土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座

一、課題背景1.尿素利用尿素是一個(gè)主要農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH32.常見分解尿素微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，一些真菌和放線菌也能分解尿素。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第1頁[該去哪里取樣?][該配置怎樣培養(yǎng)基?]2、方法：⑴造成有利于目標(biāo)菌株生長環(huán)境⑵同時(shí)抑制大多數(shù)其它類型微生物閱讀P21

篩選菌株1、土壤中取樣。怎樣分離能分解尿素細(xì)菌？土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第2頁15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4①從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基②在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素③此配方培養(yǎng)基為何能夠篩選出產(chǎn)生脲酶細(xì)菌?氮源是尿素，只允許能以尿素作為氮源微生物生長。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第3頁1.利用尿素作為唯一氮源培養(yǎng)基分離出微生物①只是一個(gè)細(xì)菌嗎？②都是能分解尿素微生物嗎？2.請你提供一個(gè)方法，判斷分解尿素細(xì)菌確實(shí)能將尿素分解成氨。4.怎樣證實(shí)此培養(yǎng)基含有選擇性呢？在以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑（P26）土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第4頁以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有沒有選擇性試驗(yàn)組對照組培養(yǎng)基類型是否接種

目標(biāo)

結(jié)果只生長尿素細(xì)菌生長各種微生物（菌落數(shù)顯著多于試驗(yàn)組）是土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第5頁怎樣統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中終究含有多少這么細(xì)菌？計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法比濁法膜過濾法土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第6頁1.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物數(shù)量。此法缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第7頁2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法）⑴原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成，即一個(gè)菌落代表原先一個(gè)單細(xì)胞。⑵慣用方法：稀釋涂布平板法。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第8頁每克樣品中菌落數(shù)＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第9頁某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

培養(yǎng)基中測得平板上菌落數(shù)平均數(shù)為234，那么每克樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液體積為0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第10頁稀釋涂布平板注意事項(xiàng)①為了確保結(jié)果準(zhǔn)確，普通選擇菌落數(shù)在30——300平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為使結(jié)果靠近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上培養(yǎng)皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。③統(tǒng)計(jì)菌落往往比活菌實(shí)際數(shù)目低。關(guān)鍵：恰當(dāng)稀釋度土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第11頁假如106稀釋度下三個(gè)重復(fù)組菌落數(shù)分別為1個(gè)、50個(gè)、170個(gè)。應(yīng)怎樣處理這個(gè)稀釋組數(shù)據(jù)？◆假如得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，假如同一稀釋倍數(shù)三個(gè)重復(fù)菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不準(zhǔn)確，需要重新試驗(yàn)。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第12頁106第一天結(jié)束時(shí)1號培養(yǎng)皿372號培養(yǎng)皿403號培養(yǎng)皿32在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)統(tǒng)計(jì)作為結(jié)果，以預(yù)防因培養(yǎng)時(shí)間不足而造成遺漏菌落數(shù)目。此統(tǒng)計(jì)是否完整？P22統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第13頁A同學(xué)從對應(yīng)106倍稀釋培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落，不過其它同學(xué)在一樣稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落。分析其原因。原因：⑴土樣不一樣，⑵培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其它含氮物質(zhì))怎樣證實(shí)A同學(xué)制作培養(yǎng)基確實(shí)被污染了？怎樣證實(shí)A同學(xué)操作有問題？土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第14頁方案一：由其它同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行試驗(yàn)方案二：將A同學(xué)配制培養(yǎng)基在不加土樣情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對照，以證實(shí)培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測：假如結(jié)果與A同學(xué)一致，則證實(shí)A無誤；假如結(jié)果不一樣，則證實(shí)A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基配制有問題。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第15頁試驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第16頁[一]土壤取樣◆取土樣用小鐵鏟和盛土樣信封滅菌。①準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。還需要8個(gè)滅菌試管和1個(gè)滅菌移液管。

②稀釋相同倍數(shù)菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長菌落數(shù)目應(yīng)顯著多于選擇培養(yǎng)基上數(shù)目，所以，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基能夠作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。[二]制備培養(yǎng)基

土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第17頁◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤哼^程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行◆分離不一樣微生物采取不一樣稀釋度（三）樣品稀釋（四）取樣涂布土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第18頁（五）微生物培養(yǎng)與觀察培養(yǎng)不一樣微生物往往需要不一樣培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃溫度下培養(yǎng)3～4d。土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第19頁某細(xì)菌固體培養(yǎng)基組成成份是KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、葡萄糖、尿素、瓊脂和蒸餾水，其中凝固劑是＿＿＿＿＿＿＿，碳源是＿＿＿＿＿＿＿，氮源是＿＿＿＿＿＿＿。已知只有能合成脲酶細(xì)菌才能在該培養(yǎng)基上生長，故該培養(yǎng)基屬于＿＿＿＿培養(yǎng)基。從同化作用類型上看，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌屬于＿＿＿＿。瓊脂

葡萄糖尿素選擇異養(yǎng)型土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第20頁在微生物群體生長規(guī)律測定中，種內(nèi)斗爭最顯著最激烈時(shí)期是

A．調(diào)整期B．對數(shù)期

C．穩(wěn)定時(shí)D．衰亡期答案：C土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第21頁1.對細(xì)菌群體生長規(guī)律測定正確表述是（）A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B.最少接種一個(gè)細(xì)菌C.接種一個(gè)細(xì)菌D.及時(shí)補(bǔ)充消耗營養(yǎng)物質(zhì)2.使用選擇培養(yǎng)基目標(biāo)是（）A.培養(yǎng)細(xì)菌B.培養(yǎng)真菌C.使需要微生物大量繁殖D.表現(xiàn)某微生物特定性狀與其它微生物加以區(qū)分3.能合成脲酶微生物所需要碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素A

CD土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第22頁4.以下說法不正確是（）A.科學(xué)家從70－80度熱泉中分離到耐高溫TaqDNA聚合酶B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度5個(gè)平板菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)預(yù)計(jì)值C.設(shè)置對照試驗(yàn)主要目標(biāo)是排除試驗(yàn)組中非測試原因?qū)υ囼?yàn)結(jié)果影響，提升試驗(yàn)結(jié)果可信度D.同其它生物環(huán)境相比，土壤中微生物數(shù)量最大，種類最多。B土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第23頁5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入A.較多氮源物質(zhì)B.較多碳源物質(zhì) C.青霉素類藥品D.高濃度食鹽C土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第24頁常見選擇培養(yǎng)方法1、在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)（1）青霉素分離酵母菌和霉菌(2)高濃度食鹽金黃色葡萄球菌2、改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成份（1）缺乏氮源固氮微生物（2）含無機(jī)碳源自養(yǎng)微生物(3)石油作為唯一碳源能消除石油污染微生物3、改變微生物培養(yǎng)條件（1）高溫耐高溫微生物（2）無氧厭氧型、兼性厭氧型土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第25頁課題3分解纖維素微生物分離土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第26頁

是自然界中纖維素含量最高天然產(chǎn)物。1.纖維素與纖維素酶纖維素是地球上含量最豐富

。多糖類物質(zhì)棉花一基礎(chǔ)知識纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶，普通認(rèn)為它最少包含三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素纖維二糖葡萄糖C1酶Cx酶葡萄糖苷酶土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第27頁土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第28頁2.纖維素分解菌篩選①篩選纖維素分解菌方法是_____________。該方法能夠經(jīng)過_______反應(yīng)直接篩選。剛果紅染色法顏色②其原理是：剛果紅能夠與纖維素形成____________，當(dāng)纖維素被__________分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以____________為中心_________，我們能夠經(jīng)過______________來篩選纖維素分解菌。紅色復(fù)合物纖維素酶纖維素分解菌

透明圈是否產(chǎn)生透明圈土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第29頁剛果紅能與哪項(xiàng)物質(zhì)形成紅色復(fù)合物A．纖維二糖B．纖維素

C．葡萄糖D．麥芽糖土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第30頁1.以下關(guān)于纖維素酶說法，錯(cuò)誤是A.纖維素酶是一個(gè)復(fù)合酶，最少包含三種B.纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.纖維素酶可用于去掉植物細(xì)胞壁D.葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖2.利用剛果紅法能夠篩選出纖維素分解菌，以下說法錯(cuò)誤是A.剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物B.剛果紅能與纖維二糖形成紅色復(fù)合物C.剛果紅不能與葡萄糖形成紅色復(fù)合物D.若培養(yǎng)基上產(chǎn)生了透明圈，則說明已篩選出了纖維素分解菌土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第31頁土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈菌落本試驗(yàn)流程與尿素分解菌分離試驗(yàn)流程有哪些異同？土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第32頁選擇培養(yǎng)1.選擇培養(yǎng)目標(biāo)：增加纖維素分解菌濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要微生物2.制備選擇培養(yǎng)基參考書本29頁旁欄a.旁欄中配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為何？b.這個(gè)培養(yǎng)基對微生物是否含有選擇作用？假如含有，是怎樣進(jìn)行選擇？c.你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對照試驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基作用用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照選擇培養(yǎng)時(shí)應(yīng)將錐形瓶固定在A．桌子上B．溫箱里

C．窗臺上D．搖床土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第33頁二、試驗(yàn)操作土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布到判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)生透明圈菌落按照課題1稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)到106參考書本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈菌落，普通即為分解纖維素菌落土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第34頁使用剛果紅染色法時(shí)，加入剛果紅時(shí)機(jī)是：①制備培養(yǎng)基時(shí)

②梯度稀釋時(shí)

③倒平板時(shí)

④涂布時(shí)

⑤培養(yǎng)基上長出菌落時(shí)

A．①③B．②⑤

C．③⑤D．④⑤C土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第35頁練一練1.在富含纖維素環(huán)境中尋找纖維素分解菌，符合以下哪一生物學(xué)觀點(diǎn)？A.生物結(jié)構(gòu)與功效相適應(yīng)觀點(diǎn)B.生物結(jié)構(gòu)與功效整體性觀點(diǎn)C.生物與環(huán)境相適應(yīng)觀點(diǎn)D.生物發(fā)展進(jìn)化觀點(diǎn)C土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第36頁2.從土壤中分離取得某種微生物步驟是①土壤取樣②梯度稀釋③選擇培養(yǎng)④菌懸液涂布平板⑤挑選出單個(gè)菌落A.①②③④⑤B.①③②④⑤C.①②④③⑤D.①④②③⑤B土壤中分解尿素纖維素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)專家講座第37頁3.相關(guān)選擇培養(yǎng)正確敘述是A.能夠增加纖維素分解菌濃度B.能夠降低纖維素分解菌濃度C.所用培養(yǎng)基是固體