入出境船舶壓艙水微生物學(xué)檢測(cè)規(guī)程

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)入出境船舶壓艙水微生物學(xué)檢測(cè)規(guī)程Mierobiologicalexaminationrulesforballastwaterof2007-04-06發(fā)布中，華人民共，和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局本標(biāo)準(zhǔn)附錄A、附錄B,附錄C均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位；中華人民共和國(guó)河北出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人；王海軍、李俊成、張順合、聶維忠、李德昕、王林、黃廷學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)系出入境檢驗(yàn)檢疫首次發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。入出境船舶壓艙水微生物學(xué)檢測(cè)規(guī)程8.2大腸菌群與糞大腸菌群檢測(cè)按GB/T4789,3規(guī)定執(zhí)行。8.5致病性埃希氏大腸桿菌檢測(cè)按GB/T4789.6規(guī)定執(zhí)行。8.6霍亂弧菌檢測(cè)按SN/T1239規(guī)定執(zhí)行。9.1根據(jù)檢測(cè)結(jié)果出具報(bào)告。9.2對(duì)發(fā)現(xiàn)的新菌株和毒株及未能鑒定的菌株送專業(yè)實(shí)驗(yàn)室(資料性附錄)壓艙水集菌和富集病毒方法A.1過濾膜集菌方法濾膜集菌器材主要有；——過濾裝置；——滅菌微孔過濾膜；孔徑0.45pm、膜直徑47mm,具3mm疏水邊緣；——滅菌過濾膜杯；容量100mL,直徑47mmt——滅菌無齒鑷子。A.1.2.1無菌操作取微孔過濾膜平鋪于過濾膜杯底部。將過濾膜杯固定于過濾裝置上。將水樣注入過濾杯中，啟動(dòng)抽濾系統(tǒng)。水樣抽濾完畢，用無齒鑷夾取微孔濾膜邊緣部分，此濾膜可以直接置培養(yǎng)基中培養(yǎng)或增菌液中增菌。能膜直接用于培養(yǎng)時(shí)，截留細(xì)菌面應(yīng)向上，并與培養(yǎng)基面緊貼，兩者間不得留有氣泡。A.2濃集病毒方法A.2.1石英粉抽濾法石英粉抽濾材料主要包括：——水樣20L;—30pm~100pm直徑的石英粉柱：——pH9.00,15mol/L甘氨酸-氧氧化鈉溶液：——聚乙二醇PEG(分子量6000)。A.2.1.2操作步驟用1mol/L鹽酸將海水樣pH調(diào)至3.5.按最終濃度0.0005mol/1.加入0.5mol/L.氯化鋁(30ml.)混勻，靜置30min。用石英粉柱抽濾，速度為101./h。用甘氨酸-氫氧化鈉溶液分3次洗脫。收集洗脫液，置透析袋中用PEG包埋，4C濃縮至6ml.左右，凍存?zhèn)錂z。A.2.2高分子聚合物法高分子聚合物法器材主要有；——分液漏斗：(資料性附錄)甲型肝炎病毒檢測(cè)方法B.1免疫電鏡技術(shù)檢測(cè)甲型肝炎病毒B.1.1材料與試劑材料與試劑包括：——壓艙水濃縮液0.2mL~0.5mL;——抗-HAV血清0.1mL;B.1.2操作步驟B.1.2.1取壓艙水濃縮液0.2ml.,加入抗-HAV血清0.1mL,搖勻，置37℃1h,然后置4℃過夜。B.1.2.2次目取出后，12000r/min離心1,5h,收集沉淀物。B.1.2.3沉淀物用0.1ml.～0.2ml.燕餾水重溶后滴銅網(wǎng)。B.1.2.5電鏡下觀察，凝集成片的27mm大小的病毒顆粒為陽(yáng)性。B.2RT-PCR法檢測(cè)甲型肝炎病毒(HAV)B.2.1材料與試劑材料與試劑包括：——壓艙水濃縮液；——RNA提取試劑盒：——RT-PCR試劑盒：——2%瓊脂糖凝膠；——甲型肝炎病毒檢測(cè)常用的引物為；P;HAV+2020;5'ACAGATATACAAAGTCAG3B.2.2操作步驟B.2.2.1用RNA提取試劑盒提取樣品的總RNA。B.2.2.2用DEPC水10倍系列稀釋至10-,取10°、10-'、10-3做逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)每個(gè)稀釋度各做4個(gè)平行管。B.2.2.3RT-PCR反應(yīng)：RT-PCR反應(yīng)混合液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所做樣品的份數(shù)及試劑盒使用說明書進(jìn)行配制，混勻后再將混合液按要求分入PCR各管內(nèi)，放入PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。B.2.2.4RT-PCR反應(yīng)條件150℃反應(yīng)30min(合成第一鏈cDNA);94C反應(yīng)2min(變性);94C0.5min,52C0.5min,72C1min,33個(gè)循環(huán)：72℃反應(yīng)10min;4℃反應(yīng)1min。B.2.2.5同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。8(資料性附錄)輪狀病毒檢測(cè)方法C.1電鏡檢測(cè)C.1.1材料與試劑材料與試劑包括：——壓艙水濃縮液0.2mL~0.5mL;——銅網(wǎng)(直徑約為2mm~3mm),每網(wǎng)為200目：——支持膜(以0.25%聚乙烯醇縮甲醛膜和0.5%火面膠膜制備銅網(wǎng)上的支持膜，干燥后，噴鍍薄薄一層碳膜，備用):——血清：兔抗RV診斷血清，其效價(jià)1:64(對(duì)流免疫電泳)以上，用時(shí)以生理鹽水作1:20~——染色液：2.5%磷鎢酸。C.1.2操作步驟C.1.2.1取壓艙水濃縮液約0.2mL～0.5mL。C.1.2.2用微量吸液器滴入有支持膜的銅網(wǎng)上，1min~2min后，用濾紙輕輕吸走銅網(wǎng)上的液體。C.1.2.3用染液染1分鐘，吸走多余染液，干燥后電鏡觀察。C.1.2.4干燥后上電鏡觀察。形態(tài)學(xué)平均直徑70nm,在40nm～45nm的六角形核心之外，可以清楚的分辨出一個(gè)呈故射型亞單位構(gòu)成的內(nèi)殼和薄而光滑的外殼為陽(yáng)性。C.2單管半套式RT-PCR法檢測(cè)輪狀病毒(RV)C.2.1材料與試劑材料與試劑包括：——壓艙水濃縮液；——RNA提取試劑盒：——RT-PCR檢測(cè)試劑盒：——1.4%瓊脂糖凝膠；——以輪狀病毒VP7基因的高保守區(qū)段設(shè)計(jì)各血清型通用的引物，堿基序列分別為：P?:5*-GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG-2';P?:5'GTATGGTATTGAATATCAC-3';P:5*-GATCCTGTTGGCCATCC-3';其中，P和P,P,為半套式PCR內(nèi)引物對(duì)，所對(duì)應(yīng)的堿基位置分別為1<28,51～71.376～392。C.2.2操作步驟；C.2.2.1用RNA提取試劑盒提取樣品輪狀病毒的總RNA。C.2.2.2將輪狀病毒RNA模板進(jìn)行梯度稀釋后，分別做RT-PCR和單管半套式RT-PCR擴(kuò)增。C.2.2.3RTPCR的反應(yīng)體系(25pL);2.5pL10×PCRbuffer,200gmol/LdNTP,20URNasin,P、P?各0.3pmol/L,MLV200U,TaqE1.5U,RNA模板2.5pL。C.2.2.4第二步PCR反應(yīng)液加在反應(yīng)管內(nèi)，包括2.5μl.10×PCRbuffer.200gmol/L.的dNTP,P?、C.2.2.5第一步RT-PCR擴(kuò)增條件：50C30min合成第一鏈eDNA;然后94℃變性5min:94C40s,55℃50s,72C40s,循環(huán)30次；72C7min,以確保擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸。C.2.2.6以大于8000g的轉(zhuǎn)速離心15s,使懸浮于反應(yīng)