2蒸發(fā)法通常采取減壓蒸發(fā)法和試驗(yàn)室慣用超蒸發(fā)法，都因效率低、費(fèi)時(shí)等在工業(yè)上極少應(yīng)用。當(dāng)前，工業(yè)上應(yīng)用較多是薄膜蒸發(fā)法。薄膜蒸發(fā)法，即將待濃縮酶溶液在高度真空下轉(zhuǎn)變成極薄液膜，液膜經(jīng)過加熱而急速汽化，經(jīng)旋風(fēng)汽液分離器，將蒸汽分離、冷凝而到達(dá)濃縮目標(biāo)。薄膜蒸發(fā)器有：升膜式、降膜式、刮膜式、離心式等各種，依據(jù)物料不一樣而加以選擇。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第89頁２.2.4.4膠過濾利用SephadexG-250或G-50等吸嘆水膨脹，酶被排阻在膠外面原理而進(jìn)行濃縮。2.2.4.5其它如利用聚乙二醇等濃縮，只適合用于小量樣品。超濾膜主要有以下幾個(gè)類型：(1)平面膜將膜平鋪在多孔支持板上，加壓下（可帶有攪拌）酶溶液從膜面流過，水及小分子溶質(zhì)透過膜孔而排比，大分子溶質(zhì)（如酶）被截留。(2)管式膜將管式膜置于多孔硬管外側(cè)或內(nèi)側(cè)，酶溶液在管內(nèi)或管外流動(dòng)，水和小分子溶質(zhì)透過濾膜，而大分子物質(zhì)被截留而濃縮。(3)中空纖維

將聚砜作成中空膜，成束中空纖維膜裝在圓筒真空超濾器中。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第90頁2.3酶分離純化基本過程在上述濃縮液或發(fā)酵液中，除含有我們需要酶以外，還不可防止地存在著其它大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)，其中小分子物質(zhì)在以后純化步驟中會(huì)自然而然除去。大分子物質(zhì)中包含核酸、粘多糖及其它蛋白質(zhì)。核酸及其相關(guān)蛋白能夠用硫酸魚精蛋白、硫酸鏈霉素、聚乙烯亞胺、三甲基氨十六烷基溴及MnCl2預(yù)先沉淀，離心除去、必要時(shí)，可用核酸酶。依據(jù)不一樣材料選擇不一樣試劑。比如從植物組織中提取乙醇酸氧化酶?？稍谔崛∫褐?.1-0.2％硫酸魚精蛋白、使之與核酸及相關(guān)蛋白形成復(fù)合物而沉淀，然后在4℃采取10,500r/min離心而除去.至于粘多糖，慣用醋酸鉛、乙醇、單寧酸及離子型表面活性刑等處理除去，有時(shí)也用酶除去。余下酶和雜蛋白，所以，酶分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去?，F(xiàn)有酶分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上差異而建立。2.3.1酶分離純化方法選擇生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第91頁酶和雜蛋白性質(zhì)差異大致上可有以下幾個(gè)方面，依據(jù)這些差異，其分離方法可有：(1)依據(jù)分子大小、輕重設(shè)計(jì)方法，如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。(2)依據(jù)溶解度大小分離方法，如鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。(3)按分子所帶正負(fù)電荷多少分離方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。(4)按穩(wěn)定性差異建立分離方法，如選擇性熱變性法表面變性法等。(5)按親和作用差異建立分離方法，如親和層析法等。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第92頁在工作實(shí)踐中選擇方法時(shí)：首先應(yīng)對(duì)被純化酶理化性質(zhì)（如溶解度、分子量大小、穩(wěn)定性和解離時(shí)電學(xué)性質(zhì)等）有一個(gè)比較全方面了解，這么，就能夠知道在分離純化時(shí)能夠選取哪些方法和條件，防止使用哪些方法和條件，從而得到好純化效果；其次，判斷采取方法和條件是否得當(dāng)（判斷標(biāo)準(zhǔn)是酶活性高低），一個(gè)好方法和條件是比活力提升多，總活力回收多，而重復(fù)性好，在純化工作中，往往不宜重復(fù)采取相同步驟和條件，因?yàn)檫@么不能使純度深入提升，而只能使酶總活力下降；再者要嚴(yán)格控制操作條件，伴隨酶逐步純凈，雜蛋白含量亦逐步降低，蛋白質(zhì)之間相互作用力隨之下降，酶更不穩(wěn)定，所以，更要預(yù)防酶變性。生物大分子的制備蛋白質(zhì)酶的分離純化專家講座第93頁在酶分離純化過程中，每步都須做三件事：第一，測(cè)定酶活力(IU/ml)；第二，測(cè)定蛋白質(zhì)含量(mg/ml)；第三，測(cè)量體積(ml)；然后將測(cè)得數(shù)據(jù)加以整理。

2.3.2酶分離純化過程中一些數(shù)據(jù)處理步驟總體積(ml)總蛋白(mg)總活力(IU)比活力(IU/mg)純化倍數(shù)(X)產(chǎn)率(%)1.抽提11036564682.10177.30-2.粗酶10145.547179.84324.401.833.SephadexG-506523.338810.341665.689.404.SPC-504011.436563.453207.3218.105.結(jié)晶-6.2829642.344346.3424.