微生物遺傳變異和菌種保藏

本章內(nèi)容第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變及修復(fù)第三節(jié)基因重組第四節(jié)微生物育種第五節(jié)菌種衰退、復(fù)壯及保藏

微生物遺傳變異和菌種保藏第1頁(yè)第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)三個(gè)經(jīng)典試驗(yàn)：轉(zhuǎn)化試驗(yàn)噬菌體感染試驗(yàn)植物病毒重建試驗(yàn)微生物遺傳變異和菌種保藏第2頁(yè)試驗(yàn)材料：試驗(yàn)方法：動(dòng)物試驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)S型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)（一）轉(zhuǎn)化試驗(yàn)Griffith（1928）Avery（1944）微生物遺傳變異和菌種保藏第3頁(yè)試驗(yàn)材料：肺炎雙球菌光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無(wú)莢膜菌落粗糙無(wú)毒不致病SⅠSⅡSⅢ三個(gè)血清型RⅠRⅡRⅢ三個(gè)血清型微生物遺傳變異和菌種保藏第4頁(yè)活死死加活R菌或死S菌加活S菌加活R菌和熱死S菌抽血分離活S菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（1）動(dòng)物試驗(yàn)?微生物遺傳變異和菌種保藏第5頁(yè)ＳⅢ〖熱死〗

無(wú)菌落生長(zhǎng)

體外培養(yǎng)

ＲⅡ〖活菌〗

體外培養(yǎng)

ＲⅡ菌落

ＲⅡ菌落多ＳⅢ菌落少

體外混合培養(yǎng)ＳⅢ〖熱死〗

ＲⅡ〖活菌〗

說(shuō)明：加熱殺死S型細(xì)菌中可能存在某種物質(zhì)，能經(jīng)過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)菌。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（2）細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)微生物遺傳變異和菌種保藏第6頁(yè)大量R菌落活R菌S菌無(wú)細(xì)胞抽提液+活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+說(shuō)明：遺傳因子是以DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)（3）S型菌無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)微生物遺傳變異和菌種保藏第7頁(yè)（二）噬菌體感染試驗(yàn)微生物遺傳變異和菌種保藏第8頁(yè)吸附10分鐘后攪動(dòng)離心上清液沉淀離心,分出上清液和沉淀.沉淀細(xì)胞深入培養(yǎng)，產(chǎn)生大量子代噬菌體(30%P32、

1%Ｓ35

）。證實(shí)：在其DNA中，含有包含Pro外殼在內(nèi)整套遺傳物質(zhì)。微生物遺傳變異和菌種保藏第9頁(yè)

植物病毒蛋白質(zhì)和RNA能夠人為地分開(kāi),同時(shí)又可把它們重新組合成具感染性病毒.甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒（三）植物病毒重建試驗(yàn)

TMV:煙草花葉病毒HRV:霍氏車前花葉病毒（RNA)證實(shí)遺傳物質(zhì)是RNA微生物遺傳變異和菌種保藏第10頁(yè)TMVHRVHRVTMV原始株拆開(kāi)重建感染分離純化植物病毒重建試驗(yàn)

微生物遺傳變異和菌種保藏第11頁(yè)第二節(jié)基因突變及修復(fù)一基因突變二DNA損傷修復(fù)微生物遺傳變異和菌種保藏第12頁(yè)一基因突變（一）突變類型（二）突變特點(diǎn)微生物遺傳變異和菌種保藏第13頁(yè)（一）突變類型1堿基改變與遺傳信息改變2表型改變微生物遺傳變異和菌種保藏第14頁(yè)1堿基改變與遺傳信息改變（1）錯(cuò)義突變（missensemutation）：某個(gè)密碼第一個(gè)堿基或第二個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，使編碼某一氨基酸密碼變?yōu)榫幋a另一個(gè)氨基酸密碼。氨基酸置換（2）無(wú)義突變（nonsensemutation）：某個(gè)密碼第一個(gè)堿基或第二、第三個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換或顛換，變?yōu)椴痪幋a任何氨基酸密碼。終止密碼子（UAA,UAG,UGA)。（3）同義突變（samesensemutation）：發(fā)生改變堿基位于密碼第3位，普通編碼同一個(gè)氨基酸。比如簡(jiǎn)并密碼。編碼氨基酸與野生型氨基酸相同。（4）移碼突變（frameshiftmutation）：DNA序列中1-2個(gè)核苷酸缺失或插入，翻譯閱讀框改變，造成氨基酸序列改變。微生物遺傳變異和菌種保藏第15頁(yè)2表型改變（1）營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型（2）抗藥性突變型（3）條件致死突變型（4）形態(tài)突變型微生物遺傳變異和菌種保藏第16頁(yè)（1）營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型(auxotroph)▲因?yàn)榇x障礙成為必須添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)突變株。▲

腺嘌呤突變株Ade-（完全培養(yǎng)基）腺嘌呤野生型菌株Ade+（基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基）。▲營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型是微生物遺傳學(xué)研究中主要選擇標(biāo)識(shí)和育種主要伎倆?！糜坝∑桨暹M(jìn)行分離篩選。微生物遺傳變異和菌種保藏第17頁(yè)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第18頁(yè)（2）抗藥性突變型（resistantmutant)因?yàn)榛蛲蛔兪咕陮?duì)某種或某幾個(gè)藥品，尤其是抗生素，產(chǎn)生抗性一個(gè)突變型。在加有對(duì)應(yīng)抗生素平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)。微生物遺傳變異和菌種保藏第19頁(yè)▲在某一條件下含有致死效應(yīng)，在另一條件下沒(méi)有致死效應(yīng)。▲合成關(guān)鍵性酶基因發(fā)生了突變?！?/p>

如溫度敏感突變ts（42℃致死，25℃~30℃存活）?！糜坝∑桨暹M(jìn)行分離篩選。（3）條件致死突變型（conditionallethalmutant）微生物遺傳變異和菌種保藏第20頁(yè)細(xì)胞形態(tài)突變

菌落形態(tài)突變顏色突變噬菌斑形態(tài)突變（4）形態(tài)突變型（morphologicalmutant）包含微生物遺傳變異和菌種保藏第21頁(yè)（二）突變特點(diǎn)1非對(duì)應(yīng)性：環(huán)境與變異無(wú)對(duì)應(yīng)性。2自發(fā)性：非人為誘變?cè)蛳掳l(fā)生。3規(guī)律性：某一特定性突變率具規(guī)律性。4獨(dú)立性：一個(gè)基因突變對(duì)其它基因突變無(wú)影響。5稀有性：生物自發(fā)突變率為10-6～10-12。6誘變性：誘變劑可提升突變率10~105×。7穩(wěn)定性：突變性狀穩(wěn)定、可遺傳。8可逆性：有回復(fù)突變。微生物遺傳變異和菌種保藏第22頁(yè)二DNA損傷及修復(fù)（自學(xué)）1光復(fù)活作用（Photoreactivation）2切除修復(fù)（ExcisionRepair）3重組修復(fù)（RecombinationRepair）4SOS修復(fù)（SOSRepair）微生物遺傳變異和菌種保藏第23頁(yè)光復(fù)活作用（Photoreactivation）ThymineDimer微生物遺傳變異和菌種保藏第24頁(yè)P(yáng)hotoreactivation光解酶Phr在黑暗中專一地識(shí)別嘧啶二聚體，并與之結(jié)合，形成酶-DNA復(fù)合物，當(dāng)有光時(shí)，酶利用光能將二聚體拆開(kāi)，恢復(fù)原狀，酶再釋放出來(lái)。微生物遺傳變異和菌種保藏第25頁(yè)正?？梢?jiàn)光下光誘導(dǎo)系統(tǒng)修復(fù)。photoreactivationenzyme光裂合酶photolyase烷基轉(zhuǎn)移酶Alkyltransferases切割嘧啶二聚體，分開(kāi)。胸腺嘧啶二聚體光復(fù)活酶可見(jiàn)光光吸收酶釋放光復(fù)活過(guò)程微生物遺傳變異和菌種保藏第26頁(yè)第三節(jié)基因重組一、原核生物基因重組二、真核生物基因重組微生物遺傳變異和菌種保藏第27頁(yè)基因重組§把兩個(gè)不一樣性狀個(gè)體內(nèi)遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)遺傳物質(zhì)重新組合后，形成新遺傳型個(gè)體方式?！旎蛑亟M——分子水平雜交§普通雜交——細(xì)胞水平如：

甲

乙生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高

基因重組

生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高微生物遺傳變異和菌種保藏第28頁(yè)一原核微生物基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)（三）接合(conjugation)微生物遺傳變異和菌種保藏第29頁(yè)（一）轉(zhuǎn)化（transformation)概念——

受體細(xì)胞(receptor)直接吸收來(lái)自供體細(xì)胞(donor)DNA片斷，并把它整合到自己基因組中，細(xì)胞部分遺傳性狀發(fā)生改變現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)化。

1.感受態(tài)2.感受態(tài)因子3.轉(zhuǎn)化因子4.轉(zhuǎn)化特點(diǎn)微生物遺傳變異和菌種保藏第30頁(yè)

（1）感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接收外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化一個(gè)生理狀態(tài)。（2）轉(zhuǎn)化決定原因：不一樣菌株親緣關(guān)系;受體細(xì)胞是否處于感受態(tài)；不一樣菌出現(xiàn)感受態(tài)時(shí)間不一樣。（3）感受態(tài)取得：自然取得；用CaCl2處理細(xì)胞；電穿孔1.感受態(tài)微生物遺傳變異和菌種保藏第31頁(yè)細(xì)菌本身分泌一個(gè)胞外蛋白質(zhì)，分子量為5～10kD。其作用為：（1）催化轉(zhuǎn)化，促進(jìn)外來(lái)DNA片段吸收。（2）可降解細(xì)胞表面某種成份，使DNA受體暴露。

§不一樣菌細(xì)胞DNA受體位點(diǎn)不一樣。

§有菌感受態(tài)因子只對(duì)同種菌起作用。2.感受態(tài)因子微生物遺傳變異和菌種保藏第32頁(yè)3.轉(zhuǎn)化因子（1）

轉(zhuǎn)化因子由供體提供。（2）

普通為線狀或閉合環(huán)狀；單鏈或雙鏈；雙鏈ＤＮＡ有轉(zhuǎn)化能力，單鏈沒(méi)有。（3）

自然情況下可由細(xì)菌細(xì)胞自行裂解產(chǎn)生；試驗(yàn)室里經(jīng)過(guò)提取取得。（4）

轉(zhuǎn)化頻率往往很低，普通為0.1～1%。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式（雙鏈閉合環(huán)狀）轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高。游離ＤＮＡ片斷叫轉(zhuǎn)化因子。微生物遺傳變異和菌種保藏第33頁(yè)4.轉(zhuǎn)化特點(diǎn)不需兩個(gè)細(xì)胞直接接觸，供體DNA提取出來(lái)，注入受體即可。微生物遺傳變異和菌種保藏第34頁(yè)在細(xì)菌感受態(tài)出現(xiàn)時(shí)，含有從周圍環(huán)境吸收DNA分子而不被DNA酶破壞生理特征。處于感受態(tài)細(xì)胞，吸收DNA能力有時(shí)可比普通細(xì)胞大1000倍。微生物遺傳變異和菌種保藏第35頁(yè)微生物遺傳變異和菌種保藏第36頁(yè)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)以溫和噬菌體為媒介，把供體細(xì)胞DNA或RNA片斷轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，從而使后者取得前者部分遺傳性狀。不需要細(xì)胞間直接接觸。但需要媒介。微生物遺傳變異和菌種保藏第37頁(yè)

普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（GeneralizedTransduction）

噬菌體能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體任何部分到受體細(xì)胞中。

局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（SpecializedTransduction）

噬菌體總是攜帶一樣片段到受體細(xì)胞中。微生物遺傳變異和菌種保藏第38頁(yè)結(jié)果10-5頻率出現(xiàn)野生型菌株。（基本培養(yǎng)基）U型管試驗(yàn)：也能出現(xiàn)野生型菌株（基本培養(yǎng)基）在對(duì)鼠傷寒沙門氏菌營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型菌株研究中發(fā)覺(jué)A+B-A-B+A+B+A+B+微生物遺傳變異和菌種保藏第39頁(yè)供體A-B+A+B-多數(shù)受體形成溶源菌A-B+A+B-少數(shù)受體A+B+經(jīng)重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子A:組氨酸B:色氨酸GeneralizedTransduction微生物遺傳變異和菌種保藏第40頁(yè)SpecializedTransduction▲

被轉(zhuǎn)導(dǎo)基因與噬菌體DNA共價(jià)連接，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制包裝以及導(dǎo)入受體細(xì)胞?！?/p>

噬菌體攜帶特殊染色體片段將固定個(gè)別基因?qū)胧荏w。普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限轉(zhuǎn)導(dǎo)不一樣之處：微生物遺傳變異和菌種保藏第41頁(yè)SpecializedTransduction原噬菌體供體DNA受體DNA微生物遺傳變異和菌種保藏第42頁(yè)（三）接合(conjugation)概念：供體細(xì)胞與受體細(xì)胞直接接觸，借性菌毛傳遞大段DNA過(guò)程。在受體細(xì)胞中發(fā)生交換、整合，使之取得供體菌遺傳性狀現(xiàn)象，稱為接合。

經(jīng)過(guò)接合而取得新性狀受體細(xì)胞就稱接合子。微生物遺傳變異和菌種保藏第43頁(yè)+A+B+C-D-A-B-C+D+接合及其發(fā)現(xiàn)（大腸桿菌）A+B+C+D+A:生物素B:甲硫氨酸C:蘇氨酸D:賴氨酸基本培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+微生物遺傳變異和菌種保藏第44頁(yè)Davis（1950）U型管試驗(yàn)兩個(gè)菌株不能直接接觸，只能是培養(yǎng)液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（包含DNA分子）能夠經(jīng)過(guò)。完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基A+B+C-D-A-B-C+D+基本培養(yǎng)基沒(méi)有菌生長(zhǎng)微生物遺傳變異和菌種保藏第45頁(yè)1.F+與F-雜交F+細(xì)菌表面有稱作性菌毛（sexpili）細(xì)長(zhǎng)菌毛，由此與F－細(xì)菌接合，一旦接觸后，菌毛發(fā)生改變，成為兩細(xì)胞間原生質(zhì)通道----細(xì)胞質(zhì)橋或稱結(jié)合管（conjugationtube），F(xiàn)+細(xì)胞F因子經(jīng)過(guò)接合管向F－細(xì)胞轉(zhuǎn)遞：使F－變成F＋，F(xiàn)因子還可改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)，以防F＋細(xì)胞間接合。F+細(xì)菌：含有F因子F-細(xì)菌：不含有F因子F因子就是F質(zhì)粒。微生物遺傳變異和菌種保藏第46頁(yè)滾環(huán)式復(fù)制，σ式微生物遺傳變異和菌種保藏第47頁(yè)微生物遺傳變異和菌種保藏第48頁(yè)2.Hfr×F-雜交Hfr菌形成——

F質(zhì)粒整合到細(xì)菌染色體上。微生物遺傳變異和菌種保藏第49頁(yè)質(zhì)粒和染色體共有插入序列和轉(zhuǎn)座因子。這些轉(zhuǎn)座因子之間同源重組造成質(zhì)粒整合。微生物遺傳變異和菌種保藏第50頁(yè)Hfr×F-雜交結(jié)果仍是Hfr細(xì)胞和F-細(xì)胞。微生物遺傳變異和菌種保藏第51頁(yè)Hfr和F+聯(lián)絡(luò)和區(qū)分

聯(lián)絡(luò)：（1）都是雄性菌，含有F質(zhì)粒。（2）Hfr——F質(zhì)粒與染色體整合。

F+

——

F質(zhì)粒游離在染色體外。區(qū)分：（1）Hfr

F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率低，F(xiàn)+

F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移頻率高；（2）Hfr

F質(zhì)粒整合，F(xiàn)+

F質(zhì)粒游離。微生物遺傳變異和菌種保藏第52頁(yè)3.F’

轉(zhuǎn)導(dǎo)F’

因子攜帶有宿主染色體基因F因子。從Hfr菌中染色體上脫離下來(lái)F質(zhì)粒有時(shí)會(huì)攜帶相鄰染色體基因或DNA片段，稱為F’質(zhì)粒（F’因子），該菌被稱為F’菌。F’因子微生物遺傳變異和菌種保藏第53頁(yè)§給體部分染色體基因隨F’一起轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。基因不需整合就可表示。§利用F’因子形成部分二倍體叫做性導(dǎo)sexduction。F’×F-雜交微生物遺傳變異和菌種保藏第54頁(yè)注意區(qū)分F+菌、Hfr菌、F’

菌不一樣！微生物遺傳變異和菌種保藏第55頁(yè)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合三者根本區(qū)分

在于DNA轉(zhuǎn)移方式不一樣轉(zhuǎn)化：供體DNA片斷→注入受體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜接合：供體進(jìn)入受體經(jīng)過(guò)性菌毛。轉(zhuǎn)導(dǎo)：供體DNA片斷經(jīng)過(guò)媒介－噬菌體攜帶進(jìn)入受體。微生物遺傳變異和菌種保藏第56頁(yè)二真核微生物基因重組（一）有性生殖（二）準(zhǔn)性生殖（parasexualhybridization）（三）酵母菌接合型遺傳微生物遺傳變異和菌種保藏第57頁(yè)（一）有性生殖普通指性細(xì)胞間接合和隨之發(fā)生染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳型后代一個(gè)生殖方式。凡是能產(chǎn)生有性孢子酵母菌或霉菌，標(biāo)準(zhǔn)上都能采取與高等動(dòng)、植物有性生殖相同方法進(jìn)行有性繁殖。一部分真菌減數(shù)分裂發(fā)生在1個(gè)閉合子囊殼中，具較短生活周期，為遺傳重組研究帶來(lái)極大方便。微生物遺傳變異和菌種保藏第58頁(yè)子囊孢子形成過(guò)程粗糙脈胞霉：1個(gè)子囊內(nèi)產(chǎn)生雙倍體核直接減數(shù)分裂后所產(chǎn)生4個(gè)孢子直線排列在子囊內(nèi)（為次序排列四分體），再進(jìn)行一次有絲分裂，產(chǎn)生8個(gè)子囊孢子。AAAAaaaa、aaaaAAAA、AAaaAAaaaaAAaaAA、AAaaaaAA、aaAAAAaa8個(gè)子囊孢子排列：微生物遺傳變異和菌種保藏第59頁(yè)粗糙脈胞霉（面包霉）生活史分生孢子（n）菌絲（n）子實(shí)體核融合合子核(2n)交配型A交配型B減數(shù)分裂I減數(shù)分裂II有絲分裂萌發(fā)(n)子囊孢子（n）微生物遺傳變異和菌種保藏第60頁(yè)粗糙脈胞霉減數(shù)分裂微生物遺傳變異和菌種保藏第61頁(yè)微生物遺傳變異和菌種保藏第62頁(yè)（二）準(zhǔn)性生殖（parasexualreproduction）1.準(zhǔn)性生殖2.準(zhǔn)性生殖意義3.過(guò)程微生物遺傳變異和菌種保藏第63頁(yè)1準(zhǔn)性生殖

同種異株兩個(gè)體細(xì)胞融合，不經(jīng)減數(shù)分裂而造成低頻基因重組發(fā)生一個(gè)繁殖方式。（單倍體體細(xì)胞重組）準(zhǔn)性生殖與有性生殖不一樣：

▲重組體細(xì)胞和普通營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞外形沒(méi)有不一樣，不產(chǎn)生在特殊囊器中?！旧w交換及單倍體化過(guò)程沒(méi)有規(guī)律性。微生物遺傳變異和菌種保藏第64頁(yè)2準(zhǔn)性生殖意義▲對(duì)一些沒(méi)有有性過(guò)程但有主要生產(chǎn)價(jià)值半知菌來(lái)說(shuō)，進(jìn)行基因在染色體上定性研究、雜交育種，準(zhǔn)性生殖提供了一個(gè)主要伎倆?！l(fā)覺(jué)存在于構(gòu)巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放線菌中，使之有普遍意義。微生物遺傳變異和菌種保藏第65頁(yè)3準(zhǔn)性生殖過(guò)程（1）菌絲聯(lián)結(jié)（anastomosis）;（2）形成異核體（heterocaryon）;細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核交流形成異核菌絲體。（3）核配（caryogamy)形成雜合二倍體;特點(diǎn)：頻率低，10-5～10-7

促成：樟腦熏蒸、紫外、高溫。（4）體細(xì)胞交換和單倍體化微生物遺傳變異和菌種保藏第66頁(yè)異核體同時(shí)含有二種或二種以上不一樣基因型核在同一細(xì)胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象又叫異核現(xiàn)象。同核體同一菌絲中只有一個(gè)核。

微生物遺傳變異和菌種保藏第67頁(yè)體細(xì)胞交換和單倍體化

體細(xì)胞交換：

雜合二倍體細(xì)胞中有極少數(shù)細(xì)胞核在進(jìn)行有絲分裂

過(guò)程中，能發(fā)生體細(xì)胞染色體間交換、分離（單倍體化）而產(chǎn)生含有新性狀單倍體雜合子。

單倍體化：

在一系列有絲分裂過(guò)程中一再發(fā)生個(gè)別染色體減半，直至最終形成單倍體過(guò)程。

微生物遺傳變異和菌種保藏第68頁(yè)（三）酵母菌接合型遺傳§酵母菌以單倍體或二倍體狀態(tài)存在?！靻伪扼w：a細(xì)胞或α細(xì)胞，或稱a接合型，α接合型?！於扼w：a細(xì)胞和α細(xì)胞融合形成二倍體細(xì)胞?！旖雍闲瓦z傳：a細(xì)胞α細(xì)胞轉(zhuǎn)變。盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變。微生物遺傳變異和菌種保藏第69頁(yè)開(kāi)啟子緘默狀態(tài)緘默狀態(tài)a基因表示。a型細(xì)胞。盒式機(jī)制轉(zhuǎn)變?cè)谟贛AT活性區(qū)調(diào)控作用微生物遺傳變異和菌種保藏第70頁(yè)第四節(jié)微生物育種一誘變育種營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選三原生質(zhì)體融合微生物遺傳變異和菌種保藏第71頁(yè)一誘變育種1、概念2、誘變劑3.誘變程序4、誘變主要步驟微生物遺傳變異和菌種保藏第72頁(yè)1、概念誘變育種是用物理或化學(xué)誘變劑使誘變對(duì)象內(nèi)遺傳物質(zhì)（DNA）分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引發(fā)性狀變異并經(jīng)過(guò)篩選取得符合要求變異菌株一個(gè)育種方法。微生物遺傳變異和菌種保藏第73頁(yè)2誘變劑（1）概念：凡能提升基因突變頻率理化原因。

（2）種類：

1）物理因子（phisicalagents)

物理誘變劑：U.V、χ、γ、快中子、超聲波等。2）化學(xué)因子(chemicalagents)微生物遺傳變異和菌種保藏第74頁(yè)化學(xué)誘變劑

堿基修飾劑

如：羥胺、氮芥、硫酸二乙酯（DES）、亞硝基胍（NTG）

機(jī)制：對(duì)堿基做修飾，改變堿基配對(duì)性質(zhì)。

堿基類似物

如：疊氮胸腺嘧啶（AIT）、5-溴尿嘧啶（5-UB）、2-氨基嘌呤（2AP）等。

機(jī)制：在DNA復(fù)制時(shí)將堿基類似物插入DNA中，而堿基類似物存在正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)轉(zhuǎn)變，在DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)突變體。微生物遺傳變異和菌種保藏第75頁(yè)

插入劑

(intercalatingagents):

如：溴化乙錠、吖啶橙等一些三環(huán)分子。機(jī)制：在形態(tài)上類似于堿基正確扁平分子。它們插入DNA分子堿基對(duì)之間，使其分開(kāi)，造成DNA在復(fù)制過(guò)程中滑動(dòng)，引發(fā)移碼突變。

微生物遺傳變異和菌種保藏第76頁(yè)與胞嘧啶反應(yīng)，加上羥基（-OH），對(duì)胞嘧啶加以修飾。修飾后胞嘧啶類似胸腺嘧啶T。C—G羥基化胞嘧啶—A誘發(fā)CG到TA轉(zhuǎn)換突變堿基修飾劑----羥胺微生物遺傳變異和菌種保藏第77頁(yè)堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）正常狀態(tài)：類似胸腺嘧啶，與腺嘌呤配對(duì)。

A—5BUA—T下一輪復(fù)制稀有狀態(tài)：類似胞嘧啶，只與鳥(niǎo)嘌呤配對(duì)。

G—5BUG—C下一輪復(fù)制正常狀態(tài)和稀有狀態(tài)能夠相互轉(zhuǎn)換微生物遺傳變異和菌種保藏第78頁(yè)BDNA分子吸收稀有狀態(tài)5BU

G—5BUA—TDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成正常狀態(tài)（G—C）（取代G—C）ADNA分子吸收正常狀態(tài)5BU

A—5BUG—CDNA復(fù)制轉(zhuǎn)換成稀有狀態(tài)（A—T）（取代A—T）堿基類似物——5-溴尿嘧啶（5BU）微生物遺傳變異和菌種保藏第79頁(yè)圖示微生物遺傳變異和菌種保藏第80頁(yè)3誘變程序

原始菌種

原菌種特征判定

純化

斜面/肉湯

培養(yǎng)單孢子/單細(xì)胞懸液

誘變劑處理

計(jì)算存活率

平板分離

觀察形態(tài)變異，挑單菌落

移至斜面

初篩

復(fù)篩

小試

良種保藏

中試微生物遺傳變異和菌種保藏第81頁(yè)4誘變主要步驟（1）誘變劑選擇（2）出發(fā)菌株選擇（3）單孢子或單細(xì)胞懸液制備（4）設(shè)計(jì)和采取效率高篩選方案和方法

微生物遺傳變異和菌種保藏第82頁(yè)（1）誘變劑選擇：

1）了解誘變劑性質(zhì)、作用機(jī)理和使用方法。2）處理方式§單一因子處理：先后使用?！鞆?fù)合因子處理：兩種以上原因同時(shí)使用、單一因子重復(fù)使用。3）處理劑量：測(cè)致死率。方法：平板菌落計(jì)數(shù)法普通殺菌率為70%左右。

微生物遺傳變異和菌種保藏第83頁(yè)（2）出發(fā)菌株：

育種原始菌種應(yīng)具備：

§對(duì)誘變劑敏感性高；

§生產(chǎn)中選育過(guò)自發(fā)變異菌株；

§本身含有一些有利性狀；

§對(duì)代謝產(chǎn)物有一定積累；

§已經(jīng)發(fā)生過(guò)一些變異。微生物遺傳變異和菌種保藏第84頁(yè)（3）單孢子或單細(xì)胞懸液制備

1）必要性：?jiǎn)渭?xì)胞可均勻地接觸誘變劑，防止出現(xiàn)不純菌落——菌種退化。

2）制備：物理誘變劑——生理鹽水（0.85%NaCl)

化學(xué)誘變劑——緩沖液。3）方法：三角瓶?jī)?nèi)加φ0.5cm玻璃珠打散10-15min;加０.3%吐溫80（表面活性劑，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾）。4）濃度：細(xì)菌、放線菌108個(gè)/ml

霉菌、酵母菌106個(gè)/ml

微生物遺傳變異和菌種保藏第85頁(yè)（4）設(shè)計(jì)和采取效率高篩選方案和方法

1）初篩：平板上做定性、半定量測(cè)定，觀察突變株生理效應(yīng)范圍。

方法

§梯度平板法（抗性菌株）

§紙片法（抗性菌株）

§透明圈法（淀粉酶產(chǎn)生菌株等）

§變色圈法（氨基酸生產(chǎn)菌株）2）復(fù)篩：

較準(zhǔn)確生物化學(xué)分析方法—做搖瓶測(cè)定微生物遺傳變異和菌種保藏第86頁(yè)二營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選（一）概念（二）篩選方法（三）應(yīng)用微生物遺傳變異和菌種保藏第87頁(yè)（一）概念1.三種遺傳型個(gè)體2、篩選取培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第88頁(yè)1三種遺傳型個(gè)體（1）營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型（auxotroph）：

經(jīng)誘變產(chǎn)生一些合成能力出現(xiàn)缺點(diǎn)，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入對(duì)應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)變異菌株。如：Lys-;Bio-（2）野生型(wildtype)：

自然界分離到任何微生物，在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)突變前原始菌株，為該微生物野生型。如：Lys+；Bio+（3）原養(yǎng)型(prototroph)：

指auxo突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生菌株，與野生型表型相同。微生物遺傳變異和菌種保藏第89頁(yè)2篩選取培養(yǎng)基1）基本培養(yǎng)基（minimalmedium,MM）[-]：

僅能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求培養(yǎng)基。2）完全培養(yǎng)基（completemedium,CM）[+]：

滿足一切auxotroph生長(zhǎng)天然或半組合培養(yǎng)基。3）補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementedmedium,SM）[x]：

在MM中有針對(duì)性地加入一或幾個(gè)營(yíng)養(yǎng)成份以滿足相應(yīng)auxotroph生長(zhǎng)組合培養(yǎng)基。微生物遺傳變異和菌種保藏第90頁(yè)（二）篩選方法auxotroph篩選程序：篩選普通要經(jīng)過(guò)誘變、淘汰野生型、檢出和判定營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型四個(gè)步驟。

細(xì)菌培養(yǎng)

離心洗滌

誘變處理

在CM上培養(yǎng)

洗滌

MM培養(yǎng)（加青霉素等篩選劑）

涂布于CM平板

影印培養(yǎng)

挑取

判定

菌種保留。微生物遺傳變異和菌種保藏第91頁(yè)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基微生物遺傳變異和菌種保藏第92頁(yè)（三）auxotroph應(yīng)用（1）作為標(biāo)識(shí)菌株：研究代謝、菌種雜交、重組育種和利用基因工程進(jìn)行育種時(shí)帶有特定基因標(biāo)識(shí)親本菌。（2）作為生產(chǎn)菌種：氨基酸、核苷酸等生產(chǎn)菌種；（3）作為氨基酸、維生素、堿基等物質(zhì)生物測(cè)定試驗(yàn)菌種。微生物遺傳變異和菌種保藏第93頁(yè)三原生質(zhì)體融合（protoplastfusion）§使遺傳性狀不一樣兩細(xì)胞原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）過(guò)程?！煲殉晒Φ貞?yīng)用于真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞屬間和科間遠(yuǎn)緣細(xì)胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細(xì)胞基因組。微生物遺傳變異和菌種保藏第94頁(yè)1原生質(zhì)體制備2原生質(zhì)體融合和再生3融合子選擇微生物遺傳變異和菌種保藏第95頁(yè)1原生質(zhì)體制備1）選擇兩個(gè)親本菌株。

細(xì)菌用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蝸牛酶。2）酶處理破壞細(xì)胞壁，使原生質(zhì)流出。制備用培養(yǎng)基：高滲緩沖液或培養(yǎng)基。微生物遺傳變異和菌種保藏第96頁(yè)2原生質(zhì)體融合和再生1）原生質(zhì)體融合

化學(xué)因子誘導(dǎo)：聚乙二醇（polyethyeneglycol，PEG）

并加入Ca2+、Mg2+等陽(yáng)離子電場(chǎng)誘導(dǎo)：電極極化原生質(zhì)體成偶極子，沿電力線排列成串，電流脈沖，原生質(zhì)體膜被擊穿，融合。2）原生質(zhì)體再生

在再生培養(yǎng)基上再生。再生率0.幾%~幾%.微生物遺傳變異和菌種保藏第97頁(yè)3融合子選擇營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型標(biāo)識(shí)選擇依靠在選擇培養(yǎng)基上遺傳標(biāo)識(shí)，有兩個(gè)遺傳標(biāo)識(shí)互補(bǔ)，可確定為融合子?？顾幮詷?biāo)識(shí)。微生物遺傳變異和菌種保藏第98頁(yè)第五節(jié)菌種衰退、復(fù)壯及保藏一、菌種衰退和復(fù)壯

二、菌種保藏微生物遺傳變異和菌種保藏第99頁(yè)一、菌種衰退和復(fù)壯（一）衰退（二）預(yù)防衰退方法（三）菌種復(fù)壯微生物遺傳變異和菌種保藏第100頁(yè)（一）衰退1、概念：菌種經(jīng)長(zhǎng)久人工培養(yǎng)或保藏,在其自發(fā)突變影響下，引發(fā)一些優(yōu)良性狀變?nèi)趸蛳КF(xiàn)象，稱為衰退。2、現(xiàn)象

（1）菌落和細(xì)胞形態(tài)改變；（2）生長(zhǎng)速度遲緩，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；（3）代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；（4）抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。微生物遺傳變異和菌種保藏第101頁(yè)基因負(fù)突變——不利突變

（1）屢次傳代造成負(fù)突變數(shù)量增加

如斜面保藏——

細(xì)菌：1個(gè)月酵母菌：3個(gè)月放線菌、霉菌、芽孢：六個(gè)月

（2）培養(yǎng)條件；

（3）誘變時(shí)出現(xiàn)不純菌落。3、衰退原因微生物遺傳變異和菌種保藏第102頁(yè)（二）預(yù)防衰退方法1、控制傳代次數(shù)；2、選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件；3、采取不一樣類型細(xì)胞進(jìn)行傳代；4、采取有效菌種保藏方法。微生物遺傳變異和菌種保藏第103頁(yè)（三）菌種復(fù)壯1復(fù)壯：使衰退菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀方法。2復(fù)壯方法：

（1）純種分離：菌落純（劃線法、涂布法、傾注法）菌株純（單細(xì)胞挑取法）（2）經(jīng)過(guò)寄主體進(jìn)行復(fù)壯；（3）淘汰已衰退個(gè)體。微生物遺傳變異和菌種保藏第104頁(yè)二、菌種保藏（一）目標(biāo)（二）原理（三）方法微生物遺傳變異和菌種保藏第105頁(yè)（一）