進出口食品中大腸桿菌檢驗方法 谷氨酸脫羧酶法

進出口食品中大腸桿菌檢驗方法谷氨酸脫羧酶法5.2.2培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑見附錄A。5.3儀器設備5.3.1培養(yǎng)箱135℃±1℃。5.3.2高壓滅菌鍋：121℃±1℃。5.3.3離心機；500g(轉速計算方法參見附錄B)。5.3.5均質器；8000r/min。5.3.6冰箱：0℃~4℃;-18℃以下。5.3.8試管：20mm×200mm,15mm×150mm。5.3.9螺帽離心試管：10mL。5.3.10發(fā)酵管：根據(jù)不同樣品選擇不同型號。5.4樣品制備與保存固體或半固體樣品：無菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mL.磷酸緩沖液(PBS)韜釋液的滅菌均質杯內，8000r/min均質1min~2min(也可用滅菌研體研磨代替),制成1110的樣品勻液。干粉樣品：無菌操作稱取25.0g樣品，放入裝有225mLPBS稀釋液和適量玻璃珠的500mL廣口瓶(或三角瓶)中，以30cm探幅，7s探蕩25次(也可機械振蕩30s),制成1110的樣品勻液。液體樣品：用滅菌移液管吸取25mL樣品《吸取樣品時，移液管插入液而下不超過2.5cm,排出液體時不要將移液管插入稀釋液中),放入盛有225mL.PBS稀釋液的500ml.廣口瓶(或三角瓶)中，按上述方法充分探蕩，制成1:10的樣品勻液。用1mL移液管準確吸取1:10的樣品勻液1mL,放入裝有9ml.磷酸緩沖液的試管中，按上述方法充分振蕩，制成1:100的樣品稀釋液(操作時注意移液管不要與裝有稀釋液的容器接觸)。按照上述同樣的方法依次制成10倍系列稻釋液(估計樣品的污染程度并決定樣品的最高稀釋度，應保證接種后最高稀釋度所有試管為陰性),整個操作過程不應超過15min。5.4.2樣品保存若樣品不能及時測定，冷凍樣品應置于一18℃以下冰箱保存；非冷凍易腐食品置于0℃~4℃冰箱保存。測定前，冷凍樣品可于0℃~4℃融化，時間不超過18h,也可在溫度不超過45℃的環(huán)境中融化，時間不超過15min。5.5測定步驟每個樣品至少選擇三個適當?shù)倪B續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯，每管接種1mL(必要時用雙料LST肉湯接種10mL液體樣品或10mL固體樣品勻液)。分別接種一管大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和PBS稀釋液作為陽性、陰性和空白對照。置于35℃±1℃培養(yǎng)20h±2h。取產(chǎn)氣試管中的培養(yǎng)液5mL,轉移到10ml螺帽錐形離心管中，置于離心機中500g離心10min,棄去上清液。用5mL磷酸鹽緩沖液將沉淀物重新懸浮(機械振蕩1min~2min或手搖振蕩至沉淀溶解),500g重復離心一次，棄去上清液。在沉淀物中加入1.0mLGAD反應液，充分器藥混合后置于35℃±1℃培養(yǎng)，4h內觀察反應結果。5.6結果判定和報告5.6.1結果判定GAD反應液在4h內變?yōu)樗{色為判定為陽性反應，其他顏色均判定為陰性反應。5.6.2結果報告記錄4h內的陽性管數(shù)，并對照記錄結果查MPN表(見附錄C),報告每克(或毫升)樣品中大腸桿N=V500×10/1.118×9.0=V496919I=2230(r/min)使用三管法，接種量分別是0.1g(mL)、0,01g(mL),0,001g(mL).00000000111133002032336932002302802302303033333333333333333000120230230注：表內所列檢樣量如改用1g(mL),0.1g(mL)和0.001g(mL)時，表內數(shù)字應相應降低10倍，如改用(mL),0.001g(mL)和0,0001g(mL)時，則表內的數(shù)字應相應增加10倍6 7 8 8 8 9 9 9 9 9 InspectionofEscherichiaco9CorducttotherelatedsectionofStandardSNO33Intheacidanvironment,EscherichiacolipacidinGADreactlonliquidandproduceY-proEnterobacteriacoae),causethechangeofpHinmediuPositivereferenceculture;EschNegativereferenceculture:Kletsiell5.3.3centrifuges:500AnnexAA.1LaurylsulDissolvethecomponentsinthedistilledwater(byDoublethequantityofallcomponentsexceptDistilledwtilledwater(byheatingifnecessary),dispensetheThereagentshouldmixedthoroughlyuntillalltheingredientstobediDipotasslumhydrogenphosphateDistilledwaterDissolvingDipotassiumhydrogenphodrateto7.2,addsterilizedwaterto1000mL.StoreinTransfer1.25mLreservesolutionto1000mLvolumetricbottldistributeintosuitablevesB.1Calculationseeformula(B.1):N-revolvingspeed,theunitisr/min(revo—Rotorradius,lengthfromthecenterofrunnershafttothewallofthecentrifugaltRCF-RelativecentriB.2TherevolvingspeedseeforFarexample:Rotorradiusr=9.0cm,relativecantrifugN=√